沈會玲，曾 磊，江 鋒，周常義，蘇國成*

（1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門中集信檢測技術(shù)有限公司，福建 廈門 361021）

近幾年來隨著漁業(yè)的發(fā)展，魚糜制品的產(chǎn)量也逐年提升，深受消費者的青睞，具有廣闊的市場前景。發(fā)酵魚糜制品主要是指在魚糜中加入微生物，經(jīng)發(fā)酵作用使魚糜的蛋白質(zhì)、脂肪或碳水化合物發(fā)生不同變化，形成其特有的風味與口感的食品。

隨著對發(fā)酵魚糜制品的深入研究，學者們不斷探索利用不同菌種與發(fā)酵方式提高發(fā)酵魚糜的質(zhì)量[1-2]。KASANKALA L等[3]研究了豆豉發(fā)酵劑對發(fā)酵魚醬的營養(yǎng)價值的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過豆豉發(fā)酵劑發(fā)酵的魚糜營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)都顯著提高。趙培城等[4]采用紹興腐乳毛霉對低值海產(chǎn)魚糜固態(tài)發(fā)酵，制成與豆腐乳形態(tài)相似、口感細膩的魚糜腐乳；王乃富等[5]用紅曲霉對鳙魚肉糜進行發(fā)酵，經(jīng)過發(fā)酵魚糜的色澤和營養(yǎng)價值都得到改善，同時增強了魚糜的生物活性；周緒霞等[6]在用真菌發(fā)酵前先對魚糜進行蒸汽加熱20 min，形成凝膠后進行固態(tài)發(fā)酵。

本研究利用總狀毛霉和紅曲霉F1對魚豆腐進行發(fā)酵研制魚腐乳，采用響應面法優(yōu)化魚腐乳前期發(fā)酵工藝，并對發(fā)酵過程中魚腐乳的蛋白質(zhì)降解、質(zhì)構(gòu)和色澤的變化進行分析，旨在為開發(fā)魚腐乳產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FA級魚糜：福建晉江閩南水產(chǎn)開發(fā)有限公司；總狀毛霉（Mucor racemosus）：百惠生物科技有限公司。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、福林試劑、鹽酸、三氯乙酸、碳酸鈉（均為分析純）：國藥集團；酪蛋白標準品（純度99.8%）、L-酪氨酸標準品（純度99%）；食鹽、淀粉、均為市售食品級。

1.2 儀器與設備

MiniP-4電泳儀：北京凱元信瑞儀器有限公司；3-30 K冷凍離心機：德國SIGMA公司；FD-1-50真空冷凍干燥器：北京博醫(yī)康儀器公司；UV-2000紫外分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京國華科技集團有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚腐乳白坯的制作

冷凍魚糜在4℃冰箱解凍后，將水分調(diào)整為80%，空擂5 min，加入魚漿質(zhì)量3%的NaCl后再鹽擂10 min，加入10%玉米淀粉，繼續(xù)擂潰10 min，將擂潰好的樣品裝入方形鋼圈，兩端密封，采用二段式加熱的方式對魚糜進行加熱，低溫加熱成型（45℃、1 h），高溫加熱（95℃、20 min）。然后用冰水迅速冷卻，放入冰箱平衡24 h備用。

1.3.2 魚腐乳發(fā)酵工藝

參照馬立安等[7]制作腐乳毛坯的方法，將制備好的魚豆腐均勻的擺放在經(jīng)紫外消毒后的塑料盒內(nèi)，中間留有空隙，將配制好的5×107個/mL毛霉菌菌懸液以5.3%的接種量均勻的噴灑在魚豆腐的表面，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔1 d取樣備用。

1.3.3 蛋白酶的提取及活性測定

將取出的樣品置于-70℃條件下預凍12 h，真空冷凍干燥處理后粉碎機粉碎，過60目篩，置于干燥器中儲存，備用。稱取1 g樣品于離心管中，加入10 mL磷酸鹽緩沖液，混勻，40℃水浴超聲提取1 h，再經(jīng)冷凍離心機8 000 r/min離心10 min，取上清液進行分析檢測。蛋白酶活力的測定方法參照國標GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[8]。蛋白酶活力定義是指在一定的溫度或pH條件下，1g樣品每分鐘催化水解酪蛋白所產(chǎn)生的酪氨酸的微克數(shù)為一個酶活力單位（U/g）。

1.3.4 魚腐乳發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的測定

參照GB/T 5009.235—2016[9《]食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的方法進行測定。

1.3.5 魚豆腐前發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)降解的分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析前發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)變化的研究，配制10%的分離膠，5%的濃縮膠，將樣品最終蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為2 mg/mL，上樣量為10 μL，R250考馬斯亮藍染色12 h，脫色4 h。

1.3.6 魚腐乳前發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗及響應面試驗

（1）單因素試驗

將濃度為5×107個/mL菌懸液以5%的接種量噴灑于魚豆腐表面，置于27℃培養(yǎng)箱，發(fā)酵時間分別為48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，將濃度為5×107個/mL菌懸液以5%的接種量噴灑于魚豆腐表面，分別置于23℃、25℃、27℃、29℃、31℃，將濃度為5×107個/mL菌懸液分別以3%、4%、5%、6%、7%的接種量噴灑于魚豆腐表面，置于27℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)96 h。按1.3.2工藝流程制作魚腐乳毛坯，分別考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、菌懸液接種量對魚腐乳前期發(fā)酵蛋白酶活的影響。

（2）響應面試驗

對發(fā)酵前期條件進行優(yōu)化，以發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、霉菌菌懸液的接種量（C）為試驗因素，蛋白酶活力（Y）為評價指標進行響應面試驗，因素與水平如表1所示。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methododogy for fermentation conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腐乳前發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮可以快速檢測食品中蛋白質(zhì)的水解程度[10]，主要包括氨基酸、水溶性蛋白以及多肽類物質(zhì)，對產(chǎn)品的風味有一定的影響。從圖1可以看出，在前期發(fā)酵過程中，氨基酸態(tài)氮的含量呈明顯升高的趨勢，在魚豆腐白坯中，氨基酸態(tài)氮含量較低，含量僅為0.01%，而在前期發(fā)酵至第4天時，氨基酸態(tài)氮含量上升至0.23%，說明在前期發(fā)酵的過程中蛋白質(zhì)發(fā)生降解，毛霉在生長代謝的過程中產(chǎn)生了大量的蛋白酶，而且有研究發(fā)現(xiàn)，毛霉分泌的蛋白酶大多數(shù)為酸性蛋白酶[11]，對于酸性物質(zhì)的測定中發(fā)現(xiàn)，前期發(fā)酵過程中酸度逐漸升高，有利于蛋白酶活性的提升，蛋白酶會作用于大分子蛋白，蛋白質(zhì)被逐漸降解為小分子肽和氨基酸。

圖1 魚腐乳前發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.1 Changes of amino acid nitrogen content of fish sufu during pre-fermentation

2.2 魚豆腐發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)降解的電泳分析

魚腐乳前期發(fā)酵過程中SDS-PAGE電泳圖結(jié)果見圖2。由圖2可知，在魚糜和魚腐乳白坯中可以清楚的看到很多大分子蛋白的條帶，而在發(fā)酵至第48小時，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）和肌動蛋白（actin）等大分子條帶明顯減弱，30～40 kDa的條帶有加深，說明部分大分子蛋白降解為小分子，發(fā)酵至96 h，大分子條帶基本看不到。隨著發(fā)酵時間的延長，高分子蛋白片段（high molecular weight protein fractions，HMWF）逐漸減弱，而最下層的小分子條帶逐漸加深，說明發(fā)酵的過程中，大部分蛋白質(zhì)被降解為小分子肽，主要是因為在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)會被蛋白酶迅速水解。GIRI A等[12]在發(fā)酵魚醬的研究中也發(fā)現(xiàn)類似這一現(xiàn)象。IRIANTO H E等[1，13]的研究也表明魚肉或魚糜在發(fā)酵過程中經(jīng)多種酶（內(nèi)源蛋白酶、外源性微生物蛋白酶）對魚肉蛋白的作用，使其分解為小分子的肽或是氨基酸。經(jīng)過發(fā)酵，蛋白質(zhì)被分解為氨基酸和多肽，更有利于人體的消化吸收[14]。

圖2 不同前發(fā)酵時間魚腐乳的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of fish sufu with different pre-fermentation time

2.3 魚腐乳前發(fā)酵過程中單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1 發(fā)酵時間對蛋白酶活力的影響

毛霉在生長過程中會釋放一些以蛋白酶為主的酶系[15]，對腐乳風味的形成有重要的作用。由圖3可知，前發(fā)酵時間處于60～96 h階段，魚腐乳蛋白酶活力逐漸增加，發(fā)酵至96 h時，蛋白酶活力達到最大值，之后蛋白酶活力逐漸降低，隨著發(fā)酵時間的延長，毛霉的菌絲體逐漸老化，影響了蛋白酶的分泌。因此前期的發(fā)酵時間應控制在96 h為宜。

圖3 發(fā)酵時間對蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation time on protease activity

2.3.2 發(fā)酵溫度對蛋白酶活力的影響

由圖4可知，前期發(fā)酵溫度23～27℃時，蛋白酶活力逐漸增大，在這個溫度范圍，隨著溫度的升高，促進了毛霉的生長代謝和蛋白酶的產(chǎn)生，當培養(yǎng)溫度升至27℃時，蛋白酶活力達到最大值；溫度繼續(xù)升高，蛋白酶活力開始呈下降趨勢，可能是因為溫度過高，一方面影響了毛霉的生長代謝，另一方面加劇了菌絲體的老化。因此魚豆腐前期發(fā)酵的溫度控制在27℃為宜。

圖4 發(fā)酵溫度對蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on protease activity

2.3.3 菌懸液接種量對蛋白酶活力的影響

由圖5可知，當菌懸液的接種量＜5%的時候，魚腐乳毛坯的蛋白酶活力隨著菌懸液接種量的增大而增大，當接種量達到5%時，蛋白酶活力達到最大值。菌懸液接種量繼續(xù)增大蛋白酶活力開始降低，隨后保持不變，可能是因為菌懸液接種量增大帶來孢子量增加的同時，在代謝過程中會消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，而且會破壞毛霉的生長環(huán)境，造成菌絲體的老化，從而導致蛋白酶的活力逐漸降低。因此毛霉菌懸液的接種量應控制在5%左右為宜。

圖5 接種量對蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum on protease activity

2.4 魚腐乳前期發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗結(jié)果與分析

2.4.1 魚腐乳前期發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗結(jié)果與分析

采用響應面試驗，以蛋白酶活力（R1）為響應值，以發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、菌懸液接種量（C）進行前發(fā)酵優(yōu)化，響應面試驗設計結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.0001），因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.993 8），模型調(diào)整的復相關(guān)系數(shù)為（R2Adj=0.985 8），說明該模型能解釋98.58%的響應值變化，擬合程度極好，失擬項不顯著（P＞0.05），對模型是有利的，無失擬因素存在。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示實驗的精確程度，本實驗的CV=2.71%，在接受范圍內(nèi)。表明相應曲面的擬合程度好，能夠精確的預測實際情況。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methododogy for fermentation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

以發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、菌懸液接種量（C）為自變量，蛋白酶活力（Y）為因變量，建立回歸模型。前發(fā)酵工藝優(yōu)化回歸方程為：

2.4.2 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件曲面圖結(jié)果分析

圖6 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及接種量對魚腐乳前發(fā)酵蛋白酶活力影響的響應面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and inoculum on the activity protease of pre-fermentation of fish sufu

由圖6A可以看出，當菌懸液接種量在5%時，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間對魚豆腐前期發(fā)酵的蛋白酶活力產(chǎn)生交互影響，當發(fā)酵時間較短時，蛋白酶活力較低，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白酶活力逐漸升高，當發(fā)酵溫度繼續(xù)升高時，蛋白酶活力較高，兩者的交互作用并不顯著（P=0.6972＞0.05）。

由圖6B可以看出，當發(fā)酵溫度為27℃，當菌懸液接種量偏高時，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白酶活性逐漸升高，并達到最大值。當發(fā)酵時間繼續(xù)增大時，隨著菌懸液接種量增大，蛋白酶活力逐漸升高。兩者的交互作用不顯著（P=0.184 1＞0.05）。

由圖6C可以看出，蛋白酶活力隨著發(fā)酵溫度的升高，先升高，隨后又逐漸降低，隨著菌懸液接種量增大，蛋白酶活力逐漸升高，并達到最大值，兩者之間的交互作用顯著（P=0.019 5＜0.05）。

響應面方法的圖形是響應值Y與對應的因素A、B、C構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，每一個響應面圖對其中2個因素進行分析，另外一個因素固定在零水平，從圖中可以直觀的反映出各因素對響應值的影響，結(jié)合上述各項參數(shù)、三維響應曲面圖和等高圖，運用Design Expert 8.0分析計算找出魚豆腐前期發(fā)酵條件的最佳點。根據(jù)蛋白酶活力回歸方程，最佳點的值分別為發(fā)酵時間103.12 h，發(fā)酵溫度27.09℃，菌懸液接種量5.25%，理論蛋白酶活力為53.79 U/g。根據(jù)實際生產(chǎn)需要，將發(fā)酵條件取值為發(fā)酵時間103 h，發(fā)酵溫度27℃，菌懸液接種量5.3%，經(jīng)驗證試驗，該優(yōu)化工藝條件下蛋白酶活力為51.48 U/g。

3 結(jié)論

本研究采用總狀毛霉，對魚腐乳進行前期發(fā)酵，發(fā)酵至第4天，氨基酸態(tài)氮含量升高至0.23%，大部分大分子蛋白降解為小分子。以蛋白酶活力為指標，通過單因素和響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵魚腐乳的前發(fā)酵條件，得到魚腐乳的前發(fā)酵最佳條件為發(fā)酵時間103 h，發(fā)酵溫度27℃，毛霉菌懸液接種量5.3%，此時的蛋白酶活力為51.48 U/g。形成的酶系為后期發(fā)酵的一系列生化反應奠定了良好的基礎(chǔ)，有利于提高魚腐乳的品質(zhì)，豐富魚腐乳的風味。

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