張 瑤，白 娟，汪雪瑞，王承明*

（華中農業(yè)大學 食品科學技術學院 環(huán)境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

鲊肉粉是一種廣受人們喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，最早可溯源至先秦時期，在我國已經有兩千多年的食用歷史。傳統(tǒng)鲊肉粉是以新鮮豬肉、米粉和紅辣椒為主要原料經自然發(fā)酵而成。熟制后的成品具有適宜的口感和誘人的色澤，同時具有較長的貨架期，能極大地延長產品的可食用期限。到目前為止，對其他發(fā)酵食品如豆豉[1-2]、豆瓣[3-5]、酸魚[6-8]、發(fā)酵香腸[9]等中微生物的研究有大量文獻報道，但對于鲊肉粉中細菌多樣性的研究未見有文獻報道。

對于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中細菌多樣性的研究方法包括傳統(tǒng)的純培養(yǎng)法和現(xiàn)代分子生物學的方法[10]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法因培養(yǎng)條件的限制，目前能進行培養(yǎng)的微生物不到1%，且培養(yǎng)過程易導致原始菌群構成發(fā)生改變，使結果有較大偏差[11-12]?，F(xiàn)代分子生物學技術包括聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturingdradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術[13]、高通量測序技術等[14]。其中，DGGE技術因其無法檢測豐度較低的微生物而具有一定的局限性[15]。隨著高通量測序技術的發(fā)展，宏基因組學技術越來越多地被應用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的研究[16-20]。通過對發(fā)酵制品中微生物的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）進行分析，宏基因組學技術不僅能檢測出低豐度的微生物，而且速度快，結果準確[21-22]。因此，本實驗在前期對鲊肉粉的加工工藝進行研究的基礎上，采用宏基因組學技術對鲊肉粉發(fā)酵過程中細菌的組成及相對豐度進行研究，探索其發(fā)酵過程中細菌群落的動態(tài)變化，為后期深入解析鲊肉粉的發(fā)酵機理及對發(fā)酵過程的監(jiān)控奠定重要的理論基礎，同時可以為鲊肉粉的發(fā)酵過程設計相應的高效發(fā)酵劑，有利于鲊肉粉的工業(yè)化生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米：湖北省監(jiān)利縣興旺米業(yè)有限公司；新鮮豬肉、紅辣椒、生姜、大蒜：市售；食鹽：湖北藍天鹽化有限公司；脫氧核糖核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTPs）Mix、5×TransStartTM、FastPfuBuffer和Fast Pfu Fly DNAPolymerase：北京全式金生物技術有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit：德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

BS 224S分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Miseq高通量測序平臺：美國Illumina公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；UVPCDS 8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 鲊肉粉的加工工藝流程及操作要點

1.3.2 樣品的制備

按照鲊肉粉的生產工藝流程[23]制備鲊肉粉樣品。按GB/T 9695.19—2008《肉與肉制品取樣方法》進行取樣，取樣后經組織破碎機破碎混勻后裝入無菌采樣管中，置于-80℃的超低溫冰箱中保存，直至所有樣品采集完成。試驗中共采集了11組發(fā)酵時期的樣品，鲊肉粉樣品編號分別為：0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d和20 d。

1.3.3 宏基因組DNA的提取

按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒的說明書步驟對鲊肉粉樣品的宏基因組DNA進行提取，并通過微量紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

1.3.4 細菌16S rRNA擴增

PCR擴增體系：5×PCR緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mix 2 μL，5 μmol/L 正向引物0.8 μL，5 μmol/L 反向引物0.8 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，體系用ddH2O補充至20 μL。細菌16S rRNA的正向引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），反向引物為806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。

PCR擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.3.5 樣品平衡及Miseq高通量測序

行為異常組在矛盾性和獨立性維度的得分明顯高于正常組（P＜0．05），而在親密度、情感表達、知識性、娛樂性、道德宗教觀、組織性及控制性維度的得分則明顯低于正常組（P＜0．05）。見表1。

經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格的PCR擴增產物稀釋至100 nmol/L，混勻后送至上海美吉生物科技有限公司，使用Miseq平臺進行高通量測序。

1.3.6 數(shù)據分析

根據序列間的重疊關系對序列進行質控，然后使用微生物生態(tài)學定量分析（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）平臺進行物種和多樣性的分析，基于UniFrac距離進行主坐標分析，根據97%的相似性使用UCLUST軟件進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 宏基因組DNA的提取及PCR擴增

鮮肉粉中微生物宏基因組DNA及PCR擴增產物電泳檢驗結果分別見圖1。由圖1A可知，電泳條帶存在彌散拖尾現(xiàn)象，這是因為宏基因組DNA中包含有大量的微生物基因組片段[24]。由圖1B可知，PCR產物目的條帶大小正確，濃度合適，可進行后續(xù)實驗。

圖1 鲊肉粉中微生物宏基因組DNA(A)及PCR擴增產物(B)電泳圖Fig.1 Electrophoresis of metagenomic DNA(A)and PCR amplification products(B)from fermented meat rice

2.2 鲊肉粉中細菌多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線及香農指數(shù)

稀釋曲線是用于評價測序深度是否足夠覆蓋所有的類群，同時間接反映出樣品中物種的豐富程度[25]。當曲線趨于平坦或達到平臺期時就可認為測序深度已經基本覆蓋到樣品中的所有物種[26-27]；反之，則表示樣品中物種的多樣性較高，還存在許多未被檢測到的物種。香農指數(shù)圖是利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構建的曲線，用于反映各樣品在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。當曲線趨于平緩時，說明測序數(shù)量足夠大，可以反映樣品中大多數(shù)的微生物物種信息[28]。鲊肉粉中細菌群落的稀釋曲線及香農指數(shù)結果見圖2。

圖2 鲊肉粉中細菌群落的稀釋曲線(A)和香農指數(shù)(B)Fig.2 Rarefaction curve(A)and Shannon index(B)of bacterial community from fermented meat rice

由圖2（A）可知，隨著測序深度的增加，發(fā)現(xiàn)物種的數(shù)量繼續(xù)增加，說明隨著測序量的增加可能會有新的種型被發(fā)現(xiàn)。由圖2（B）可知，隨著測序深度的增加，香農指數(shù)曲線已基本達到平衡狀態(tài)，說明在此測序水平下，樣品中細菌的多樣性已能充分展現(xiàn)。

2.2.2 α多樣性分析

α多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性[29]，常用的度量指標有Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，不同發(fā)酵時間鲊肉粉樣品的α多樣性統(tǒng)計結果如表1所示。

Chao1指數(shù)是用于評估樣品中細菌群落的OTU數(shù)目的，Chao1指數(shù)值越大表明樣品中細菌的總數(shù)越多；Shannon用于評估樣品中微生物的多樣性，Shannon指數(shù)值越大，表明樣品中細菌群落的多樣性越高；Simpson指數(shù)也是用于評估樣品中微生物多樣性的指數(shù)，Simpson指數(shù)越大表明細菌多樣性越高。由表1可知，本研究產出的序列已經能全面捕獲樣品中細菌微生物的多樣性，因而是滿足后續(xù)分子生物學分析的[30]。2.2.3β多樣性分析

表1 鲊肉粉樣品的α多樣性統(tǒng)計Table 1 Alpha diversity statistics of fermented meat rice

β多樣性是用于度量時空尺度上物種組成的變化[31]。其中，主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種研究數(shù)據相似性或差異性的可視化方法，通過主成分分析可以直觀反映出個體或群體間的差異，一個點表示一個樣品，兩點間的距離越近表示兩者的菌落構成越相近[32-33]。通過數(shù)字化的矩陣對鲊肉粉的微生物多樣性進行了主成分分析，結果如圖3所示。

圖3 鲊肉粉發(fā)酵過程中細菌群落的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of bacterial community from fermented meat rice

由圖3可知，在PC1方向上，鲊肉粉發(fā)酵0～6 d樣品都聚集在負軸，其中發(fā)酵0天即未發(fā)酵的鲊肉粉樣品在第二象限；2～6 d樣品聚集在一起，在第三象限。8～20 d樣品都聚集在正軸；在PC2方向上，2～10d樣品聚集在負軸，其中，發(fā)酵8 d和發(fā)酵10 d的樣品在第四象限，0 d樣品和12～20 d樣品也聚集在一起，12～20 d樣品在第一象限。因此，可以按所在象限不同將鲊肉粉的發(fā)酵過程劃分為三個階段，依次為2～6 d的主發(fā)酵期、8～10 d的發(fā)酵后期和12～20 d的后熟期。

2.3 鲊肉粉中優(yōu)勢細菌科、屬相對含量的比較分析

本實驗運用宏基因組學技術，通過對鲊肉粉發(fā)酵過程中細菌的16S rRNA進行測定，實現(xiàn)了對鲊肉粉發(fā)酵過程中細菌群落組成及相對豐度的研究。結果表明，鲊肉粉發(fā)酵過程中共檢出有19個門、47個綱、75個目、106個科、153個屬和211個種的細菌參與鲊肉粉的發(fā)酵過程。在門水平上，厚壁菌門Firmicutes（69.02%）和變形菌門Proteobacteria（5.02%）為主要細菌門。厚壁菌門中芽孢桿菌綱Bacilli占有絕大多數(shù)（69.00%），而變形菌門中的主要細菌綱有Gammaproteobacteria（4.64%）、變形菌綱Alphaproteobacteria（0.37%）和Betaproteobacteria（0.01%）。

圖4 鲊肉粉中優(yōu)勢細菌科相對含量的比較分析Fig.4 Comparative analysis on the relative content of the dominantbacteria family in fermented meat rice

由圖4可知，在鲊肉粉的發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢細菌科為葡萄球菌科Staphylococcaceae（35.81%）、明串珠菌科Leuconostocaceae（19.76%）、乳桿菌科Lactobacillaceae（7.66%）等，其中明串珠菌科細菌的相對含量在發(fā)酵開始后迅速增加，乳桿菌科細菌的相對含量在發(fā)酵后有所增加。

圖5 鲊肉粉中優(yōu)勢細菌屬相對含量的比較分析Fig.5 Comparative analysis on the relative content of the dominant bacteria genera in fermented meat rice

由圖5可知，在鲊肉粉的發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢細菌屬為葡萄球菌屬Staphylococcus（34.92%）、魏斯氏菌屬Weissella（19.68%）、乳酸桿菌屬Lactobacillus（7.62%）、不動桿菌屬Acinetobacter（2.24%）、環(huán)絲菌屬Brochothrix（2.24%）、發(fā)光桿菌屬Photobacterium（1.67%）和巨球菌屬Macrococcus（1.24%）。其中，葡萄球菌在鲊肉粉的發(fā)酵過程中可以分解蛋白質和脂肪，對鲊肉粉的營養(yǎng)和風味具有重要的作用[34]；魏斯氏菌具有提高發(fā)酵食品質量縮短發(fā)酵周期等作用[35]；乳酸桿菌能還原亞硝酸鹽，減少亞硝胺的生成，抑制腐敗微生物的生長，提高鲊肉粉的營養(yǎng)安全性[36]。在鲊肉粉的發(fā)酵過程中，不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬和發(fā)光桿菌屬的相對含量在發(fā)酵開始后迅速降低，而魏斯氏菌屬的相對含量在發(fā)酵開始后迅速升高，這與關統(tǒng)偉等[37]的結果相似。相關性分析表明，魏斯氏菌屬細菌與不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬和發(fā)光桿菌屬細菌間都存在顯著的負相關關系，而不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬和發(fā)光桿菌屬細菌之間均存在顯著的正相關關系，間接表明不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬和發(fā)光桿菌屬細菌之間存在某種互利共生的關系，而魏斯氏菌屬細菌對不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬和發(fā)光桿菌屬細菌均有一定的抑制作用。

3 結論

本實驗運用宏基因組學技術，通過對鲊肉粉中細菌16S rRNA高通量測序，對鲊肉粉發(fā)酵過程中細菌群落組成及相對豐度進行了研究。結果表明，鲊肉粉發(fā)酵過程中共有19個門、47個綱、75個目、106個科、153個屬和211個種的細菌參與動態(tài)變化。該過程的優(yōu)勢細菌屬分別為葡萄球菌屬Staphylococcus（34.92%）、魏斯氏菌屬Weissella（19.68%）、乳酸桿菌屬Lactobacillus（7.62%）、不動桿菌屬Acinetobacter（2.24%）、環(huán)絲菌屬Brochothrix（2.24%）、發(fā)光桿菌屬Photobacterium（1.67%）和巨球菌屬Macrococcus（1.24%）。其中不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬和發(fā)光桿菌屬細菌的相對含量在發(fā)酵開始后迅速降低，而魏斯氏菌屬細菌的相對含量在發(fā)酵開始后迅速升高，乳酸桿菌屬細菌的相對含量在發(fā)酵后有所增加。相關性分析表明，不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬和發(fā)光桿菌屬細菌間存在互利共生關系，而魏斯氏菌屬對不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬和發(fā)光桿菌屬細菌均有一定的抑制作用，魏斯氏菌屬和乳酸桿菌屬細菌有利于發(fā)酵的進行，并對腐敗菌有一定的抑制作用，從而提高了產品的營養(yǎng)和安全性。通過本實驗可以更加深入地理解鲊肉粉的發(fā)酵機制，同時可以為鲊肉粉的發(fā)酵過程設計相應的高效發(fā)酵劑，有利于鲊肉粉的工業(yè)化生產。

[1]陳廷濤.發(fā)酵乳和豆豉中微生物菌群DGGE分析及益生作用研究[D].南昌：南昌大學，2013.

[2]林榕姍.細菌型豆豉發(fā)酵機理及功能性研究[D].泰安：山東農業(yè)大學，2012.

[3]于松峰，鄭 宇，楊 帥，等.傳統(tǒng)豆瓣辣醬發(fā)酵過程細菌群落演替與發(fā)酵過程的對應關系[J].中國調味品，2017，42（4）：53-58.

[4]關統(tǒng)偉，王鵬昊，鄧奧宇，等.郫縣豆瓣發(fā)酵過程可培養(yǎng)細菌多樣性及其演化分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2017，43（4）：22-27.

[5]張 琦，汪先丁，楊 虎，等.郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中細菌群落結構的變化[J].食品與發(fā)酵科技，2010，46（6）：16-18，35.

[6]于美娟，譚 歡，馬美湖，等.傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚中細菌群落多樣性與品質特征分析[J].食品科學，2017，38（8）：86-95.

[7]王華娟.酸魚中乳酸菌的分離鑒定及其可控發(fā)酵工藝研究[D].武漢：武漢輕工大學，2016.

[8]湛劍龍.貴州侗族酸魚、酸肉中抗氧化乳酸菌的篩選與優(yōu)化[D].貴陽：貴州大學，2015.

[9]段 艷.乳酸菌的篩選及其對羊肉干發(fā)酵香腸品質特性的影響[D].呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學，2013.

[10]吳進菊，胡佳琪，于 博，等.傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性和群落結構動態(tài)變化研究進展[J].中國釀造，2016，35（9）：20-23.

[11]AMANN R I,LUDWIG W,SCHLEIFER K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiol Rev,1995,59(1):143-169.

[12]HANDELSMAN J.Metagenomics application of genomics to uncultured in microorganisms[J].Microb Mol Biol Rev,2004,68(4):669-685.

[13]HARUTA S,UENO S,EGAWA I,et al.Succession of bacterial and fungal communities during a traditional pot fermentation of rice vinegar assessed by PCR-mediated denaturing gradient gel electrophoresis[J].Int J Food Microbiol,2006,109(1):79-87.

[14]李 欣，王彥華，林靜怡，等.高通量測序技術分析醬香型白酒酒醅的微生物多樣性[J].福建師范大學學報：自然科學版，2017，33（1）：51-59.

[15]夏圍圍，賈仲君.高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術評價[J].微生物學報，2014，54（12）：1489-1499.

[16]PARK E J,KIM K H,ABELL G C J,et al.Metagenomic analysis of the viral communities in fermented foods[J].Appl Environ Microbiol,2011,77(4):1284-1291.

[17]WANG Z M,LU Z M,SHI J S,et al.Exploring flavour-producing core microbiota in multispecies solid-state fermentation of traditional Chinese vinegar[J].Sci Rep,2016,6:26818.

[18]ZHANG J,WANG X,HUO D,et al.Metagenomic approach reveals microbial diversity and predictive microbial metabolic pathways in Yucha,a traditional Li fermented food[J].Sci Rep,2016,6:32524.

[19]JI Y J,LEE S H,KIM J M,et al.Metagenomic analysis of Kimchi,a traditional Korean fermented food[J].Appl Environ Microbiol,2011,77(7):2264-2274.

[20]趙紅宇，徐煒楨，楊國華，等.基于高通量測序的郫縣豆瓣后發(fā)酵期細菌多樣性研究[J].食品科學，2017，38（10）：117-122.

[21]LI Z,RUI J,LI X,et al.Bacterial community succession and metabolite changes during doubanjiang-meju fermentation,a Chinese traditional fermented broad bean(Vicia fabaL.)paste[J].Food Chem,2017,218:534-542.

[22]WANG Q,GARRITY M G,TIEDIE M J,et al.Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequencesinto the new bacterial taxonomy[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(16):5261-5267.

[23]張 瑤，白 娟，王承明.鲊肉粉的加工工藝研究[J].中國釀造，2017，36（10）：175-180.

[24]郭 壯，沈 馨，董 蘊，等.襄陽大頭菜腌制液膜醭細菌群落結構研究[J].中國釀造，2017，36（7）：143-147.

[25]聶志強，韓 玥，鄭 宇，等.宏基因組學技術分析傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程微生物多樣性[J].食品科學，2013，34（15）：198-203.

[26]ZOU Y L,XIANG W L,RAO Y,et al.Diversity analysis of bacteria in the latter ripening of Pixian soybean paste fermentation based on 16S rDNA analysis[J].Afr J Microbiol Res,2012,6(42):7008-7012.

[27]朱 琳，高 鳳，曾椿淋，等.蘿卜泡菜細菌多樣性的高通量測序分析[J].現(xiàn)代食品科技，2018，34（2）：1-6.

[28]朱雯娟.發(fā)酵梅香魚微生物種群結構分析及發(fā)酵菌株篩選研究[D].湛江：廣東海洋大學，2015.

[29]LIU W,ZHENG Y,KWOK L Y,et al.High-throughput sequencing for the detection of the bacterial and fungal diversity in Mongolian naturally fermented cow's milk in Russia[J].BMC Microbiol,2015,15(1):45.

[30]蘇加坤，徐 達，郭 磊，等.基于宏基因組測序的煙葉表面微生物多樣性分析[J].基因組學與應用生物學，2017（4）：1538-1545.

[31]陳澤斌，李 冰，王定康，等.Illumina MiSeq高通量測序分析核桃內生細菌多樣性[J].江蘇農業(yè)學報，2015（5）：1129-1133.

[32]陳圣賓，歐陽志云，徐衛(wèi)華，等.Beta多樣性研究進展[J].生物多樣性，2010，18（4）：323-335.

[33]郭 壯.應用焦磷酸測序技術對不同人群腸道微生物群落結構的研究[D].無錫：江南大學，2013.

[34]程 燕，楊 勇，廖定容，等.腐生葡萄球菌s25在四川香腸加工過程中對脂肪和蛋白質的影響[J].食品科學，2012，33（23）：223-227.

[35]李巧玉，方 芳，堵國成，等.魏斯氏菌在發(fā)酵食品中的應用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2017（10）：241-247.

[36]朱志遠，盧士玲，孫曉斌，等.發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸微生物和理化品質的影響[J].江蘇農業(yè)學報，2009，25（4）：890-893.

[37]關統(tǒng)偉，向慧平，王鵬昊，等.基于高通量測序的郫縣豆瓣不同發(fā)酵期細菌群落結構及其動態(tài)演替[J].食品科學，2018，39（4）：106-111.