李增威，王 娜，雷 嬋，曾 月，付珍珍，何 利，劉書亮，周 康，敖曉琳，陳姝娟

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

磁性分子印跡聚合物的制備及對(duì)食品中氯霉素殘留的檢測(cè)

李增威，王 娜，雷 嬋，曾 月，付珍珍，何 利，劉書亮，周 康，敖曉琳，陳姝娟*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

摘 要：將磁性分離技術(shù)和表面分子印跡技術(shù)相結(jié)合，首先通過化學(xué)改性的方式在Fe3O4磁性納米粒子表面接枝雙鍵，以氯霉素(chloramphenicol，CAP)為模板分子、甲基丙烯酸(methacrylic acid，MAA)為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate，EDGMA)為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈(azobisisobutyronitrile，AIBN)為引發(fā)劑，采用懸浮聚合法合成CAP的磁性分子印跡聚合物微球(magnetic molecularly imprinted polymer，MMIP)，以及對(duì)應(yīng)的非印跡微球(magnetic molecularly non-imprinted polymer，MNIP)。在表征試驗(yàn)中，用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)每一步合成的產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)，用掃描電子顯微鏡對(duì)MMIP和MNIP的微觀形態(tài)進(jìn)行觀察，用振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)測(cè)定磁性納米粒子和MMIP的飽和磁強(qiáng)度。對(duì)MMIP和MNIP的吸附性能進(jìn)行研究，將MMIP作為固相萃取劑應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，進(jìn)行方法學(xué)考查。試驗(yàn)結(jié)果表明，合成的磁性分子印跡聚合物微球直徑400～700 nm，分散性較好，在溶劑中可在外加磁場(chǎng)作用下快速分離。MMIP的最大表觀吸附容量可達(dá)29.18mg·g-1，具有良好的選擇識(shí)別性能。MMIP作為固相萃取劑在對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)回收率(86.30%～94.21%)、精密度(RSD≤1.53%)、穩(wěn)定性(RSD≤1.87%)均良好，且具有較低的檢測(cè)限(3.0μg·kg-1)。將MMIP作為固相萃取劑用于食品中殘留氯霉素的分離檢測(cè)具有良好的效果。

關(guān)鍵詞：氯霉素；磁性分離；表面印跡；固相萃??；高效液相色譜

氯霉素(chloramphenicol，CAP)，又名氯胺丙醇，于1947年在鏈霉菌的培養(yǎng)液中分離制得，是第一個(gè)可以完全人工合成的抗生素[1-2]。CAP是一種廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性和陽性菌，以及部分衣原體、立克次氏體均有抑制作用，曾被廣泛用于人類，以及畜牧業(yè)、漁業(yè)各種細(xì)菌性疾病的治療[3-4]。但CAP的毒副作用不可忽視：CAP可抑制骨髓的造血功能[5-6]；如果進(jìn)入嬰兒體內(nèi)還會(huì)導(dǎo)致“灰嬰綜合征”[7]；此外，長期微量攝入CAP，會(huì)引起腸道菌群的失調(diào)，使人容易感染各種疾病[8]?，F(xiàn)在，包括我國在內(nèi)的許多國家都已禁止將CAP用于養(yǎng)殖業(yè)，但由于CAP廉價(jià)高效，違規(guī)使用CAP的現(xiàn)象依然存在[9]。

由于在實(shí)際樣品中CAP的含量較低，因此需要在檢測(cè)前對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行富集，同時(shí)須排除樣品基質(zhì)，特別是類似物的干擾。固相萃取(solid phase extraction，SPE)是一種常用的富集、分離手段，操作簡單快速，但由于其吸附作用主要基于極性差異、氫鍵、離子交換作用等，所以對(duì)分子結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)缺乏選擇性，在處理基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品時(shí)，很難排除干擾[10-12]。

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinted technique，MIT)是從仿生的角度，用人工的方法制備出對(duì)某一特定分子具有選擇性和親和性的高分子化合物——分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)的技術(shù)[13-14]。該聚合物對(duì)模板分子具有較高的選擇識(shí)別能力，并且在較為惡劣的條件下，MIP不會(huì)喪失對(duì)目標(biāo)分子結(jié)合的能力[15-17]。近年來，分子印跡固相萃取技術(shù)由于選擇性較強(qiáng)、穩(wěn)定性好、易于制備而受到廣泛關(guān)注[18-20]。目前，對(duì)CAP分子印跡的研究較多，但制備CAP磁性分子印跡并應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)的研究還較少[21-23]。磁性分子印跡聚合物(magnetic molecularly imprinted polymer，MMIP)采用表面印跡技術(shù)，在磁性納米粒子表面合成分子印跡殼層。MMIP不僅具有分子印跡的優(yōu)勢(shì)——能夠特異性識(shí)別和吸附目標(biāo)分子，而且能在磁場(chǎng)的作用下快速分離，同時(shí)由于其粒徑較小，具有較大的比表面積，故吸附容量較大[24-26]，是一種更為理想的樣品前處理吸附材料。

本研究結(jié)合磁性分離技術(shù)和表面印跡技術(shù)，在Fe3O4磁性納米粒子表面合成能特異性選擇和吸附CAP的分子印跡殼層，得到MMIP。運(yùn)用紅外光譜檢測(cè)合成過程的產(chǎn)物，用掃描電子顯微鏡觀察MMIP和磁性非印跡聚合物(magnetic molecularly non-imprinted polymer，MNIP)的微觀形態(tài)，并用振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)測(cè)定磁性納米粒子和MMIP的飽和磁強(qiáng)度。同時(shí)，對(duì)MMIP和MNIP進(jìn)行等溫吸附、吸附動(dòng)力學(xué)和選擇性吸附試驗(yàn)，并對(duì)等溫吸附過程進(jìn)行Scatchard分析，深入研究其吸附能力和機(jī)理，在選擇性試驗(yàn)中計(jì)算其印跡因子和分離因子，評(píng)價(jià)其對(duì)類似物的選擇吸附能力。此外，本研究對(duì)MMIP運(yùn)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)能力進(jìn)行了全面的方法學(xué)評(píng)價(jià)，涉及回收率、精密度、穩(wěn)定性及檢測(cè)限等4個(gè)方面，全面評(píng)價(jià)了MMIP作為樣品前處理吸附材料的可靠性，充分發(fā)揮MMIP吸附容量大、檢測(cè)限低、吸附速度快等優(yōu)勢(shì)，為MMIP用于食品中CAP的檢測(cè)提供了重要依據(jù)，也為開發(fā)食品安全檢測(cè)中新型CAP樣品前處理吸附材料提供了重要參考。與傳統(tǒng)的固相萃取材料相比，MMIP克服了選擇性差的缺點(diǎn)，并且借助磁性，分離更為方便，在對(duì)復(fù)雜樣品檢測(cè)中能有效排除干擾，提高結(jié)果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

JJ-1電動(dòng)攪拌器；DZF-6020真空干燥箱；DZKW-4電子恒溫水浴鍋；KQ-250DB超聲波清洗儀；Agilent 1260液相色譜配DAD檢測(cè)器(型號(hào)：G4212B)；NICOLET iS10傅里葉紅外光譜儀；SHA-C恒溫振蕩器；UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)；7404型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)；日立S-3400N Ⅱ掃描電子顯微鏡。

氯霉素(CAP，98%)、甲砜霉素(TAP，99%)、氟苯尼考(FF，98%)、正硅酸乙酯(TEOS，分析純)、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(KH570，分析純)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，分析純)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分析純)購于成都化夏試劑公司。甲基丙烯酸(MAA，分析純)、氫氧化鈉(NaOH，分析純)、檸檬酸鈉(分析純)、FeCl3·6H2O(分析純)、FeSO4·7H2O(分析純)、無水乙醇(分析純)、甲醇(分析純)，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 CAP磁性分子印跡聚合物的制備

1.2.1 Fe3O4磁性納米粒子的制備

將含有0.01mol FeSO4·7H2O和0.02mol FeCl3·6H2O的100mL超純水在30min內(nèi)滴加到含有45mL 2.0mol·L-1NaOH和8mL 0.2mol·L-1檸檬酸鈉溶液的三頸燒瓶中，并不斷攪拌。滴加完成后繼續(xù)反應(yīng)1h，全程通氮除氧。用磁場(chǎng)分離磁性納米粒子，用超純水洗滌至中性，得到含有磁性納米粒子的磁流體。

1.2.2 Fe3O4@SiO2納米粒子的制備

測(cè)定磁流體的含水量，稱取含有100mg磁性納米粒子的磁流體，將其分散在50mL乙醇-水混合液(乙醇-水體積比8∶2)中，同時(shí)加入1mL 25%氨水。超聲10min之后，加入2mL正硅酸乙酯，再超聲10min。將混合物置于三角瓶中，通氮除氧后密封，30℃水浴振蕩反應(yīng)6h，得到Fe3O4@SiO2。

1.2.3 雙鍵修飾的Fe3O4@SiO2納米粒子的制備

用甲醇-水混合液(甲醇-水體積比1∶1)洗滌Fe3O4@SiO2數(shù)遍后，將Fe3O4@SiO2分散在50mL甲醇-水混合液中，加入2mL KH570，超聲10min使其混合均勻。將混合物置于三角瓶中，通氮除氧后密封，60℃水浴振蕩反應(yīng)24h。

1.2.4 MMIP和MNIP的制備

用無水乙醇洗滌雙鍵修飾的磁性納米粒子數(shù)遍后，將雙鍵修飾的磁性納米粒子和含有1mmol CAP、5mmol MAA的50mL乙醇溶液混合，然后加入含有6mmol EGDMA和0.1 g PVP的50mL乙醇溶液，最后加入0.025 g引發(fā)劑偶氮二異丁臍(AIBN)。每次加入試劑后均超聲10min，使其分散均勻。通氮除氧后置于60℃恒溫水浴搖床反應(yīng)24h。將得到的MMIP用適量甲醇-乙酸混合液(甲醇-乙酸體積比8∶2)洗脫模板分子，直到洗脫液在278 nm處檢測(cè)不出CAP的紫外吸收峰后，再用甲醇洗滌數(shù)遍。最后置于30℃真空干燥箱干燥48h。用同樣的方法不加CAP制備MNIP。

1.3 MMIP及MNIP的吸附試驗(yàn)

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Sepax HP-C18，4.6mm×250mm，5μm；流速：1mL·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長：278 nm；流動(dòng)相及比例：乙腈-水，體積比35∶65[27-28]。

1.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

稱取20mg MMIP和MNIP分散于5mL含40mg·L-1CAP的甲醇溶液中，25℃恒溫振蕩。分別測(cè)定其在10、20、30、40、50、60、120、180min的吸附量。測(cè)定時(shí)，在外加磁場(chǎng)作用下將上清液與聚合物分離，吸取上清液，過0.45μm濾膜，按照1.3.1節(jié)色譜條件測(cè)定其濃度。

1.3.3 等溫吸附試驗(yàn)

移取5mL濃度分別為20、40、60、80、100、120mg·L-1的CAP甲醇溶液，分別置于50mL離心管中。稱取6份20mg的MMIP和MNIP，分散于不同濃度的CAP甲醇溶液中，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。25℃恒溫振蕩4h后，在外加磁場(chǎng)作用下將上清液與聚合物分離，吸取上清液，過0.45μm濾膜，按照1.3.1中色譜的條件測(cè)定其濃度。

1.3.4 MMIP及MNIP的選擇性試驗(yàn)

選取TAP和FF作為CAP的類似物，進(jìn)行選擇性吸附試驗(yàn)。分別稱取20mg MMIP和MNIP分散于5mL濃度均為40mg·L-1的CAP、TAP和FF的甲醇混合溶液中。25℃振蕩4h后，在外加磁場(chǎng)作用下將上清液與聚合物分離，吸取上清液，過0.45μm濾膜，按照1.3.1節(jié)色譜條件測(cè)定CAP及其類似物的濃度。

1.4 MMIP用于實(shí)際樣品檢測(cè)的方法學(xué)評(píng)價(jià)

為全面評(píng)價(jià)MMIP作為固相萃取劑用于實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)的可靠性，進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)。試驗(yàn)的色譜條件同1.3.1節(jié)。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10mg·L-1的CAP甲醇溶液。按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.4.2 樣品處理方法

選取豬肉和蜂蜜作為檢測(cè)對(duì)象。

豬肉前處理方法。稱取10 g樣品于50mL離心管中，并根據(jù)加標(biāo)水平加入相應(yīng)量的CAP，用乙酸乙酯提取3次，合并3次的提取液。將提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至干，分2次加入5mL超純水洗滌瓶中殘余物，并轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，然后加入正己烷提取脂肪2次，得到的試液用MMIP進(jìn)一步提取。稱取20mg MMIP分散于試液中，振蕩60min后用磁鐵吸沉粒子，吸棄上清液。加入1mL洗液(甲醇-乙酸體積比8∶2)，超聲洗脫3次，合并3次洗脫液。將洗脫液于45℃氮吹儀上吹干，然后加入2mL甲醇溶解殘余物，過0.45μm有機(jī)相濾膜后待測(cè)[29]。蜂蜜前處理方法不用正己烷除脂肪，其余與豬肉相同[30]。

1.4.3 回收率測(cè)定

分別稱取4份10 g豬肉和蜂蜜，按照0、0.01、0.5、2mg·kg-1的加標(biāo)水平加入相應(yīng)量的CAP。用1.4.2節(jié)相應(yīng)的樣品前處理方法處理樣品后，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)試樣平行進(jìn)樣3次。

1.4.4 精密度測(cè)定

分別稱取4份10 g豬肉和蜂蜜，按照0、0.01、0.5、2mg·kg-1的加標(biāo)水平加入相應(yīng)量的CAP。用1.4.2節(jié)相應(yīng)的樣品前處理方法處理樣品后，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)試樣平行進(jìn)樣10次。

1.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

包括日內(nèi)和日間穩(wěn)定性。日內(nèi)取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(間隔6h)，日間取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(間隔24h)。稱取相應(yīng)的樣品，按照0、0.01、0.5、2mg·kg-1的加標(biāo)水平加入相應(yīng)量的CAP，按照1.4.2節(jié)相應(yīng)的樣品前處理方法處理樣品后，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.4.6 檢測(cè)限試驗(yàn)

分別稱取6份10 g豬肉和蜂蜜，按照1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μg·kg-1的加標(biāo)水平加入相應(yīng)量的CAP，按照1.4.2節(jié)相應(yīng)的樣品前處理方法制備試樣。以3倍信噪比的信號(hào)為準(zhǔn)，考查本方法最低檢測(cè)限[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MMIP的表征測(cè)定

2.1.1 磁性測(cè)定

用樣品振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)來研究所合成的Fe3O4磁性納米粒子和MMIP的磁性。圖1中曲線A和B分別是Fe3O4和MMIP的磁滯回線。兩者的曲線均經(jīng)過原點(diǎn)，顯示Fe3O4磁性納米粒子和MMIP均具有超順磁性，說明在Fe3O4磁性納米粒子表面進(jìn)行印跡后，并未影響其超順磁性。根據(jù)曲線得出Fe3O4磁性納米粒子和MMIP的飽和磁強(qiáng)度分別為49.851、21.276 A·m2·kg-1，因此，雖然在Fe3O4表面合成分子印跡殼層后磁性減弱，但仍能在磁場(chǎng)作用下快速分離，便于MMIP與樣品的分離。

圖1 Fe3O4磁性納米粒子和MMIP磁滯回線Fig.1 Magnetic hysteresis loop of Fe3O4 and MMIP

2.1.2 紅外光譜檢測(cè)

Fe3O4磁性納米粒子、Fe3O4@SiO2、雙鍵修飾的Fe3O4@SiO2和MMIP的紅外光譜表征見圖2。圖中B線在1 096cm-1的強(qiáng)峰為Si-O的伸縮振動(dòng)特征峰，說明通過第1步正硅酸乙酯的修飾，在Fe3O4磁性納米粒子表明形成了硅烷包覆膜，形成Fe3O4@SiO2。圖中C線在1 720cm-1處的吸收峰是α-不飽和酯鍵的特征吸收峰，說明通過修飾，KH570成功接枝到Fe3O4@SiO2表面，得到雙鍵修飾的Fe3O4@SiO2，為能夠在Fe3O4磁性納米粒子表面形成分子印跡殼層提供了基礎(chǔ)。圖中D線在2 975cm-1處較寬的吸收峰是羧基的特征吸收峰，說明MAA通過交聯(lián)聚合反應(yīng)在磁性納米粒子表面形成了分子印跡殼層，制備出MMIP。

圖2 Fe3O4磁性納米粒子(A)、Fe3O4@SiO2(B)、雙鍵修飾的Fe3O4@SiO2(C)和MMIP(D)的紅外光譜圖Fig.2 Infra-red spectra of Fe3O4 magnetic nanoparticles(A)，F(xiàn)e3O4@SiO2(B)，double bonds modified Fe3O4@SiO2(C) and MMIP(D)

2.1.3 掃描電子顯微鏡檢測(cè)

用掃描電鏡考查MMIP和MNIP的粒徑和形貌特征。圖3顯示，MMIP和MNIP均有良好規(guī)整的形貌，粒子的直徑在400～700 nm之間。由于粒子處于干燥狀態(tài)，所以其聚集也較為明顯。由于粒子的直徑小，因此具有較大的比表面積，使得MMIP表面印跡位點(diǎn)較多，具有較大的吸附容量，同時(shí)也有效避免了印跡位點(diǎn)包埋在聚合物內(nèi)部，有利于對(duì)CAP的吸附。同時(shí)，由于具有較大的比表面積，使得MNIP會(huì)一定程度地非特異性吸附一部分CAP。

2.2 吸附性能研究

2.2.1 吸附動(dòng)力學(xué)

為了研究合成材料的動(dòng)態(tài)吸附規(guī)律，進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。從圖4可以看出：在前60min，MMIP對(duì)CAP的吸附速度很快；60min之后，吸附量增加速度下降，基本達(dá)到吸附平衡。這是因?yàn)樵谖匠跏茧A段，MMIP表面有較多與CAP結(jié)合的位點(diǎn)，CAP可以快速和印跡位點(diǎn)結(jié)合，而在大多數(shù)印跡位點(diǎn)和CAP結(jié)合后，傳質(zhì)阻力增大，MMIP對(duì)CAP的吸附速率下降，直到達(dá)到吸附平衡。與一般的分子印跡聚合物相比，MMIP達(dá)到平衡的吸附時(shí)間較短、吸附速度快，具有較大優(yōu)勢(shì)[5]。同時(shí)，MNIP的吸附趨勢(shì)與MMIP類似，由于其表面沒有和CAP相匹配的印跡位點(diǎn)，因此很難將CAP分子牢固吸附在表面，吸附容量較小。

2.2.2 等溫吸附

為了研究聚合物的吸附特性，測(cè)定MMIP和MNIP的吸附容量對(duì)不同濃度CAP的等溫吸附曲線。圖5-A為MMIP和MNIP的等溫吸附曲線。隨著CAP濃度的升高，MMIP的平衡吸附容量隨之增高，而MNIP的吸附容量不到MMIP的一半。

圖3 MMIP(A)和MNIP(B)掃描電子顯微鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope of MMIP(A) and MNIP(B)

圖4 MMIP和MNIP吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Adsorption kinetics curves of MMIP and MNIP

采用Scatchard分析進(jìn)一步研究MMIP和MNIP的吸附情況，其方程為

Qe/ρe=(Qmax-Qe)/Kd。

(1)

式(1)中：Qmax(mg·g-1)為MMIP或MNIP的最大表觀結(jié)合量；Qe(mg·g-1)為某一濃度下，MMIP或MNIP的平衡吸附容量；ρe(mg·L-1)為達(dá)到吸附平衡時(shí)溶液中CAP的濃度；Kd(mg·L-1)為結(jié)合位點(diǎn)的解離平衡常數(shù)。

如圖5-B所示，Qe/ρe與Qe呈非線性關(guān)系，但是將左右兩部分分別進(jìn)行線性回歸，均能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。左邊的線性回歸方程為Qe/ρe=-0.997 7Qe+19.310 83(R2=0.990 5)，根據(jù)斜率和截距可求得Kd1=1.002mg·L-1，Qmax1=19.36mg·g-1；右邊的線性回歸方程為Qe/ρe=-0.256 9Qe+7.498 1(R2=0.991 8)，根據(jù)斜率和截距可求得Kd2=3.892mg·L-1，Qmax2=29.18mg·g-1。由于Kd1

由圖5-C可知，MNIP只存在1種結(jié)合位點(diǎn)，線性回歸方程為Qe/ρe=-0.010 7Qe+0.128 2(R2=0.990 4)，Kd=93.46mg·L-1，Qmax=11.98mg·g-1，其解離平衡常數(shù)遠(yuǎn)大于MMIP的Kd1和Kd2。

通過Scatchard分析的數(shù)據(jù)可以說明，MMIP存在不同的結(jié)合位點(diǎn)，在對(duì)CAP的吸附過程中具有非均一性?？赡苁怯捎诓煌Y(jié)合位點(diǎn)，功能單體與模板分子結(jié)合的比例不同，從而造成等溫吸附過程中存在不同的熱力學(xué)現(xiàn)象。在合成MNIP時(shí)，由于沒有加入模板分子，使得其對(duì)模板分子的親和力很低，也不存在不同的吸附位點(diǎn)，吸附過程為非特異性，通過比較其與MMIP的解離常數(shù)進(jìn)一步證明了MMIP為特異性吸附。

2.2.3 選擇性研究

圖5 MMIP和MNIP等溫吸附曲線(A)，以及MMIP(B)和MNIP(C)的Scatchard曲線Fig.5 Isothermal adsorption curves of MMIP and MNIP(A) and Scatchard plots of binding of methomyl onto MMIP(B) and MNIP(C)

選擇TAP和FF作為CAP的類似物來研究MMIP。圖6為MMIP和MNIP對(duì)濃度均為40mg·L-1的CAP和干擾物的吸附容量，計(jì)算印跡因子α和分離因子β：

α=QMMIP/QMNIP；

(2)

β=Q模板分子/Q干擾物分子。

(3)

式(2)、(3)中：α為印跡因子；QMMIP和QMNIP分別是MMIP和MNIP對(duì)模板分子的吸附容量；β為分離因子；Q模板分子與Q干擾物分子分別是MMIP對(duì)模板分子和干擾物分子的吸附容量。

計(jì)算可得，當(dāng)濃度為40mg·L-1時(shí)，βCAP/FF=2.84，βCAP/TAP=4.08，α=4.61，表明MMIP表面有大量與CAP相匹配的印跡位點(diǎn)，即使是結(jié)構(gòu)相類似的TAP和FF也很難被識(shí)別，進(jìn)一步表明MMIP具有特異性吸附CAP的能力，能夠在檢測(cè)中排除干擾。

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照1.3.1節(jié)的色譜條件對(duì)不同濃度的CAP標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，以濃度為自變量(x)、峰面積為因變量(y)作圖。回歸方程為y=16.679x+0.508 5，R2=0.999 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

圖6 MMIP和MNIP的選擇性吸附Fig.6 Selective adsorption of MMIP and MNIP

圖7 CAP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of CAP

2.3.2 回收率

將MMIP作為樣品前處理吸附材料對(duì)豬肉和蜂蜜進(jìn)行檢測(cè)。由表1可知，其回收率分別為86.30%～91.39%和87.13% ～94.21%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)分別為0.38%～1.75%和0.97%～1.73%。表明本方法回收率較為理想，為將MMIP運(yùn)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。

2.3.3 精密度

將MMIP作為樣品前處理吸附材料對(duì)豬肉和蜂蜜進(jìn)行精密度試驗(yàn)，每種樣品的每個(gè)加標(biāo)水平平行進(jìn)樣10次。從表2可以看出，每種樣品的每個(gè)加標(biāo)水平的RSD均低于2%，表明方法精密度較好，在對(duì)試劑樣品檢測(cè)中具有較高的可靠性，重現(xiàn)性較高。

2.3.4 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是衡量一個(gè)方法是否能用于對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)的另一個(gè)重要指標(biāo)。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，日內(nèi)間隔6h，日間間隔24h。表3表明，MMIP作為固相萃取劑的方法，日內(nèi)RSD基本小于1.1%，日間RSD不超過1.87%。表明方法具有良好的穩(wěn)定性，在實(shí)際檢測(cè)中不會(huì)因時(shí)間的變化而對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

表1 MMIP回收率試驗(yàn)

表2 MMIP精密度試驗(yàn)

表3 MMIP穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.5 檢測(cè)限

對(duì)不同加標(biāo)水平的樣品進(jìn)行檢測(cè)，以3倍信噪比信號(hào)衡量方法的檢測(cè)限。結(jié)果表明，在取樣量為10 g的情況下，以MMIP作為固相萃取劑的方法對(duì)豬肉和蜂蜜中CAP的檢測(cè)限均為3.0μg·kg-1。與傳統(tǒng)的CAP分子印跡作為固相萃取劑的檢測(cè)方法相比具有更低的檢測(cè)限[21，32-33]。圖8為豬肉和蜂蜜的加標(biāo)樣品色譜圖。

A，蜂蜜加標(biāo)樣品；B，豬肉加標(biāo)樣品。A，Standard sample of honey;B，Standard sample of pork.圖8 加標(biāo)樣品色譜圖Fig.8 Chromatogram of spiked samples

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用正硅酸乙酯和KH570兩步修飾的方法在磁性納米粒子表面合成分子印跡殼層，合成過程較為簡單。利用磁性分離，使模板分子的洗脫和萃取過程變得簡單快速方便。由于合成的粒子具有較大的比表面積，因而具有較大的吸附容量，且印跡位點(diǎn)位于粒子表面。吸附試驗(yàn)表明，MMIP的最大表觀吸附容量達(dá)到29.18mg·g-1，在60min時(shí)達(dá)到吸附平衡，達(dá)到吸附平衡時(shí)間較短，且具有較高的選擇性。將合成的MMIP作為固相萃取劑應(yīng)用于對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，方法學(xué)試驗(yàn)表明，以MMIP作為固相萃取劑的檢測(cè)方法具有良好的回收率、精密度、穩(wěn)定性和較低的檢測(cè)限，說明其具有較高的可靠性，重現(xiàn)性良好。和大多數(shù)CAP分子印跡材料相比，CAP的磁性分子印跡具有吸附容量大、吸附速度快、在磁場(chǎng)作用下易于分離、檢測(cè)限較低等優(yōu)勢(shì)，并且重現(xiàn)性更好?；谏鲜鲅芯抗ぷ?，MMIP作為一種新型的固相萃取材料，可以應(yīng)用于食品中痕量CAP殘留的檢測(cè)，并具有傳統(tǒng)固相萃取材料所不具備的優(yōu)勢(shì)：高選擇性，易分離，吸附容量大，重現(xiàn)性好。

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Preparationofmagneticmolecularlyimprintedpolymeranddetectionofchloramphenicolinfoods

LI Zengwei，WANGNa，LEI Chan，ZENG Yue，F(xiàn)U Zhenzhen，HE Li，LIU Shuliang，ZHOU Kang，AO Xiaolin，CHEN Shujuan*

(CollegeofFoodScience，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

Abstract:In the present study，magnetic separation method was combined with surface molecular imprinting.The magnetic molecularly imprinted polymer(MMIP) for chloramphenicol(CAP) was prepared by suspension polymerization method based on modified Fe3O4nanoparticles as support material，CAP as template molecule，methacrylic acid(MAA) as functional monomer，ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA) as corss-linker and azobisisobutyronitrile(AIBN) as initiator.Meanwhile，the magnetic molecularly non-imprinted polymer(MNIP) was prepared accordingly with the absent of CAP.Each step of the products were characterized by Fourier transform infrared spectrometer，microscopic morphology of MMIP and MNIP were observed by scanning electron microscopy，and the saturation magnetic strength of magnetic nanoparticles and MMIP were detected by vibrating sample magnetometer.The adsorption capacity of MMIP and MNIP were studied by binding experiments.Methodology evaluation was performed for detecting chloramphenicol in foods by using MMIP as solid phase extractant.The obtained MMIPs were 400-700 nm in diameter and had good monodispersity.It could be rapidly separated under an applied magnetic field.The MMIP had high maximum apparent adsorption capacity which was up to 29.18mg·g-1and good selectivity.It had high recovery(86.30%-94.21%)，high precision(RSD≤1.53%)，good stability(RSD≤1.87%) and low detection limit(3.0μg·kg-1),when MMIP was used as solid phase extractant.Thus，the MMIP could be used to detect the chloramphenicol residue in food.

Key words:chloramphenicol;magnetic separation;surface imprinting;solid phase extraction;high performance liquid chromatography

中圖分類號(hào)：O657.72

A

文章編號(hào)：1004-1524(2018)06-1063-10

收稿日期：2018-02-17

基金項(xiàng)目：四川省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃(201610626052)；四川省教育廳項(xiàng)目(15ZB0018)

作者簡介：李增威(1996—)，男，浙江嘉興人，食品檢測(cè)方向本科生。E-mail:981687757@qq.com

，陳姝娟，E-mail:chenshujuan1@163.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.25

(責(zé)任編輯張瑞麟)