蘇雪林，董佩娜，萬銀松，劉 婭*

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

脂肪酶具有多項催化反應（如催化水解、醇解、酯交換、酯合成等）能力[1]，是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，在食品、化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領域應用廣泛。然而酶在生產(chǎn)、儲存、運輸、應用等過程中極易受溫度、pH值、脂肪酶濃度、底物濃度、酶的激活劑和抑制劑等多種因素的影響[2-3]，導致酶的穩(wěn)定性差、易失活，限制了其有效應用。因此，研究和改善穩(wěn)定脂肪酶的方法具有重要理論意義和實踐價值。

目前，提高酶類保存穩(wěn)定性的方法主要包括三種，第一，酶的固定化[4-5]：將游離酶限定在一定空間內(nèi)或附著在某些固態(tài)物質上。此法有效、便捷，且具有易于實現(xiàn)底物和產(chǎn)物的分離、提高酶的使用效率和降低生產(chǎn)成本的優(yōu)點。第二，添加穩(wěn)定劑[6-9]：通過向酶液中添加底物、底物類似物、防腐劑、鹽類、糖類、多元醇類等化學物質改善酶存在的環(huán)境。第三，蛋白質工程技術[10-11]，利用分子手段和DNA重組技術定向改造酶的某些性質，例如敲除不利于酶分子穩(wěn)定性的基因、添加有利的基團等。此外，定向篩選、改變酶的保存溫度及利用化學修飾等方法也能有效增強酶的穩(wěn)定性[12-14]。

鑒于添加穩(wěn)定劑的方法具有簡單、方便、成本低、易于操作，且酶活穩(wěn)定效果好的特點，本實驗探討了室溫下黑曲霉（Aspergillusniger）C2J6脂肪酶在不同穩(wěn)定劑作用下的保存穩(wěn)定性，以期為其長期儲存奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）C2J6：本實驗室自主分離、保藏的菌種。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar，PDA）：馬鈴薯葡萄糖水26 g/L，瓊脂20 g/L；

液體種子培養(yǎng)基：KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L；

發(fā)酵培養(yǎng)基：NH4Cl 15 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，CaCl20.1 g/L，KCl 0.5 g/L，橄欖油20 mL/L。

棕櫚酸對硝基苯酯：美國Sigma公司；聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）2000：天津永晟精細化工有限公司；橄欖油：上海嘉里食品工業(yè)有限公司；蛋白胨、馬鈴薯葡萄糖水：青島海博生物技術有限公司；甘氨酸、檸檬酸、醋酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；乙腈、果糖、蔗糖、葡萄糖、丙三醇、硫酸鎂、氯化鈣、氯化銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等（均為分析純）：北京市奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D雙人單面潔凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；HH-42恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；PHS-3C酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；MJX-150智能霉菌培養(yǎng)箱、THZ-98恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海百典儀器有限公司；EON多功能酶標儀：美國BIOTEK儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉C2J6脂肪酶的制備

黑曲霉C2J6經(jīng)液體種子培養(yǎng)22 h后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃條件下150 r/min搖床培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液過濾后即得脂肪酶粗酶液。

1.3.2 脂肪酶活力測定

將樣品管中各加入200 μL棕櫚酸對硝基苯酯反應底物，40℃水浴預熱5 min，然后在樣品管中加入脂肪酶液50 μL，對照管中加入滅活的酶液50 μL，立即混勻計時，在水浴中準確反應5 min后，加入10 μL乙二胺四乙酸二鈉溶液并放入冰水中10min終止反應，用酶標儀測定波長405nm處的吸光度值[16-17]。以未經(jīng)處理的脂肪酶初始活力為100%，計算相對酶活。

1.3.3 單一穩(wěn)定劑對脂肪酶保存穩(wěn)定性的影響

（1）穩(wěn)定劑種類的影響

將0.2 mol/L醋酸鈉、3 mol/L丙三醇、4 mol/L氯化鈉、4 mol/L氯化銨、4%果糖、4%蔗糖、4%葡萄糖、0.2 mol/L硫酸鎂、0.2 mol/L聚乙二醇等穩(wěn)定劑分別添加到酶液中[18-21]，充分混勻后室溫放置48 h，測定相對酶活。

（2）穩(wěn)定劑添加量的影響

將不同添加量的丙三醇、聚乙二醇、氯化鈉、氯化銨、硫酸鎂、果糖、蔗糖、葡萄糖分別添加到酶液中，充分混合后室溫放置48 h，測定相對酶活。

1.3.4 復合穩(wěn)定劑對脂肪酶保存穩(wěn)定性的影響

以單因素試驗為基礎，選取單一穩(wěn)定劑中3個保存效果較好的穩(wěn)定劑進行復配，優(yōu)化各穩(wěn)定劑添加量。本試驗以丙三醇添加量（A）、硫酸鎂添加量（B）、果糖添加量（C）為主要評價因素，相對酶活（Y）為響應值，設計3因素3水平的Box-Behnken響應面試驗，因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 穩(wěn)定劑種類對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

向脂肪酶中添加各種單一穩(wěn)定劑，考察穩(wěn)定劑對脂肪酶穩(wěn)定性的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，穩(wěn)定劑中丙三醇的效果最好，相對酶活高達63%以上，醋酸鈉的效果最差，相對酶活僅為22%左右。氯化鈉、硫酸鎂等其他穩(wěn)定劑均能在一定程度上保留脂肪酶活性。多元醇類穩(wěn)定劑屬于羥基化合物，其羥基可以和酶的酰胺基反應，有研究表明酰胺鍵的形成能增強酶分子穩(wěn)定性，從而提高酶活力[22]。此外醇類穩(wěn)定劑中的丙三醇能增大酶液黏度，增加分子表面水化層，減少肽鏈間的碰撞，抑制酶分子間聚集，從而保護酶分子二級結構、維持酶分子天然構象，提高酶穩(wěn)定性[23]。糖類的羥基也可與酶液相互作用，使酶與水之間溶劑化，二者間形成的氫鍵能改變酶分子折疊的驅動力，降低酶分子自由能，使酶分子穩(wěn)定性增強[24]。鹽類穩(wěn)定劑中金屬離子能結合酶的帶電基團，減少氧氣等其他物質和酶分子的結合，從而增加其穩(wěn)定性[25-26]。

圖1 穩(wěn)定劑種類對脂肪酶穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of stabilizer type on lipase stability

2.2 穩(wěn)定劑添加量對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

從醇類、糖類、鹽類中挑選效果相對較好的穩(wěn)定劑，以不同濃度醇類和鹽類1～5 mol/L（硫酸鎂0.1～0.5 mol/L），糖類1%～5%，添加到脂肪酶中，結果見圖2。

由圖2A可知，隨著醇類添加量的逐漸升高，聚乙二醇對脂肪酶活力的影響不大，相對酶活僅維持在60%左右，而在4mol/L丙三醇作用下，相對酶活最高能達到63%左右?？梢姳嫉男Ч詢?yōu)于聚乙二醇。由圖2B可知，相同濃度下，硫酸鎂能較好的維持脂肪酶的活力，且在較低濃度下就能達到比較好的保存效果，0.2 mol/L硫酸鎂能使酶的相對活力達到60%以上。氯化鈉和氯化銨在低濃度時對酶的保存效果不佳，在濃度達到4 mol/L時的效果也沒有硫酸鎂好。由圖2C可知，隨著糖類穩(wěn)定劑添加量的不斷增大，脂肪酶的相對酶活逐漸增大至55%以上，其中在4%果糖作用下，能達到60%以上。但糖類濃度達到5%時，相對酶活則迅速減小。實驗中發(fā)現(xiàn)，三種糖類穩(wěn)定劑對脂肪酶保存穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，其原因可能是低濃度的糖更容易與水分子相互作用，穩(wěn)定酶分子結構，而高濃度的糖會使酶液滲透壓增大，改變酶分子構象從而導致酶活降低。結果表明，4%的果糖作為穩(wěn)定劑能使脂肪酶的保存穩(wěn)定性更好。

圖2 醇類（A）、鹽類（B）、糖類（C）添加量對脂肪酶穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of alcohol(A),salts(B)and sugar(C)addition on lipase stability

2.3 響應面試驗結果及方差分析

根據(jù)脂肪酶相對酶活的變化，采用Box-Behnken設計響應面試驗，結果如表2和表3所示。對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，以丙三醇添加量（A）、硫酸鎂添加量（B）、果糖添加量（C）為自變量，以脂肪酶相對酶活（Y）為因變量，得到回歸方程：

由表3可知，在方差分析中，決定系數(shù)R2=0.982 6，表明了丙三醇添加量、硫酸鎂添加量、果糖添加量這三個因素與脂肪酶酶活的關系可以較好的用回歸方程進行擬合。校正系數(shù)R2Adj=0.960 3，表明響應值96%的變化可以用該模型解釋。模型項P＜0.000 1，差異極顯著；失擬項P＞0.05，差異不顯著，一次項、二次項的差異都極顯著，說明非實驗因素對結果影響不大，該模型可以用于優(yōu)化穩(wěn)定劑保存脂肪酶的條件研究。

表2 脂肪酶穩(wěn)定劑配方優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for lipase stabilizer formula optimization

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

2.4 響應面分析及優(yōu)化

為了更直觀的探討各穩(wěn)定劑對黑曲霉C2J6脂肪酶保存穩(wěn)定性的影響且找到最優(yōu)組合，選擇方差分析顯著的因素繪制響應面圖，結果見圖3。

圖3 各因素交互作用對脂肪酶穩(wěn)定性影響的響應面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour line of effects of interactions between each factors on lipase stability

由圖3可知，硫酸鎂添加量與丙三醇添加量、果糖添加量與丙三醇添加量、果糖添加量與硫酸鎂添加量這3組交互作用項的曲面圖均為陡峭的凸面，說明這3組穩(wěn)定劑的交互作用都顯著。由圖3a可知，與丙三醇添加量方向上的響應曲面相比，硫酸鎂的曲面比較陡，這說明硫酸鎂比丙三醇添加量對酶活的影響大。由圖3b可知，與丙三醇添加量方向上的響應曲面相比，果糖的曲面比較陡，這說明果糖比丙三醇添加量對酶活的影響大。由圖3c可知，與硫酸鎂添加量方向上的響應曲面相比，果糖的曲面比較陡，這說明果糖比硫酸鎂添加量對酶活的影響大。通過響應面軟件對模型進行預測分析，得到脂肪酶穩(wěn)定劑的最佳保存條件為3.54 mol/L丙三醇，0.14 mol/L硫酸鎂，果糖4.96%，在此條件下保存48 h，相對酶活預測值為72.92%。

2.5 驗證試驗

根據(jù)模型預測得到的最優(yōu)條件，并根據(jù)實際條件進行優(yōu)化，在丙三醇3.54 mol/L，硫酸鎂0.14 mol/L，果糖5%的條件下進行驗證試驗，得到在此條件下保存48 h后的相對酶活為72.90%，與預測值72.92%接近，說明該模型能較好的預測復合穩(wěn)定劑維持脂肪酶保存穩(wěn)定性的情況。對于單一穩(wěn)定劑而言，其保護能力有限，而復合穩(wěn)定劑因協(xié)同作用能從多方面發(fā)揮保護作用，從而起到較好的效果。

3 結論

由于脂肪酶的穩(wěn)定性較差，不利于其有效、廣泛的使用，因此，研究脂肪酶的保存穩(wěn)定性，尋找最佳的保存方法尤為重要。本實驗主要針對室溫條件下黑曲霉C2J6脂肪酶的穩(wěn)定性進行研究，其在復合穩(wěn)定劑中的穩(wěn)定性優(yōu)于單一穩(wěn)定劑。酶液中添加復合穩(wěn)定劑的最佳組合：丙三醇3.54 mol/L，硫酸鎂0.14 mol/L，果糖5%，此條件下保存48 h后，脂肪酶的相對酶活達72.90%。此法可以為黑曲霉C2J6脂肪酶在低溫及室溫下的長期保存提供參考，有利于后期脂肪酶的研究及應用。

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