張國漪，程 林，黃立瑩，錢琪卉，關(guān)琳琳，葉文玲，魯洪娟，冉 煒，章力干，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，安徽省農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控重點實驗室，安徽 合肥 230001；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

菌根真菌協(xié)同死谷芽孢桿菌抑制棉花黃萎病

張國漪1，程 林1，黃立瑩1，錢琪卉1，關(guān)琳琳1，葉文玲1，魯洪娟1，冉 煒2，章力干1，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，安徽省農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控重點實驗室，安徽 合肥 230001；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

摘 要：利用溫室盆缽實驗，雙接種叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)地表球囊霉(Glomusversiforme)和死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis，HJ-5)，研究AMF協(xié)同HJ-5控制棉花黃萎病的效果，并通過液相色譜法、餾分平板對峙法探析協(xié)同抗病的原因。結(jié)果表明：與對照相比，AMF和HJ-5在控制棉花黃萎病方面具有協(xié)同增效的作用，發(fā)病率下降50.82%，地下部干重增加125.00%，根際HJ-5數(shù)量增加23.80%。液相色譜分析表明，HJ-5分泌伊枯草菌素(iturin A)和表面活性素(surfactin)2種抗病性脂肽類物質(zhì)。雙接種AMF、HJ-5，棉花根際伊枯草菌素和表面活性素含量分別比HJ-5單處理增加13.38%和11.27%。接種AMF促進了植株地下部生長和HJ-5在棉花根際的定殖，并分泌更多的抗病類物質(zhì)，是AMF與HJ-5協(xié)同抗棉花枯萎病的重要機理。

關(guān)鍵詞：植物病害；經(jīng)濟作物；伊枯草菌素；表面活性素

黃萎病在世界各棉產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，被稱作棉花的“癌癥”，是制約棉花生產(chǎn)最主要的障礙?；瘜W(xué)肥料和農(nóng)藥的使用雖然對棉花黃萎病的發(fā)生有一定的防控作用，但嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境，影響農(nóng)產(chǎn)品安全，危害人類健康。生物防治不但能促進植物的生長，防治病害，并且綠色無污染，被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒╗1]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)與土壤中80%的植物形成共生體，改變植物根系形態(tài)，增加根系吸收面積，提高根表面積[2-3]。研究表明，AMF中的地表球囊霉(Glomusversiforme)對棉花黃萎病的防治效果顯著[4]。大量研究顯示，AMF和拮抗菌共同施用與拮抗菌單獨接種相比，能顯著降低各類病害的發(fā)生：AMF與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)雙接種能有效抑制番茄枯萎病的發(fā)生[5]；AMF和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)雙接種能顯著降低根結(jié)線蟲的發(fā)病率，并顯著提高植株的生物量[6]；AMF與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)雙接種能有效抑制麥類立枯病[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)，如伊枯草菌素(iturin A)和表面活性素(surfactin)等，對病原真菌具有顯著的抑制效果，是拮抗菌抑制病害的主要原因之一[8-9]。伊枯草菌素對絲狀真菌具有強烈的拮抗作用[10]。Ongena等[11]發(fā)現(xiàn)，表面活性素與伊枯草菌素等共同作用能夠顯著增強芽孢桿菌的抑菌活性。

近年來有關(guān)生物防治病害的報道越來越多，但關(guān)于死谷芽孢桿菌和AMF進行雙接種，從脂肽類物質(zhì)的角度研究協(xié)同抑病的報道較少。張慧等[12]從棉花根際分離了一株能有效抑制黃萎病的死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)菌株HJ-5。本實驗通過根際接種地表球囊霉和HJ-5，研究二者協(xié)同對棉花黃萎病的作用及機理，為棉花黃萎病的生物防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

棉花品種，新陸早八號。

土壤樣本，采自江蘇省鹽城市，全氮1.30g·kg-1，速效磷12.35mg·kg-1，速效鉀190.12mg·kg-1，有機質(zhì)10.16g·kg-1。每隔2d高壓滅菌一次供試土壤(115℃，30min)，共滅菌3次，備用。

地表球囊霉(Glomusversiforme)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。以玉米和三葉草為宿主，擴大繁殖3個月，得到含侵染根段、菌絲、根外菌絲的土沙混合物用于實驗，其平均孢子數(shù)量為65個·g-1土。

病原菌(Verticilliumdahliae)來自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號3.3758。V.dahliae孢子懸液的制備。將V.dahliae接種于液體PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20g，蔗糖20g，蒸餾水1000mL，100 kPa滅菌30min)，30℃、170r·min-1振蕩培養(yǎng)7d，菌懸液經(jīng)5層紗布過濾，得到5× 105mL-1孢子懸液。

死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)HJ-5菌株，來自CGMCC，編號1.3488。

HJ-5菌懸液的制備。接種 HJ-5于牛肉膏液體培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，用稀酸或稀堿調(diào)pH至7.0～7.2，100 kPa滅菌30min)，30℃、170r·min-1振蕩培養(yǎng)48h，9000r·min-1離心15min，去離子水懸浮沉淀稀釋至7.0× 109cfu·mL-1。

1.2 實驗設(shè)計

采用溫室盆栽實驗，設(shè)4個處理：對照(CK)，單接種菌根真菌(AMF)，單接種死谷芽孢桿菌(HJ-5)，雙接種菌根真菌和死谷芽孢桿菌(AMF+HJ-5)。每處理重復(fù)5次，生長8周后收苗，實驗重復(fù)3次，取平均值。

棉花種子用30%(體積分?jǐn)?shù))H2O2滅菌30min，去離子水沖洗干凈，用吸水紙覆蓋，放入28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至露白，轉(zhuǎn)至營養(yǎng)缽育苗。采用盆底內(nèi)徑6.0cm、高9.0cm的營養(yǎng)缽，每缽裝滅菌土400g，距土表2.0cm的土層按5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例加入AMF 20 g。對照接種等量高溫滅菌菌劑，并接種10mL無AMF菌種濾液，以保證處理和對照棉花根際具有相同的微生物區(qū)系。每個營養(yǎng)缽加入2粒棉花種子，培養(yǎng)2周后間苗至1棵，并將整個營養(yǎng)缽連土轉(zhuǎn)至5 kg對應(yīng)滅菌處理的棉花連作土壤中，接種1.0×105g-1土的V.dahliae菌懸液，混合均勻，再接種1.0×108mL·g-1HJ-5菌懸液至對應(yīng)處理盆中。

1.3 樣品采集和分析

1.3.1 植株生物量

棉花生長90d后測定棉花地下部干重(105℃殺青30min，75℃烘干至質(zhì)量恒定)。

1.3.2 病情指數(shù)

發(fā)病級數(shù)分為5級[13]：0級，單株未發(fā)??；1級，單株病葉發(fā)病率<25%；2級，單株病葉發(fā)病率為25%～50%；3級，單株病葉發(fā)病率50%～75%；4級，單株病葉發(fā)病率75%～100%。

(1)

式(1)中：D為病情指數(shù)；ai、Ni分別表示發(fā)病級數(shù)和相應(yīng)的發(fā)病株數(shù)；amax表示最高發(fā)病級數(shù)；N表示總株數(shù)。

1.3.3 AMF侵染

AMF侵染率的計算采用曲利苯藍染色法[14]。將洗凈的棉花根系放入10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))KOH溶液中保溫5～6h，用去離子水小心沖洗干凈，將根樣浸沒于1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HCl 1～2min，再次用去離子水洗凈，剪至1～2cm長片斷，放在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的曲利苯藍中充分染色，用去離子水充分洗凈，在顯微鏡下觀察并記錄每條根的浸染情況。

染色根系均勻平鋪于底部劃出0.5cm×0.5cm方格的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下計算出與格子相交(水平、豎直)的總根數(shù)中被侵染(有泡囊或叢枝)的根數(shù)，侵染形態(tài)不明顯的根系制備水片到100～400倍顯微鏡下觀察，通過MYCOCALC軟件計算侵染率[15]。

1.3.4 根際微生物數(shù)量

采用半選擇性培養(yǎng)基(326mL V8果蔬汁，33 g氯化鈉，0.8 g葡萄糖，蒸餾水490mL，pH值5.2)測定HJ-5的數(shù)量。每1000mL融化培養(yǎng)基倒皿前加抗菌素液67.5mg(含多黏菌素22.5mg和環(huán)己酰胺45mg)，采用稀釋平板計數(shù)法計數(shù)[16-17]。根際土壤中V.dahliae菌核數(shù)的測定采用選擇性培養(yǎng)基[18]：土壤浸提液25mL，K2HPO44g，KH2PO41.5g，山梨糖1g，半乳糖醛酸鈉1g，尿酸鈉0.2g，Dox鹽2mL，無氯硝基苯(PCNB)0.1g，壬基酚聚氯乙烯醚(tergitolNP-10)1 ml，瓊脂17g，蒸餾水1000mL，pH6.4～6.7。每1000mL融化培養(yǎng)基倒皿前加抗菌素液50mL(含氯霉素0.05g、鏈霉素0.05g、青霉素-G鹽0.05g)。采用稀釋平板計數(shù)法計數(shù)根際土壤微生物數(shù)量。

1.3.5 脂肽類物質(zhì)提取

HJ-5接種于改良的Landy培養(yǎng)液中(葡萄糖20.0g，L-谷氨酸5.0g，KH2PO41.0g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，F(xiàn)eSO40.15mg，蒸餾水1000mL，pH7.0)，30℃、170r·min-1振蕩培養(yǎng)48h后，10000r·min-14℃離心15min。上清液加12mol·L-1的鹽酸調(diào)pH至2.0，4℃靜置7h，12000r·min-14℃離心10min，去上清，沉淀用甲醇溶解，過0.22μm的濾膜，置-70℃冰箱待用。

1.3.6 脂肽類物質(zhì)純化、收集

利用HPLC Agilent 1200 系列的反相液相色譜柱(ZORBAX，SB-C18，9.6mm×150mm，5μm，美國)。流動相A為0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲酸，流動相B為100%乙腈，表面活性素的流動相A、B體積比為70∶30，伊枯草菌素的流動相A、B體積比為40∶60，柱溫30℃，進樣量10μL，流速1.0mL·min-1，檢測波長254 nm，按“峰”收集餾分。收集到的餾分冷凍干燥，加2mL色譜甲醇溶解，過0.22μm的有機濾膜，置-70℃冰箱中保存待用。

1.3.7 脂肽類物質(zhì)對V.dahliae的抑制作用

將V.dahliae接種至PDA平板中央，30℃培養(yǎng)5d。在距中心點約2cm的平板四角分別用打孔器打孔，并加HJ-5餾分10μL，28℃培養(yǎng)7d，測量菌落直徑，計算各餾分的抑菌能力。

1.3.8 根際伊枯草菌素和表面活性素的含量

分別將表面活性素和伊枯草菌素標(biāo)準(zhǔn)物溶于色譜甲醇中，稀釋成不同濃度梯度的溶液，經(jīng)HPLC測定制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)峰面積，分別計算得出伊枯草菌素在3.3、6.6、8.8、9.2min相應(yīng)峰，和表面活性素在3.1min所出峰的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根際樣品中抗菌脂肽的測定采用Kinsella等[16]的方法。取5.0 g根(連同黏附在根表的土)樣品放入50mL乙腈-0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲酸體積比9∶1的萃取液中，超聲萃取10min，過濾，濾液冷凍干燥，干燥所得物溶入甲醇，過0.22μm濾膜，-20℃冰箱保存，HPLC法測定。與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，計算得出含量。根際土壤伊枯草菌素含量為3.3、6.6、8.8、9.2min所出峰相對應(yīng)的含量之和。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在SPSS 11.5軟件平臺上對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，并運用最小顯著極差法(LSD)進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理對菌種和病情的影響

從表1可以看出，AMF在根際土壤中具有較高的侵染率，達到50%以上。雖然雙接種HJ-5后，AMF侵染率略有下降，但差異不顯著(P>0.05)，表明HJ-5不會對AMF侵染造成顯著影響。HJ-5接種土壤后大部分存活，具有很好的定殖能力，且接種AMF顯著(P<0.05)提高了根際土壤HJ-5定殖數(shù)量，與單接種HJ-5處理相比，定殖率增加23.80%。

根際土壤V.dahliae數(shù)量和棉花病情指數(shù)均隨HJ-5或AMF接種而顯著(P<0.05)降低。與對照相比：單接種HJ-5處理V.dahliae數(shù)量、棉花病情指數(shù)分別下降56.29%、28.73%；雙接種處理的V.dahliae數(shù)量、棉花病情指數(shù)分別下降83.71%、50.82%。表明AMF協(xié)同HJ-5能夠更好地抑制棉花黃萎病發(fā)生。

2.2 各處理對棉花生物量的影響

從表2可以看出，與對照相比，單接種HJ-5棉花地下部干重增加33.33%，雙接種處理棉花地下部干重提高125.00%，表明AMF協(xié)同HJ-5可顯著促進棉花根部生長。

2.3 HJ-5產(chǎn)伊枯草菌素和表面活性素物質(zhì)的能力

從圖1可以看出，HJ-5分泌脂肽類物質(zhì)伊枯草菌素和表面活性素。在本實驗液相條件下，伊枯草菌素標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測到4個峰，出峰時間分別為3.3、6.6、8.8、9.2min，HJ-5脂肽粗提物與伊枯草菌素標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，在3.3，6.6，8.8、9.2min均有峰出現(xiàn)；表面活性素標(biāo)準(zhǔn)樣品在本實驗液相條件檢測到3個峰，出峰時間分別為3.1、3.5、4.1min，HJ-5脂肽粗提物與表面活性素標(biāo)準(zhǔn)樣品相比較，僅在3.1min有峰出現(xiàn)。

2.4 伊枯草菌素和表面活性素餾分收集物對V.dahliae的抑制作用

表1各處理對菌根真菌侵染率、死谷芽孢桿菌數(shù)量、病原菌菌核數(shù)和病情指數(shù)的影響

Table1Effect of different treatments on AMF colonization rate，number of HJ-5 and sclerotia ofV.dahliaein rhizosphere soil，and cotton disease index

處理TreatmentAMF侵染率AMF colonization rate/%HJ-5數(shù)量Number of HJ-5/(106 cfu·g-1)V. dahliae菌核數(shù)量Number of V. dahliae sclerotia/(103 g-1)病情指數(shù)Disease index/%CK——45.00±2.00 a75.22±12.96 aAMF59.13±5.10 a—22.01±5.29 b60.97±1.67 bHJ-5—35.00±2.01 b19.67±0.57 b53.61±6.25 bAMF+HJ-553.91±5.86 a43.33±1.57 a7.33±2.08 c36.99±2.52 c

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。

Data followed by no same letters within the same column indicated significant difference atP<0.05.

表2 各處理對棉花地下部生物量的影響

將圖1中檢測到的5個脂肽類物質(zhì)出峰時間點分別按“峰”進行餾分收集，將得到的餾分樣品與V.dahliae進行平板對峙實驗(圖2)。與對照相比，收集到的不同時間點脂肽類物質(zhì)對V.dahliae的抑制率達30%以上(表3)，尤其以9.2min收集的伊枯草菌素對V.dahliae抑制效果最強，抑制率達42.67%。

2.5 各處理對根際脂肽類物質(zhì)含量的影響

第一行為標(biāo)準(zhǔn)品，第二行為HJ-5產(chǎn)物。Images were standard substances in the first row，and were yield of HJ-5 in the second row.圖1 伊枯草菌素(左)和表面活性素(右)的HPLC圖譜Fig.1 Chromatogram of iturin A(left) and surfactin(right)

A，純甲醇對照；B～E，3.3、6.6、8.8、9.2min出峰的伊枯草菌素物質(zhì)；F，3.1min出峰的表面活性素物質(zhì)。A,Pure methanol;B-E，Iturin A of 3.3，6.6，8.8，9.2min，respectively;F，Surfactin of 3.1min.圖2 HJ-5產(chǎn)伊枯草菌素和表面活性素對棉花大麗輪枝菌的平板抑制效果Fig.2 Inhibition effect of metabolized iturin A and surfactin of HJ-5 against V.dahliae on plates

表3 HJ-5產(chǎn)伊枯草菌素和表面活性素對大麗輪枝菌生長的抑制效果

柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。Bars markted without the same letters indicated significant difference at P<0.05.圖3 各處理對根際土壤中伊枯草菌素和表面活性素含量的影響Fig.3 Effect of different treatments on concentration of iturin A and surfacing in cotton rhizosphere soil

從圖3可以看出，土壤自身伊枯草菌素、表面活性素物質(zhì)含量很低。接種HJ-5后，根際土壤伊枯草菌素、表面活性素含量顯著(P<0.05)增加，且HJ-5和AMF雙接種時，伊枯草菌素、表面活性素根際含量最高。HJ-5單接種處理的伊枯草菌素、表面活性素含量分別是對照的307.70倍和20.32倍，雙接種處理的伊枯草菌素、表面活性素含量分別是對照的349.00倍和22.72倍。AMF、HJ-5雙接種與HJ-5單接種處理相比，根際土壤中伊枯草菌素和表面活性素含量分別增加13.38%和11.27%，且伊枯草菌素含量差異顯著(P<0.05)。表明AMF協(xié)同HJ-5在棉花根際產(chǎn)生了更多的脂肽類物質(zhì)。

3 討論

本研究將B.vallismortis和AMF雙接種，首次從脂肽類物質(zhì)的角度揭示協(xié)同抗病增效的原因。結(jié)果顯示，HJ-5、AMF雙接種與單接種相比，根際土壤V.dahliae菌核數(shù)量和棉花黃萎病發(fā)病指數(shù)顯著降低，說明AMF能夠協(xié)同HJ-5更好地抑制病害，這與前人研究結(jié)果一致[5-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，接種HJ-5對AMF的侵染沒有顯著影響，但接種AMF顯著促進了HJ-5的定殖，且棉花地下部生物量顯著增加。原因可能是AMF在根際形成密集的菌絲，提高了植株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[19-20]，促進了棉花根部的生長，為HJ-5提供了更多的定殖位點[21-22]，因而提高了根際HJ-5的定殖數(shù)量，增加了根際脂肽類物質(zhì)的含量。

本研究顯示，AMF與HJ-5雙接種條件下，棉花黃萎病的發(fā)病指數(shù)最低。原因可能是HJ-5在生長代謝過程中產(chǎn)生多種脂肽類物質(zhì)，導(dǎo)致病原菌菌絲畸形、病原菌數(shù)量下降。張榮勝等[23]研究發(fā)現(xiàn)，B.subtilis菌株H-74所產(chǎn)生的表面活性素能有效抑制水稻紋枯病菌的生長，具有抗真菌能力；顧真榮等[10]研究認(rèn)為，B.subtilisG3所產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)能夠抑制病原菌孢子的萌發(fā)，且能長久地抑制萌發(fā)孢子芽管伸長，表現(xiàn)出間接的抗真菌能力。Zhao等[24]發(fā)現(xiàn)，甜瓜根際接種拮抗菌，伊枯草菌素含量增加，是枯萎病發(fā)病率顯著降低的重要原因。本研究表明，HJ-5分泌的伊枯草菌素和表面活性素物質(zhì)對V.dahliae均具有顯著的抑制效果，且AMF協(xié)同HJ-5條件下，伊枯草菌素含量顯著增加。表面活性素含量增加不顯著，可能是由于HJ-5分泌的各種脂肽類物質(zhì)濃度不同所致[25]。趙青云等[25]研究表明，伊枯草菌素含量越高，抑制病原菌的效果越好。

本實驗表明，根際接種AMF促進了植株地下部的生長，增加了棉花根際HJ-5的定殖，刺激了HJ-5分泌更多的伊枯草菌素和表面活性素等抑菌物質(zhì)，有效抑制了棉花黃萎病的發(fā)生，促進了棉花的生長。綜上，單一接種AMF或HJ-5對作物連作病害的防治效果有限，而AMF協(xié)同HJ-5能通過提高根際脂肽類物質(zhì)含量，有效抑制病害的發(fā)生，為土傳病害的防治找到了新的方向。

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[1] YUAN Y，F(xiàn)ENG H，WANG L，et al.Potential of endophytic fungi isolated from cotton roots for biological control against Verticillium wilt disease[J].PloSOne，2017，12(1):e0170557.

[2] HORN S，HEMPEL S，VERBRUGGEN E，et al.Linking the community structure of arbuscular mycorrhizal fungi and plants:a story of interdependence？[J].TheISMEJournal，2017，11(6):1400-1411.

[3] ZHAO R X，GUO W，BI N，et al.Arbuscular mycorrhizal fungi affect the growth，nutrient uptake and water status of maize(ZeamaysL.) grown in two types of coal mine spoils under drought stress[J].AppliedSoilEcology，2015，88:41-49.

[4] LIU R J.Effect of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi on Verticillium wilt of cotton[J].Mycorrhiza，1995，5(4):293-297.

[5] ABO-GHALIA H H.Effect of arbuscular mycorrhizal fungusGlomusmosseaeandBacillussubtilison the infection of tomato roots byFusariumoxysporum[J].EgyptianJournalofMicrobiology，2007，42(1):29-49.

[6] TIWARI S，PANDEY S，CHAUHAN P S，et al.Biocontrol agents in co-inoculation manages root knot nematode [Meloidogyneincognita(Kofoid &White) Chitwood] and enhances essential oil content inOcimumbasilicumL.[J].IndustrialCropsandProducts，2017，97:292-301.

[7] SIASOU E，STANDING D，KILLHAM K，et al.Mycorrhizal fungi increase biocontrol potential ofPseudomonasfluorescens[J].SoilBiologyandBiochemistry，2009，41(6):1341-1343.

[8] TORRES M J，BRANDAN C P，SABATé D C，et al.Biological activity of the lipopeptide-producingBacillusamyloliquefaciensPGPBacCA1 on common beanPhaseolusvulgarisL.pathogens[J].BiologicalControl，2017，105:93-99.

[9] VERAS F F，CORREA A P F，WELKE J E，et al.Inhibition of mycotoxin-producing fungi byBacillusstrains isolated from fish intestines[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology.2016，238:23-32.

[10] 顧真榮，吳畏，高新華，等.枯草芽孢桿菌G3菌株的抗菌物質(zhì)及其特性[J].植物病理學(xué)報，2004，34(2):166-172.

GU Z R，WU W，GAO X H，et al.Antifungal substance ofBacillussubtilisstrain G3 and their properties[J].ActaPhytopathologicaSinica，2004，34(2):166-172.(in Chinese with English abstract)

[11] ONGENA M，JACQUES P，TOURé Y，et al.Involvement of fengycin-type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential ofBacillussubtilis[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2005，69(1):29-38.

[12] 張慧，楊興明，冉煒，等.土傳棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物效應(yīng)[J].土壤學(xué)報，2008，45(6):1095-1101.

ZHANG H,YANG X M,RAN W,et al.Screening of bacteria antagonistic against soil-borne cotton Verticillium wilt and their biological effects on the soil-cotton system[J].ActaPedologicaSinica,2008,45(6):1095-1101.(in Chinese with English abstract)

[13] 李社增，馬平，劉杏忠，等.利用拮抗細菌防治棉花黃萎病[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，20(5):422-425.

LI S Z，MA P，LIU X Z，et al.Biological control of cotton Verticillium wilt by antagonistic bacteria[J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity，2001，20(5):422-425.(in Chinese with English abstract)

[14] 趙斌，何紹江.微生物學(xué)實驗[M].北京：科學(xué)出版社，2002:213-214.

[15] TROUVELOT A，KOUGH J L，CIANIAZZI-PEARSON V.Physiological and genetical aspects of mycorrhizae[M].INRA Press，1986:217-221.

[16] KINSELLA K，SCHULTHESS C P，MORRIS T F，et al.Rapid quantification ofBacillussubtilisantibiotics in the rhizosphere[J].SoilBiologyandBiochemistry，2009，41(2):374-379.

[17] TURNER J T，BACKMAN P A.Factors relating to peanut yield increases after seed treatment withBacillussubtilis[J].PlantDisease，1991，75(4):347-353.

[18] AUSHER R，KATAN J，OVADIA S.An improved selective medium for the isolation ofVerticilliumdahliae[J].Phytoparasitica，1975，3(2):133-137.

[19] BAUM C，EL-TOHAMYB W，GRUDA N.Increasing the productivity and product quality of vegetable crops using arbuscular mycorrhizal fungi:a review[J].ScientiaHorticulturae，2015，187:131-141.

[20] BARRETT G，CAMPBELL C D，HODGE A.The direct response of the external mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi to temperature and the implications for nutrient transfer[J].SoilBiologyandBiochemistry，2014，78:109-117.

[21] 張國漪，丁傳雨，任麗軒，等.菌根真菌和死谷芽孢桿菌生物有機肥對連作棉花黃萎病的協(xié)同抑制[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2012，35(6):68-74.

ZHANG G Y，DING C Y，REN L X，et al.The synergetic inhibition effect of arbuscular mycorrhizal fungi cooperatedBacillusvallismortisorganic fertilizer on cotton Verticillium wilt[J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity，2012，35(6):68-74.(in Chinese with English abstract)

[22] ZHANG G Y，RAZA W，WANG X H，et al.Systemic modification of cotton root exudates induced by arbuscular mycorrhizal fungi andBacillusvallismortisHJ-5 and their effects on Verticillium wilt disease[J].AppliedSoilEcology，2013，61:85-91.

[23] 張榮勝，劉永鋒，劉郵洲，等.枯草芽孢桿菌離子突變菌株H-74脂肽類抗菌物質(zhì)對水稻抗性誘導(dǎo)作用[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，22(5) :1322-1325.

ZHANG R S，LIU Y F，LIU Y Z，et al.Effect of antibacterial lipopeptide fromBacillussubtilisH-74 on resistance induction of rice[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences.2009，22(5):1322-1325.(in Chinese with English abstract)

[24] ZHAO Q，RAN W，WANG H，et al.Biocontrol of Fusarium wilt disease in muskmelon withBacillussubtilisY-IVI[J].BioControl，2013，58(2):283-292.

[25] 趙青云.抗甜瓜枯萎病生防菌及其生物有機肥的生防機理研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

ZHAO Q Y.Mechanisms of biocontrol of muskmelon Fusarium wilt disease and plant growth enhancement by application of bio-organic fertilizer[D].Nanjing:Nanjing Agriculture University，2011.(in Chinese with English abstract)

SynergeticinhibitionagainstcottonVerticilliumwiltdiseaseofarbuscularmycorrhizalfungicooperatedwithBacillusvallismortis

ZHANG Guoyi1，CHENG Lin1，HUANG Liying1，QIAN Qihui1，GUAN Linlin1，YE Wenling1，LU Hongjuan1，RAN Wei2，ZHANG Ligan1，*

(1.SchoolofResourcesandEnvironment，AnhuiProvincialKeyLaboratoryofFarmlandEcologicalConservationandPollutionPreventionandControl，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230001，China;2.CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

Abstract:In the present study，the cooperative effect of arbuscular mycorrhiza fungi(AMF)GlomusversiformeandBacillusvallismortisHJ-5 against cotton Verticillium wilt disease was explored by greenhouse pot experiment，and the possible underlying mechanisms was revealed by high performance liquid chromatography(HPLC) and tablet test.As compared with control，AMF and HJ-5 showed synergistic inhibition against Verticillium wilt disease，as the disease index was reduced by 50.82%，root weight was increased by 125.00%，and the colonization of HJ-5 in rhizosphere was enhanced by 23.80%.HPLC analysis showed that HJ-5 could produce antifungal substances，i.e.iturin A and surfactin.Dual inoculation significantly increased the concentration of iturin A and surfactin in rhizosphere than single inoculation of HJ-5 by 13.38% and 11.27%，respectively.It was hypothesized that the main mechanism of synergetic inhibition was that AMF promoted cotton root growth，helped HJ-5 colonized in rhizosphere，and produce more antifungal lipopeptides.

Key words:plant disease;economic crop;iturin A;surfactin

中圖分類號：S435.621

A

文章編號：1004-1524(2018)06-1008-08

收稿日期：2017-06-05

基金項目：“十三五”國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0200402)；國家重點實驗室項目；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(201610364025)

作者簡介：張國漪(1984—)，女，安徽合肥人，博士，講師，主要從事土傳病害相關(guān)研究。E-mail:zhangguoyi840307@163.com

，章力干，E-mail:liganzhang@ahau.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.17

(責(zé)任編輯高 峻)