龐 超，耿 涵，姚汐雨，石葉帆，朱 丹，趙 瑩，于 海*，朱 龍，梁永正

（1.揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.江蘇天之香食品有限公司，江蘇 宿遷 223800；3.江蘇康旺食品有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225000）

我國傳統(tǒng)發(fā)酵的醬油主要利用微生物發(fā)酵，發(fā)酵周期為2～4個月，到現(xiàn)在已經(jīng)有兩千多年的歷史。人類利用微生物進(jìn)行食品發(fā)酵與釀造已有數(shù)千年的歷史，直到19世紀(jì)中葉，巴斯德（Pasteur）經(jīng)過長期而細(xì)致的研究后，才有說服力地宣告發(fā)酵是微生物作用的結(jié)果[1]。傳統(tǒng)醬油的發(fā)酵利用制曲過程中產(chǎn)生的蛋白酶來分解豆中的蛋白質(zhì)，形成一定量的氨基酸、糖類等物質(zhì)，賦予醬油獨(dú)特的風(fēng)味。現(xiàn)在國內(nèi)不少科研單位通過對中國傳統(tǒng)醬油釀造技術(shù)的改良，培育醬油生產(chǎn)優(yōu)勢菌株，創(chuàng)造獨(dú)具特色的現(xiàn)代醬油生產(chǎn)工藝以此來縮短醬油的發(fā)酵周期并改善其風(fēng)味。在醬油發(fā)酵過程中，微生物對醬油的風(fēng)味和品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用，自然發(fā)酵的醬油中主要的微生物菌群為霉菌和細(xì)菌[2]。霉菌主要為米曲霉，米曲霉具有復(fù)雜的酶系，包括蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、谷氨酰胺酶等，因而它在發(fā)酵過程中可通過分解淀粉和蛋白質(zhì)原料，為其他微生物的代謝作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)[3-4]。細(xì)菌中，芽孢桿菌在發(fā)酵過程中不但數(shù)量突出，而且含有大量形成醬油風(fēng)味的酶類物質(zhì)，在發(fā)酵過程中發(fā)揮非常重要的作用[5]，乳酸菌能產(chǎn)生多種有機(jī)酸，這些有機(jī)酸既是醬油的風(fēng)味成分，又是其他酯香類物質(zhì)的前體[6]，乳酸菌繁殖可以促進(jìn)醬醪pH值下降到酵母活動的最適pH，促進(jìn)酵母繁殖進(jìn)而提高醬油風(fēng)味[7]，但自然發(fā)酵也存在一些有害微生物的參與，這不僅使醬油產(chǎn)品的穩(wěn)定性受到影響，也存在著很大的安全隱患[8]。研究傳統(tǒng)發(fā)酵醬油中微生物的分布，明確優(yōu)勢菌株的類別對提升傳統(tǒng)發(fā)酵醬油的質(zhì)量和安全性具有很積極的意義，目前文獻(xiàn)對發(fā)酵醬油中霉菌報道很多，對細(xì)菌的報道很少。本試驗(yàn)以醬油釀造過程中發(fā)酵2個月的黃豆為試驗(yàn)材料，以蛋白酶活力、硫化氫和生物胺產(chǎn)生性能為評價指標(biāo)進(jìn)行細(xì)菌篩選和鑒定，并對菌株的發(fā)酵性能及功能性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醬油釀造過程中發(fā)酵2個月的黃豆樣品：江蘇康旺食品有限公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：揚(yáng)州大學(xué)肉制品試驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉、營養(yǎng)肉湯粉、K2HPO4、CaCO3、硫胺素、磷酸吡哆醛、溴甲酚紫（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Ezup柱式動物基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基：在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂。

H2S產(chǎn)生培養(yǎng)基：牛肉膏7.5g，蛋白胨10.0g，瓊脂20.0g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 000 mL。在瓊脂凝固前加入10%無菌FeCl25.0 mL，在無菌條件下將液體培養(yǎng)基倒入試管內(nèi)，高度為4～5 cm，冷卻凝固，供接種用。

生物胺產(chǎn)生測定培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入硫胺素0.01 g、K2HPO42.0 g、CaCO30.1 g、磷酸吡哆醛0.05 mg、溴甲酚紫0.06 g。

耐鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入8%的氯化鈉。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20K精密pH計：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；SorvaLLST 16R高速冷凍離心機(jī)：美國賽默飛世爾科技有限公司；INFINITE200PRO多功能酶標(biāo)儀：大臻卓越（北京）科學(xué)儀器有限公司；TecanAustria GmbH；ZRD-7140全自動新型鼓風(fēng)干燥箱：上海智誠分析儀器公司；JF-SX-500高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌的分離與純化

取3.9 g樣品于35 mL滅菌生理鹽水中，室溫振蕩后，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個梯度重復(fù)3次。選擇不同的稀釋度，各取0.1mL分別均勻涂布于營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃靜置培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)不同的單菌落，經(jīng)多次劃線純化，得到純菌株。

1.3.2 細(xì)菌的篩選

（1）蛋白酶活力測定：取分離純化的細(xì)菌在20%含鹽量培養(yǎng)基上培養(yǎng)，模擬醬油的鹽度環(huán)境，1 d后測定總蛋白酶活力，蛋白酶活性測定采用福林-酚法[9]。

（2）H2S試驗(yàn)：用200 mL移液槍吸取50 mL菌液，插入距離試管底1 cm處進(jìn)行接種，37℃條件下培育7 d，觀察結(jié)果。變黑者為陽性，不變黑者為陰性。生化管呈現(xiàn)黑色則說明此菌株產(chǎn)H2S，篩選出不產(chǎn)H2S的菌株。

（3）生物胺試驗(yàn)：將菌株接種于含1%過濾除菌的酪氨酸的生物胺產(chǎn)生測定液體培養(yǎng)基中，與沒有添加氨基酸的生物胺產(chǎn)生測定液體培養(yǎng)基作對照組，37℃條件下培養(yǎng)3～7 d，觀察顏色變化，若由黃變紫則說明該菌株氨基酸脫羧酶呈陽性。篩選出不產(chǎn)生物胺的菌株。

1.3.3 細(xì)菌的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選出的單一菌株進(jìn)行培養(yǎng)及革蘭氏染色，觀察菌株菌落及細(xì)胞形態(tài)。

（2）生理生化鑒定

參照相關(guān)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[17]。

（3）分子生物學(xué)鑒定

將二次活化后的菌液離心取沉淀，使用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA的提取，提取的DNA放置于4℃保藏備用。PCR擴(kuò)增通用引物1：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；引物2：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′。PCR反應(yīng)體系：25 μL 2×TaqMaster Mix；2 μL引物1；2 μL引物2；4 μL提取的DNA；17 μL蒸餾水。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸7 min。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行鑒定?；蛐蛄械臏y序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行BLAST搜索，并在GenBank中進(jìn)行核酸序列比對分析[10]。

1.3.4 耐鹽性試驗(yàn)

耐鹽性試驗(yàn)：將菌株接種于耐鹽性液態(tài)培養(yǎng)基中，37℃條件下培育24 h后，以未接菌的耐鹽性液態(tài)培養(yǎng)基作為對照，測定波長600 nm處的吸光度值，計算對照組OD600nm值與樣品組OD600nm值的比值，通過比值篩選耐鹽的菌株[12]。

1.3.5 細(xì)菌生長曲線的繪制

用肉湯液體培養(yǎng)基活化菌種，活化菌株以2%的接種量接種于肉湯液體培養(yǎng)基（裝液量200 mL/250 mL）中，37℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定菌懸液的OD600nm值，繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.3.6 細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)

菌株活化：用移液槍分別取100 μL菌液于10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，為活化一次。菌株進(jìn)行3次活化，4 000 r/min離心10 min，取沉淀加入滅菌處理過的生理鹽水并調(diào)整其濃度至107CFU/mL，4℃保存待用。

抑菌試驗(yàn)：以大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為抑菌試驗(yàn)的指示菌，吸取0.1 mL稀釋后的指示菌菌懸液涂布于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，靜置5 min，用直徑為6 mm的無菌打孔器打孔，篩選出的菌株的發(fā)酵液于4℃、15 800×g離心10 min，取50 μL上清液加入孔中，靜置培養(yǎng)24～48 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，準(zhǔn)確記錄抑菌圈直徑（包括孔的直徑）（mm），每株菌做2個平行試驗(yàn)。

1.3.7 氨基酸態(tài)氮含量的測定

參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[13]中的甲醛滴定法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化結(jié)果

本試驗(yàn)經(jīng)過菌的分離純化，初步篩出35株菌。

2.2 細(xì)菌的篩選

2.2.1 蛋白酶活力測定結(jié)果

以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，酪蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of casein

由圖1可知，酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.010 6x+0.001 4，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，表明二者線性關(guān)系良好。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定不同菌株的蛋白酶活力，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，蛋白酶活力較高的菌株共12株，其中菌株2#、4#、6#、7#、11#的蛋白酶活力達(dá)到40 U/g以上。在醬油發(fā)酵過程中，蛋白酶降解蛋白質(zhì)為肽、氨基酸，而氨基酸是風(fēng)味形成的重要物質(zhì)，所以菌株的蛋白酶活性越高，越能形成醬油中的優(yōu)良風(fēng)味。

圖2 不同菌株的蛋白酶活力比較Fig.2 Comparison of protease activity of different bacterial strains

2.2.2 H2S及生物胺試驗(yàn)結(jié)果

在醬油制作過程中，部分微生物發(fā)酵會產(chǎn)生H2S、生物胺，賦予產(chǎn)品不好的氣味和色澤。硫化氫具有急性劇毒，吸入少量高濃度硫化氫可于短時間內(nèi)致命，低濃度的硫化氫對眼、呼吸系統(tǒng)及中樞神經(jīng)都有影響[14]。適量的生物胺有利于人體的健康，但是過量的生物胺會使人體中毒，導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，會引起頭疼、血壓變化、呼吸紊亂、心悸、嘔吐等嚴(yán)重反應(yīng)，另外，腐胺、尸胺、精胺和亞精胺能夠與亞硝酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生致癌物質(zhì)亞硝基胺[15-16]，所以發(fā)酵醬油所選用的優(yōu)勢菌株，要滿足不產(chǎn)H2S、生物胺的條件。

將蛋白酶活性試驗(yàn)篩選得出的12株菌進(jìn)行H2S及生物胺試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，篩選出不產(chǎn)H2S和生物胺的菌株5株，菌株編號分別為3#、4#、6#、7#、9#。

表1 菌株H2S及生物胺試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of hydrogen sulfide and biogenic amines tests

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)過革蘭氏染色后鏡檢觀察，結(jié)果表明，5株菌均呈紫色，為革蘭氏陽性桿菌。

2.3.2 生理生化鑒定

5株細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，參照相關(guān)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[17]，初步鑒定菌株3#、4#、7#為芽孢桿菌屬（Bacillus），菌株6#、9#為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

表2 菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical identification of strains

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

DNA瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果見圖3，16S rDNA序列同源性分析結(jié)果見表3。

圖3 菌株16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of 16S rDNA amplification products of strains

表3 菌株鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of strains

由圖3可知，這5株菌的DNA分子質(zhì)量在1000～2000bp之間，符合16S rDNA測序要求。由表3可知，通過16S rDNA序列同源性分析，菌株3#、4#、7#與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性達(dá)到97%以上，確定這3株為枯草芽孢桿菌；菌株6#、9#與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermus）的同源性達(dá)到98%，確定為發(fā)酵乳桿菌。

2.4 耐鹽性試驗(yàn)結(jié)果

在醬油制作過程中，在發(fā)酵后熟期都不可避免地要添加鹽類，除調(diào)味和防腐這雙重功效外，發(fā)酵后期還可以借助鹽溶作用提取前期微生物菌體繁殖產(chǎn)生的各種水解酶系，從而為后熟過程中一系列生化反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。當(dāng)食鹽達(dá)到一定濃度時，會對微生物產(chǎn)生滲透脅迫及毒性作用，使微生物受到抑制甚至死亡[18]。因此菌株對鹽類的耐受能力不僅反映了各種細(xì)菌在醬油環(huán)境中的活性狀態(tài)，而且對于其發(fā)揮功能特性具有重要意義。不同菌株的耐鹽性測定結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，耐鹽性較好的菌株是6#和9#，對照組與樣品組OD600nm值的比值在4～5之間，說明發(fā)酵乳桿菌的耐鹽性強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。

圖4 不同菌株的耐鹽性比較Fig.4 Comparison of salt tolerance by different strains

2.5 細(xì)菌的生長曲線測定結(jié)果

菌株的生長曲線反應(yīng)了菌株的生長能力。5株菌株的生產(chǎn)曲線測定結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，5株菌株的生長趨勢相似，0～6 h為遲緩期，6～12 h為對數(shù)期，12～26 h為穩(wěn)定期，26～36 h為衰亡期。菌株3#、4#、7#在對數(shù)期且穩(wěn)定期的高峰的OD600nm值較菌株6#、9#的大，說明枯草芽孢桿菌比發(fā)酵乳桿菌的生長能力強(qiáng)。

圖5 不同菌株的生長曲線Fig.5 Growth curves of different strains

2.6 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

在醬油發(fā)酵過程中，往往伴隨著其他微生物的產(chǎn)生，其中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是豆豉發(fā)酵過程中容易滋生的有害微生物[11]，所以，抑制大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的能力是檢測醬油發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌株的重要指標(biāo)。5株細(xì)菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小見表4。

表4 菌株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial ability of strains onEscherichia coliand Staphylococcus aureus

由表4可知，枯草芽孢桿菌3#、4#、7#抑制大腸桿菌的透明圈直徑分別為18.5mm、16.0mm、17.0mm，抑制金黃色葡萄球菌的透明圈直徑分別為15.0mm、14.5 mm、14.0 mm，較發(fā)酵乳桿菌6#、9#的抑菌圈直徑大，所以抑菌能力更強(qiáng)。

2.7 氨基酸態(tài)氮含量的測定結(jié)果

由于氨基酸態(tài)氮含量能夠反映蛋白的水解程度，所以對不同菌株發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖6。

圖6 不同菌株發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量比較Fig.6 Comparison of amino nitrogen content in fermentation broth of different strains

由圖6可知，各菌株發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量均高于國標(biāo)GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[13]，6#和9#菌株的氨基酸態(tài)氮含量（均＞1.2 mg/g）較高，可見發(fā)酵乳桿菌具有更好的蛋白酶降解能力。由于本試驗(yàn)在高鹽培養(yǎng)基（20%含鹽量）中取樣進(jìn)行分析，充分模擬高鹽稀態(tài)醬油的高鹽環(huán)境，具有合理性，因此6#和9#菌株應(yīng)用于醬油生產(chǎn)中，能得到更高的氨基酸態(tài)氮含量。

3 結(jié)論

以蛋白酶活力、H2S及生物胺為評價指標(biāo)，從醬油釀造過程中綜合篩選到5株優(yōu)勢細(xì)菌，編號分別為3#、4#、6#、7#、9#。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析，鑒定菌株6#、9#為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermus），菌株3#、4#、7#為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。乳桿菌屬可防止微生物過量生長，有助于穩(wěn)定發(fā)酵生物區(qū)系平衡[19]，而芽孢桿菌屬作為前期的發(fā)酵菌株讓產(chǎn)生的醬油口感俱佳[20]，同時通過細(xì)菌耐鹽性、生長曲線、抑菌性試驗(yàn)及氨基酸態(tài)氮含量的測定，得知其中發(fā)酵乳桿菌的耐鹽耐亞硝酸鹽性及蛋白降解能力較強(qiáng)，枯草芽孢桿菌的活性和抑菌性較強(qiáng)。因此本研究分離到的菌株可以考慮作為有益菌株應(yīng)用于醬油的后發(fā)酵中。

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