石 江，趙 琳，朱月清，樓旭平，余建忠，阮松林，陳文岳，*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024；2.杭州市臨安區(qū)林業(yè)局(農(nóng)業(yè)局)，浙江 杭州 311300；3.杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 杭州 311202；4.杭州市淳安縣農(nóng)業(yè)局，浙江 杭州 311700)

玉米幼苗葉片響應(yīng)熱脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

石 江1，趙 琳1，朱月清2，樓旭平3，余建忠4，阮松林1，陳文岳1，*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024；2.杭州市臨安區(qū)林業(yè)局(農(nóng)業(yè)局)，浙江 杭州 311300；3.杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 杭州 311202；4.杭州市淳安縣農(nóng)業(yè)局，浙江 杭州 311700)

摘 要：玉米是喜溫作物，但在生長發(fā)育過程中對高溫天氣敏感，易造成產(chǎn)量下降。以耐熱玉米品種先甜5號幼苗為實驗材料，在42℃下處理0、0.5和3.0h，提取相應(yīng)處理的葉片蛋白，進行差異蛋白的篩選，隨后對其進行GO分類和KEGG途徑分析。結(jié)果顯示，共篩選到181個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白95個(定量比值>1.20且P<0.05)，下調(diào)蛋白86個(定量比值<0.83且P<0.05)。與對照相比，隨著熱處理時間延長，上調(diào)蛋白數(shù)明顯增加，而下調(diào)蛋白數(shù)有所下降。GO分類結(jié)果顯示，2個差異上調(diào)蛋白被富集并指定分布在2個細胞組分中，18個差異上調(diào)蛋白被富集并指定具有8種分子功能，15個差異上調(diào)蛋白被富集并參與17種生物過程。而2個差異下調(diào)蛋白被富集并指定分布在8個細胞組分中，29個差異下調(diào)蛋白被富集并指定具有11種分子功能，45個差異下調(diào)蛋白參與18種生物過程。KEGG分析結(jié)果顯示，有16個差異上調(diào)蛋白被富集并指定參與6個途徑，而有14個差異下調(diào)蛋白被富集并指定參與8個途徑。Domain分析表明，有27個差異上調(diào)蛋白被富集并指定含有22個不同結(jié)構(gòu)域，而有34個差異下調(diào)蛋白被富集并指定含有21個不同結(jié)構(gòu)域。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中信息對上述相關(guān)蛋白進行搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假定Dna J分子伴侶蛋白家族、熱休克蛋白、硫氧還蛋白H型、脫氫酶和泛素結(jié)合酶5類蛋白與耐熱關(guān)系密切?？傊鲜鰺崦{迫響應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)的分析鑒定，可為進一步揭示玉米響應(yīng)熱脅迫的分子機制提供新的思路。

關(guān)鍵詞：玉米；熱響應(yīng)；蛋白質(zhì)組學(xué)；GO分類；KEGG路徑分析

玉米起源于熱帶，對溫度的適應(yīng)性較好。但是近年來，隨著氣溫不斷變暖，我國玉米產(chǎn)區(qū)的異常高溫天氣出現(xiàn)的頻率越來越高，尤其在玉米抽雄到吐絲受精階段，是夏季中最炎熱的時候，而此時也是玉米對溫度最為敏感的時期，高溫的出現(xiàn)對玉米開花、授粉及籽粒生長可造成嚴(yán)重的影響，甚至?xí)褂衩捉^產(chǎn)。因此，研究玉米對高溫的耐性機理、尋找耐熱相關(guān)的蛋白及候選基因?qū)x育耐熱玉米品種具有重要作用。Karim等[1]研究發(fā)現(xiàn)，生長在高溫下的玉米幼苗外形會比較瘦弱，葉片顏色由綠轉(zhuǎn)黃，很快出現(xiàn)早衰，葉片的生長速度變慢，地上部分的生物量減少，CO2的同化速度降低。谷胱甘肽還原酶(GR)是抗氧化酶系統(tǒng)中重要的一員，郭麗紅等[2]研究表明，在熱脅迫過程中，熱激處理過的玉米幼苗的GR活性高于未處理的幼苗，這說明熱激處理能使幼苗在逆境中保持較高的GR活性。

熱激蛋白家族(HSPs)在正常生長條件下為高水平的組成性表達，但是當(dāng)細胞處于脅迫條件如熱激或改變最適溫度，其表達水平會顯著地增加[3]。Gulli等[4]發(fā)現(xiàn)，玉米中存在與Hvhsp17同源的基因序列，該序列在熱脅迫下會被誘導(dǎo)。Jorgensen等[5]從Mo17中分離出了低分子量的HSP cDNA(Zmhsp17.2)，并發(fā)現(xiàn)在自然高溫過程中，Zmhsp17.2轉(zhuǎn)錄積累，暗示了它對玉米具有熱保護作用。Adrian等[6]研究表明，在高溫脅迫條件(42℃，4h)下，兩種22ku的HSP22蛋白含量呈現(xiàn)明顯增加趨勢，持續(xù)高溫下HSP22一直持續(xù)高表達，解除脅迫4h后HSP22蛋白表達量減半，24h后已檢測不到?？寺y序后發(fā)現(xiàn)HSP22的表達可能有效地影響植物線粒體對熱的反應(yīng)。Qin等[7]利用Microarray分析發(fā)現(xiàn)，將玉米基因ZmDREB2A轉(zhuǎn)入擬南芥后，可有4個與熱脅迫相關(guān)的基因上調(diào)了7倍，說明ZmDREB2A基因在熱激中起調(diào)節(jié)其他相關(guān)基因表達的作用。熱激蛋白基因表達主要通過熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsf)進行調(diào)控[8-10]，該調(diào)控是通過熱激轉(zhuǎn)錄因子與熱激蛋白基因啟動子區(qū)的熱激元件(heat shock elements，HSE)結(jié)合來實現(xiàn)的[11-13]，因此Hsf在傳遞逆境信號以及提高植物抗逆性方面起重要作用[14-15]。李慧聰?shù)萚16]利用同源基因克隆的方法，從42℃熱脅迫1h的玉米幼葉中克隆了玉米熱激轉(zhuǎn)錄因子基因ZmHsf06，并對其在不同器官中的表達水平及亞細胞定位進行了分析。結(jié)果顯示，42℃熱脅迫、外源脫落酸(ABA)和鹽脅迫處理均使ZmHsf06基因的表達上調(diào)。正常條件下ZmHsf06定位在細胞核，37℃熱激后也只在細胞核中觀察到GFP熒光，推測玉米ZmHsf06可能在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)玉米花粉發(fā)育，并參與對多種逆境脅迫的調(diào)控過程，所有功能的行使均在細胞核內(nèi)進行。

經(jīng)過長期的進化，植物已形成一系列用于調(diào)控自身生長發(fā)育、抵御生物和非生物脅迫逆境的機制，而轉(zhuǎn)錄因子(DREB、NAC、WRKY、MYB等)在這些調(diào)控中扮演重要的角色[17]。研究表明ZmWRKY44基因的表達受到鹽害、高溫、H2O2等非生物條件以及ABA激素的抑制，認為ZmWRKY44可能作為負調(diào)控因子參與植物的鹽害、高溫等非生物脅迫及ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)研究為系統(tǒng)而深入地認識植物高溫脅迫應(yīng)答的分子機制提供了重要信息，已在擬南芥、大豆、水稻和小麥等植物應(yīng)答高溫脅迫過程中研究蛋白質(zhì)組變化特征。共鑒定到838種響應(yīng)高溫脅迫的蛋白質(zhì)，其中534種蛋白質(zhì)表達受到高溫誘導(dǎo)，304種蛋白質(zhì)表達受到抑制[19]。目前在玉米上鮮有關(guān)于其響應(yīng)熱脅迫的蛋白質(zhì)組變化的報道。本研究選取耐熱玉米品種先甜5號，對在不同處理時間條件下幼苗葉片響應(yīng)熱脅迫的蛋白組變化進行分析，試圖尋找與玉米熱響應(yīng)脅迫相關(guān)的蛋白質(zhì)，為揭示玉米響應(yīng)熱脅迫的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取耐熱玉米品種先甜5號，該品種是由瑞士先正達培育的甜玉米單交種，已通過廣東省農(nóng)作物新品種審定。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米幼苗培養(yǎng)及高溫處理

將50粒玉米種子播于裝有基質(zhì)的盆缽中，3次重復(fù)，播種后放入智能人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，濕度為70%，24h光照。待玉米幼苗生長到12～17cm左右，葉片5～7片時進行高溫處理，處理溫度為42℃，選取0、0.5、3.0h這3個時間點，以0h為未處理的對照，每個時間點選取株高和葉片數(shù)基本一致的3株玉米剪取葉片，裝入離心管，置于超低溫冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 玉米葉片總蛋白的提取

稱取新鮮玉米葉片0.5g，用液氮研磨成粉末，裝入10mL離心管中，迅速加入5mL預(yù)冷的蛋白提取液Ⅰ(含10%三氯乙酸的丙酮溶液)進行沉淀粗蛋白(-20℃，1h)提取，期間晃勻5～6次，4℃下13000r·min-1離心20min。取沉淀物，加入10mL預(yù)冷的蛋白提取液Ⅱ(含0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液)(-20℃，1h)清洗，4℃下13000r·min-1離心20min。再重復(fù)清洗2次。取沉淀，真空抽干得粗蛋白干粉。用裂解液UTC(7mol·L-1尿素，10mmol·L-1DTT，2mmol·L-1EDTA，1mmol·L-1PMSF)溶解沉淀，室溫放置1h(渦旋5～6次)。取上清液得蛋白樣品，用改良型Bradford法測定試劑盒(酶標(biāo)法)測定蛋白濃度。

1.2.3 還原烷基化和蛋白酶解

取150μg蛋白樣品于1.5mL EP管并加入100mmol·L-1NH4HCO3至100μL，加入11μL 100mmol·L-1的二硫蘇糖醇(DTT)使其終濃度為10mmol·L-1，適度渦旋，放于37℃的金屬浴上反應(yīng)1h。加入12μL 500mmol·L-1的IAA使其終濃度為50mmol·L-1左右，避光室溫反應(yīng)30min。將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至超濾管中，4℃ 12000r·min-1離心15min。棄收集管中廢液，再向超濾管中加入150μL 100mmol·L-1NH4HCO3于4℃ 12000r·min-1離心15min。重復(fù)清洗1次。更換新的收集管，超濾管中加入100mmol·L-1NH4HCO3至總體積為100μL，按照蛋白質(zhì)量∶Trypsin =25∶1的比例加入Trypsin(1μg·μL-1)，于37℃金屬浴上過夜(12～16h)。然后于4℃ 12000r·min-1離心15min，再向超濾管中加入100μL 100mmol·L-1NH4HCO3重復(fù)離心一次即得肽段溶液。

1.2.4 除鹽

在上述肽段溶液中加入5%三氟乙酸(TFA)至其終濃度為0.1%～1%，使肽段酸化。將C18 tip 緊密固定在100μL移液器上，吸取100mL 50%乙腈(ACN)后打出，重復(fù)1次以潤濕C18填料。吸取吹打0.1%TFA 2次以平衡C18 tip。吸取吹打肽段樣品50次以達到最佳吸附效果。吸取吹打0.1% TFA/5% ACN 10次以清洗肽段樣品。依次緩慢吸取50μL 含0.1% TFA的50%、60%、70%、80% ACN以洗脫肽段，并將洗脫液收集到新的1.5mL EP管中。得到終體積200μL的樣本，真空旋轉(zhuǎn)抽干。加入80μL 0.1% TFA適當(dāng)渦旋溶解，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中上機檢測。

1.2.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

利用Easy-nano LC 1000液相儀和Q Exactive質(zhì)譜儀(ThermoScientific)進行質(zhì)譜分析。保護柱，Acclaim PepMap100(75μm內(nèi)徑×2cm長，3μm顆粒C18)；分析柱，Acclaim PepMap RSLC(50μm內(nèi)徑×15cm長，3μm顆粒C18)。液相梯度，0～4min，4%～7% B；4～66min，7%～14% B；66～88min，14%～19% B；88～104min，19%～34% B；104～120min，34%～84% B(A，0.1%FA溶于H2O；B，0.1%FA溶于ACN)。噴針電壓2.0 kV。毛細管溫度，320℃；S-lens，55%；碰撞能量，27% HCD；分辨率設(shè)置，一級70000@m/z200，二級17500@m/z200；母離子掃描范圍，m/z300-2000；子離子掃描范圍，start from m/z100。以DDA模式(Data-dependent)采集前20(TOP20)的肽段。

1.2.6 差異蛋白篩選

利用Perseus軟件(版本1.6.0.2)分析差異蛋白質(zhì)。有效值過濾條件：最小有效值為3。采用2個樣品測驗：Welch test:S0=2 both side；Permutation based FDR=0.01 report q-value；Number of randomizations=250；-log10(Pvalue)。數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)：-Log Welch’s T-testP-value>1.3(即Pvalue<0.05)；Welch’s T-test Difference>0.585(即fold change>1.5)；或Welch’s T-test Difference<-0.585(即fold change<2/3)。

1.2.7 GO分類和KEGG途徑分析

GO注釋的蛋白來源于UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)。首先，將鑒定出的蛋白ID轉(zhuǎn)化成UniProt ID，然后繪制成GO IDs，如果某些表達蛋白不能通過UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫被注釋，那么我們可以利用依賴蛋白序列比對方法的InterProScan軟件來進行分析，最后這些蛋白將通過GO注釋分為3類：生物過程、細胞組分和分子功能。GO分類的檢驗方法是費舍爾檢驗，P<0.05。

KEGG數(shù)據(jù)庫用來注釋蛋白通道。首先，利用KEGG在線服務(wù)工具(KAAS)來注釋蛋白質(zhì)的KEGG數(shù)據(jù)庫，注釋結(jié)果用KEGG在線工具(KEGG mapper)形成途徑，KEGG檢驗標(biāo)準(zhǔn)是FDR卡值，P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達蛋白質(zhì)數(shù)量分析

通過對不同處理時間下的玉米葉片進行蛋白質(zhì)組分析，共鑒定出1 996個蛋白，其中1 365個被定量分析，篩選出181個蛋白為差異顯著表達，包括95個上調(diào)蛋白和86個下調(diào)蛋白。與對照相比，隨著熱處理時間延長，上調(diào)蛋白數(shù)明顯增加，而下調(diào)蛋白數(shù)有所下降。此外，熱處理3.0h(XT3.0)的差異上調(diào)蛋白數(shù)也明顯高于熱處理0.5h(XT0.5)，而下調(diào)蛋白數(shù)兩者沒有明顯差異(表1)。

2.2 差異表達蛋白質(zhì)GO分類

2.2.1 差異上調(diào)表達蛋白質(zhì)GO分析

表1 不同處理與對照中差異表達蛋白數(shù)量

XT表示先甜5號，XT0，XT0.5，XT3.0分別表示熱處理0、0.5和3.0h。上調(diào)蛋白的定量比值>1.2，且P<0.05，下調(diào)蛋白的定量比值<0.83，且P<0.05。

XT represents Xiantian No.5.XT0，XT0.5 and XT3.0 represent three time points of heat treatment，0，0.5 and 3.0h，respectively.The quantitative ratio of the up-regulated protein was>1.2 andP<0.05.The quantitative ratio of down regulated protein was less than 0.83 andP<0.05.

接下來，我們對95個差異上調(diào)蛋白進行細胞組分、分子功能及生物過程等方面的GO分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XT3.0/XT0處理條件下，2個差異蛋白被富集并指定分布在2個細胞組分中，包括質(zhì)子轉(zhuǎn)運v型ATP酶，V1結(jié)構(gòu)域(GO：0033180)和質(zhì)子轉(zhuǎn)運v型ATP酶復(fù)合物(GO：0033176)。XT0.5/XT0處理條件下，7個差異蛋白被富集并指定具有3種分子功能，包括L-蘋果酸脫氫酶活性(GO：0030060)、蘋果酸脫氫酶的活性(GO：0016615)和蛋白結(jié)合(GO：0005515)；XT3.0/XT0處理的6個差異蛋白被富集并指定具有3種分子功能，包括核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)活性(GO：0060589)、轉(zhuǎn)運活性(GO：0005215)和跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性(GO：0022857)；XT3.0/XT0.5處理條件下，6個差異蛋白被富集并指定具有2種分子功能，包括未折疊蛋白結(jié)合(GO：0051082)和鋅離子結(jié)合(GO：0008270)。XT0.5/XT0處理條件下，2個差異蛋白被富集并參與2種生物過程，包括蘋果酸代謝過程(GO：0006108)和二元酸代謝過程(GO：0043648)；XT3.0/XT0處理條件下，10個差異蛋白被富集并參與12種生物過程，包括定位(GO：0051234)、運輸(GO：0006810)、定位(GO：0051179)、ATP水解偶聯(lián)跨膜轉(zhuǎn)運(GO：0090662)、能量耦合質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運與電化學(xué)梯度(GO：0015988)、ATP水解偶聯(lián)陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(GO：0099132)、ATP水解耦合離子跨膜轉(zhuǎn)運(GO：0099131)、ATP水解耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(GO：0015991)、應(yīng)激反應(yīng)(GO：0050896)、跨膜運輸(GO：0055085)、抗逆反應(yīng)(GO：0006950)和離子傳輸(GO：0006811)；XT3.0/XT0.5處理條件下，5個差異蛋白被富集并參與4種生物過程，包括耐熱反應(yīng)(GO：0009408)、對溫度刺激的反應(yīng)(GO：0009266)、對非生物刺激的反應(yīng)(GO：0009628)和抗逆反應(yīng)(GO：0006950)(表2)。

表2差異上調(diào)蛋白GO分類

Table2GO classification of differentially up-regulated proteins

基因分類項GO term基因分類項描述GO terms description相關(guān)蛋白Related proteins-log10(P value)細胞組分CellularcomponentXT3.0/XT0質(zhì)子轉(zhuǎn)運v型ATP酶,V1結(jié)構(gòu)域Proton-transporting V-type ATPase, V1 domain(GO:0033180)NP_001152665.1,XP_008645297.12.56質(zhì)子轉(zhuǎn)運v型ATP酶復(fù)合物Proton-transporting V-type ATPase complex(GO:0033176)NP_001152665.1,XP_008645297.12.35分子功能MolecularfunctionXT0.5/XT0L-蘋果酸脫氫酶活性L-malate dehydrogenase activity(GO:0030060)NP_001142100.1,NP_001141337.12.50蘋果酸脫氫酶的活性Malate dehydrogenase activity(GO:0016615)NP_001142100.1,NP_001141337.12.18蛋白結(jié)合Protein binding(GO:0005515)Q9FR39.1,XP_008670625.1,ACG37608.1,NP_001130694.1,NP_001152033.11.69XT3.0/XT0核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)活性Nucleoside-triphosphatase regulator activity(GO:0060589)NP_001183437.1,NP_001152033.12.26轉(zhuǎn)運活性Transporter activity(GO:0005215)NP_001152665.1,Q84RL7.2,XP_008645297.1,NP_001104949.11.94跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性Transmembrane transporter activity(GO:0022857)NP_001152665.1,XP_008645297.1,NP_001104949.11.50XT3.0/XT0.5未折疊蛋白結(jié)合Unfolded protein binding(GO:0051082)AFW67420.1,XP_008670278.1,NP_001135416.31.52鋅離子結(jié)合Zinc ion binding(GO:0008270)NP_001132009.1,XP_008677172.1,NP_001292782.11.44生物過程BiologicalprocessXT0.5/XT0蘋果酸代謝過程Malate metabolic process(GO:0006108)NP_001142100.1,NP_001141337.12.30二元酸代謝過程Dicarboxylic acid metabolic process(GO:0043648)NP_001142100.1,NP_001141337.11.85XT3/XT0定位Establishment of localization(GO:0051234)NP_001152665.1,Q84RL7.2,NP_001183437.1,XP_008645297.1,ACG41076.1,NP_001104949.12.69

續(xù)表2

XT表示先甜5號，XT0、XT0.5、XT3.0分別表示熱處理0、0.5和3.0h。所有GO項的P值小于0.05，相反，所有GO項的-log10P值均大于1.301 0，即-log10P值越大，則越顯著。下同。

XT represents Xiantian No.5.XT0，XT0.5 and XT3.0 represent three time points of heat treatment，0，0.5 and 3.0h，respectively.Pvalues of all GO terms are lower than 0.05.Conversely，-log10(Pvalue) values of all GO terms are greater than 1.301 0，that is，the greater -log10(Pvalue) value，the better significance.The same as below.

2.2.2 差異下調(diào)表達蛋白質(zhì)GO分析

同樣，我們對86個差異下調(diào)表達蛋白進行細胞組分、分子功能及生物過程等方面的GO分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XT0.5/XT0處理條件下，2個差異蛋白被富集并指定分布在8個細胞組分中，包括細胞器內(nèi)膜(GO：0019866)、線粒體內(nèi)膜(GO：0005743)、線粒體膜(GO：0031966)、線粒體外膜(GO：0005740)、線粒體部分(GO：0044429)、細胞器膜(GO：0031090)、外膜(GO：0031975)和細胞器外膜(GO：0031967)。XT0.5/XT0處理條件下，11個差異蛋白被富集并指定具有9種分子功能，包括鐵離子結(jié)合(GO：0005506)、通過合并或降低分子氧來作用于配對的供體的氧化還原酶活性(GO：0016705)、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性(GO：0003755)、順反異構(gòu)酶活性(GO：0016859)、血紅素結(jié)合(GO：0020037)、四吡咯結(jié)合(GO：0046906)、異構(gòu)酶活性(GO：0016853)和氧化還原酶活性(GO：0016491)；XT3.0/XT0處理條件下，11個差異蛋白被富集并指定具有8種分子功能，包括過氧化物酶活性(GO：0004601)、以過氧化氫作為受體的氧化還原酶活性(GO：0016684)、抗氧化活性(GO：0016209)、血紅素結(jié)合(GO：0020037)、四吡咯結(jié)合(GO：0046906)、氧化還原酶活性(GO：0016491)、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性(GO：0003755)和順反異構(gòu)酶活性(GO：0016859)。XT3.0/XT0.5處理條件下，15個差異蛋白被富集并指定具有8種分子功能，包括蘋果酸脫氫酶的活性(GO：0016615)、氧化還原酶活性(GO：0016491)、以銅蛋白為受體，作用于二元酚和有關(guān)物質(zhì)為供體的氧化還原酶活性(GO：0052880)、Plastoquinol-質(zhì)體藍素還原酶活性(GO：0009496)、L-蘋果酸脫氫酶活性(GO：0030060)、氧化還原酶活性，NAD或NADP作為受體，作用于供體的CH-OH組(GO：0016616)、氧化還原酶活性，作用于供體的CH-OH組(GO：0016614) 和糖原(淀粉)合成酶活性(GO：0004373)。XT0.5/XT0處理條件下，13個差異蛋白參與10種生物過程，包括肽氨基酸修飾(GO：0018193)、細胞蛋白修飾過程(GO：0006464)、高分子變性(GO：0043412)、蛋白變性過程(GO：0036211)、光合作用，光反應(yīng)(GO：0019684)、肽基脯氨酸修(GO：0018208)、蛋白肽基脯氨酰異構(gòu)化(GO：0000413)、前體代謝產(chǎn)物和能量的產(chǎn)生(GO：0006091)、氧化還原過程(GO：0055114)和電子傳遞鏈(GO：0022900)。XT3.0/XT0處理條件下，18個差異蛋白參與14種生物過程，包括氧化應(yīng)激反應(yīng)(GO：0006979)、耐壓反應(yīng)(GO：0006950)、肽氨基酸修飾(GO：0018193)、應(yīng)激反應(yīng)(GO：0050896)、氧化還原過程(GO：0055114)、細胞蛋白修飾過程(GO：0006464)、蛋白修飾過程(GO：0036211)、高分子變性(GO：0043412)、肽基脯氨酸修飾(GO：0018208)、蛋白肽基脯氨酰異構(gòu)化(GO：0000413)、單體代謝過程(GO：0044710)、檸檬酸循環(huán)(GO：0006099)、檸檬酸代謝過程(GO：0006101)和有氧呼吸(GO：0009060)。XT3.0/XT0.5處理條件下，18個差異蛋白參與8種生物過程，包括氧化還原過程(GO：0055114)、二元酸代謝過程(GO：0043648)、蘋果酸代謝過程(GO：0006108)、單體代謝過程(GO：0044710)、單一的生物過程(GO：0044699)、蛋白肽基脯氨酰異構(gòu)化(GO：0000413)、肽基脯氨酸修飾(GO：0018208)和肽氨基酸修飾(GO：0018193)(表3)。

2.3 差異表達蛋白質(zhì)的KEGG分析

2.3.1 差異上調(diào)表達蛋白質(zhì)的KEGG分析

為了明確95個差異上調(diào)蛋白的功能，我們對其進行KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XT0.5/XT0處理條件下，有3個差異蛋白被富集并指定參與3個途徑，包括在生物光合作用中的碳固定-大豆gmx00710基因、半胱氨酸和蛋氨酸代謝-大豆gmx00270基因和檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))-大豆gmx00020基因；XT3/XT0處理條件下，有6個差異蛋白被富集并指定參與2個途徑，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白加工-大豆gmx04141基因和吞噬體-大豆gmx04145基因；XT3/XT0.5處理條件下，有10個差異蛋白被富集并指定參與2個途徑，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白加工-大豆gmx04141基因和泛素介導(dǎo)的蛋白水解-大豆gmx04120基因(表4)。

2.3.2 差異下調(diào)表達蛋白質(zhì)的KEGG分析

表3差異下調(diào)蛋白的GO分類

Table3GO classification of differentially down-regulated proteins

基因分類項GO term基因分類項描述GO terms description相關(guān)蛋白Related proteins-log10(P value)細胞組分Cellular componentXT0.5/XT0細胞器內(nèi)膜Organelle inner membrane(GO:0019866)CAA26600.1, NP_001151372.12.65線粒體內(nèi)膜Mitochondrial inner membrane(GO:0005743)CAA26600.1, NP_001151372.12.65線粒體膜Mitochondrial membrane(GO:0031966)CAA26600.1, NP_001151372.12.29線粒體外膜Mitochondrial envelop(GO:0005740)CAA26600.1, NP_001151372.12.18線粒體部分Mitochondrial part(GO:0044429)CAA26600.1, NP_001151372.12.13細胞器膜Organelle membrane(GO:0031090)CAA26600.1, NP_001151372.12.13外膜Envelope(GO:0031975)CAA26600.1, NP_001151372.12.08細胞器外膜Organelle envelope(GO:0031967)CAA26600.1,NP_001151372.12.08分子功能Molecular functionXT0.5/XT0鐵離子結(jié)合Iron ion binding(GO:0005506)NP_001105244.1, NP_001105255.12.44通過合并或降低分子氧來作用于配對的供體的氧化還原酶活性O(shè)xidoreductase activity, acting on paired donors, with incorpora-tionor reduction of molecular oxygen(GO:0016705)NP_001105244.1, NP_001105255.12.44肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity(GO:0003755)XP_008645736.1, NP_001149265.12.08順反異構(gòu)酶活性Cis-trans isomerase activity(GO:0016859)XP_008645736.1, NP_001149265.12.08血紅素結(jié)合Heme binding(GO:0020037)NP_001105244.1, ACG48334.1,NP_001105255.12.00四吡咯結(jié)合Tetrapyrrole binding(GO:0046906)NP_001105244.1, ACG48334.1,NP_001105255.11.88異構(gòu)酶活性Isomerase activity(GO:0016853)XP_008645736.1, NP_001168977.1,NP_001149265.11.75氧化還原酶活性O(shè)xidoreductase activity(GO:0016491)P05643.2, NP_001105244.1,NP_001157807.1, NP_001105255.1,CBD26786.1, AFW83444.1,NP_001151372.11.63XT3.0/XT0過氧化物酶活性Peroxidase activity(GO:0004601)NP_001241719.1, NP_001132505.1,XP_008667271.1, NP_001151992.2,NP_001131430.13.97以過氧化氫作為受體的氧化還原酶活性O(shè)xidoreductase activity, acting on peroxide as acceptor(GO:0016684)NP_001241719.1, NP_001132505.1,XP_008667271.1, NP_001151992.2,NP_001131430.13.84抗氧化活性Antioxidant activity(GO:0016209)NP_001241719.1, NP_001132505.1,XP_008667271.1, NP_001151992.2,NP_001131430.13.29血紅素結(jié)合Heme binding(GO:0020037)NP_001241719.1, NP_001132505.1,XP_008667271.1, NP_001131430.12.52四吡咯結(jié)合Tetrapyrrole binding(GO:0046906)NP_001241719.1, NP_001132505.1,XP_008667271.1, NP_001131430.12.37氧化還原酶活性O(shè)xidoreductase activity(GO:0016491)NP_001132505.1, XP_008667271.1,DAA59498.1, CBD26786.1,NP_001131430.1, NP_001241719.1,DAA48574.1, DAA48359.1,NP_001151992.21.82肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity(GO:0003755)CBD32860.1, NP_001149265.11.82順反異構(gòu)酶活性Cis-trans isomerase activity(GO:0016859)CBD32860.1, NP_001149265.11.82XT3.0/XT0.5蘋果酸脫氫酶的活性Malate dehydrogenase activity(GO:0016615)NP_001142100.1, NP_001152396.1,DAA63735.1, NP_001141337.14.38

續(xù)表3

續(xù)表3

表4差異上調(diào)蛋白KEGG途徑分析

Table4KEGG pathway analysis of differentially up-regulated proteins

處理名稱Treatment name代謝途徑KEGG-pathway相關(guān)蛋白Related protein-log10(P value)XT0.5/XT0在生物光合作用中的碳固定-大豆gmx00710 基因gmx00710 Carbon fixation in photosynthetic organisms-Glycine max(soy-bean)XP_008677788.1,NP_001142100.1,NP_001141337.12.26半胱氨酸和蛋氨酸代謝-大豆gmx00270基因gmx00270 Cysteine and methionine metabolism-Glycine max(soybean)NP_001142100.1,NP_001141337.11.81檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))-大豆gmx00020基因gmx00020 Citrate cycle(TCA cycle)-Glycine max(soybean)NP_001142100.1,NP_001141337.11.43XT3/XT0內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白加工-大豆gmx04141基因gmx04141 Protein processing in endoplasmic reticulum-Glycine max(soy-bean)XP_008670278.1,NP_001183165.1,P24067.3,DAA44894.11.95吞噬體-大豆gmx04145 基因gmx04145 Phagosome-Glycine max(soybean)NP_001152665.1,XP_008645297.11.42XT3/XT0.5內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白加工-大豆gmx04141基因gmx04141 Protein processing in endoplasmic reticulum-Glycine max(soy-bean)ACG35158.1,NP_001183165.1,NP_001105583.1,NP_001130454.1,XP_008670278.1,AFW67420.1,NP_001135416.3,CBM38941.1,P24067.34.51泛素介導(dǎo)的蛋白水解-大豆gmx04120基因gmx04120 Ubiquitin mediated proteolysis-Glycine max(soybean)ACG35158.1,NP_001148188.12.02

同樣，我們對86個差異表達蛋白進行KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XT0.5/XT0處理條件下，有6個差異蛋白被富集并指定參與2個途徑，包括α-亞麻酸代謝-大豆gmx00592基因和光合作用-天線蛋白-大豆gmx00196基因；XT3.0/XT0處理條件下，有3個差異蛋白被富集并指定參與2個途徑，包括谷胱甘肽代謝-大豆gmx00480基因和抗壞血酸和aldarate代謝-大豆gmx00053基因；XT3.0/XT0.5處理條件下，有5個差異蛋白被富集并指定參與4個途徑，包括半胱氨酸和蛋氨酸代謝-大豆gmx00270基因、乙醛酸鹽代謝-大豆gmx00630基因、丙酮酸代謝-大豆gmx00620基因和在生物光合作用中的碳固定-大豆gmx00710基因(表5)。

2.4 差異表達蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域(Domain)分析

2.4.1 差異上調(diào)表達蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析

為了明確95個差異上調(diào)蛋白在結(jié)構(gòu)上是否存在共同點，我們對其進行Domain分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XT0.5/XT0處理條件下，有4個差異蛋白被富集并指定含有4個不同結(jié)構(gòu)域，包括乳酸脫氫酶/糖苷水解酶，家族4，C-末端、乳酸/蘋果酸脫氫酶，N-末端、乳酸/蘋果酸脫氫酶，C-末端和NAD(P)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；XT3.0/XT0處理條件下，有9個差異蛋白被富集并指定含有9個不同結(jié)構(gòu)域，包括ATP酶-F1/V1/A1復(fù)合物-α/β亞基-N末端結(jié)構(gòu)域、ATP酶-F1/V1/A1復(fù)合物-α/β亞基-核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、三四氨基酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域、類似螺旋結(jié)構(gòu)域、含三磷酸核苷水解酶的結(jié)合環(huán)、翻譯延伸因子EF1A/起始因子IF2γ-C末端、熱激蛋白70ku-C端結(jié)構(gòu)域、熱激蛋白70ku-肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和類似翻譯延伸因子EFTu-2結(jié)構(gòu)域；XT3.0/XT0.5處理條件下，有19個差異蛋白被富集并指定含有13個不同結(jié)構(gòu)域，包括α晶狀體蛋白/HSP20結(jié)構(gòu)域、水孔蛋白、HSP20同類伴侶、泛素結(jié)合酶E2、熱激蛋白70ku-C端結(jié)構(gòu)域、熱激蛋白70ku-肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、類似組氨酸激酶的ATP酶-C末端結(jié)構(gòu)域、熱激蛋白HSP90-N末端、泛素結(jié)合酶/類似RWD、CCHC類型鋅指結(jié)構(gòu)、三四氨基酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域、硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域和類似螺旋結(jié)構(gòu)域(表6)。

2.4.2 差異下調(diào)表達蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析

表5差異下調(diào)蛋白途徑分析

Table5Pathway analysis of differentially down-regulated proteins

處理Treatments代謝途徑KEGG-pathway相關(guān)蛋白Related protein-log10(P value)XT0.5/XT0α-亞麻酸代謝-大豆gmx00592 基因gmx00592 alpha-Linolenic acid metabolism-Glycine max(soybean)NP_001105244.1,NP_001105255.1,CBD26786.13.69光合作用-天線蛋白-大豆gmx00196基因gmx00196 Photosynthesis - antenna proteins-Glycine max(soybean)DAA58853.1,NP_001105502.1,CDI44325.12.57XT3.0/XT0谷胱甘肽代謝-大豆gmx00480 基因gmx00480 Glutathione metabolism-Glycine max(soybean)NP_001132505.1,XP_008667271.1,NP_001151992.22.07抗壞血酸和aldarate代謝-大豆gmx00053基因gmx00053 Ascorbate and aldarate metabolism-Glycine max(soybean)NP_001132505.1,XP_008667271.11.64XT3.0/XT0.5半胱氨酸和蛋氨酸代謝-大豆gmx00270基因gmx00270 Cysteine and methionine metabolism-Glycine max(soybean)ACG41594.1,NP_001142100.1,NP_001141337.12.2乙醛酸鹽代謝-大豆gmx00630基因gmx00630 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism-Glycine max(soybean)NP_001142100.1,NP_001148591.1,NP_001141337.11.45丙酮酸代謝-大豆gmx00620基因gmx00620 Pyruvate metabolism-Glycine max(soybean)NP_001142100.1,NP_001152396.1,NP_001141337.11.43在生物光合作用中的碳固定-大豆gmx00710 基因gmx00710 Carbon fixation in photosynthetic organisms-Glycine max(soybean)NP_001142100.1,NP_001152396.1,NP_001141337.11.38

表6差異上調(diào)表達蛋白的Domain分析

Table6Domain analysis of differentially up-regulated proteins

處理Treatments結(jié)構(gòu)域描述Domain description相關(guān)蛋白Related protein-log10(P value)XT0.5/XT0乳酸脫氫酶/糖苷水解酶,家族4,C-末端Lactate dehydrogenase/glycoside hydrolase, family 4, C-terminalNP_001142100.1,NP_001141337.12.53乳酸/蘋果酸脫氫酶,N-末端Lactate/malate dehydrogenase, N-terminalNP_001142100.1,NP_001141337.12.53乳酸/蘋果酸脫氫酶,C-末端Lactate/malate dehydrogenase, C-terminalNP_001142100.1,NP_001141337.12.53NAD(P)結(jié)合結(jié)構(gòu)域NAD(P)-binding domainXP_008677788.1,NP_001142100.1,NP_001150639.1,NP_001141337.12.00XT3.0/XT0ATP酶,F1/V1/A1復(fù)合物,α/β亞基,N-末端結(jié)構(gòu)域ATPase, F1/V1/A1 complex, alpha/beta subunit, N-terminal domainNP_001152665.1,XP_008645297.12.02ATP酶,F1/V1/A1復(fù)合物,α/β亞基,核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域ATPase, F1/V1/A1 complex, alpha/beta subunit, nucleotide-binding domainNP_001152665.1,XP_008645297.11.93三四氨基酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域Tetratricopeptide repeat-containing domainNP_001151932.1,NP_001149790.1,1.93類似螺旋結(jié)構(gòu)域Tetratricopeptide-like helical domainNP_001151932.1,NP_001149790.1,1.77含三磷酸核苷水解酶的結(jié)合環(huán)P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolaseNP_001152665.1,CBM38382.1,XP_008645297.1,NP_001136994.1,NP_001149568.21.70

續(xù)表6

同樣，我們對86個差異表達蛋白進行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XT0.5/XT0處理條件下，有9個差異蛋白被富集并指定含有5個不同結(jié)構(gòu)域，包括葉綠素a/b結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域、親環(huán)蛋白類似結(jié)構(gòu)域、親環(huán)素類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域、硫氧還蛋白折疊和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-N末端；XT3.0/XT0處理條件下，有9個差異蛋白被富集并指定含有5個不同結(jié)構(gòu)域，包括血紅素過氧化物酶，植物/真菌/細菌、親環(huán)素類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域、親環(huán)蛋白類似結(jié)構(gòu)域、分泌過氧化物酶和RNA識別結(jié)構(gòu)域；XT3.0/XT0.5處理條件下，有19個差異蛋白被富集并指定含有13個不同結(jié)構(gòu)域，包括α晶狀體蛋白/HSP20結(jié)構(gòu)域、水孔蛋白、HSP20同類伴侶、泛素結(jié)合酶E2、熱激蛋白70ku-C端結(jié)構(gòu)域、熱激蛋白70ku-肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、組氨酸激酶樣ATP酶-C末端結(jié)構(gòu)域、熱激蛋白HSP90-N末端、泛素結(jié)合酶/類似RWD、CCHC類型鋅指結(jié)構(gòu)、三四氨基酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域、硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域和類似螺旋結(jié)構(gòu)域(表7)。

表7差異下調(diào)表達蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

Table7Domain analysis of differentially down-regulated proteins

處理Treatments域描述Domain description相關(guān)蛋白Related protein-log10(P value)XT0.5/XT0葉綠素a/b結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域Chlorophyll a/b binding protein domainDAA58853.1,NP_001105502.1,CDI44325.12.44親環(huán)蛋白類似結(jié)構(gòu)域Cyclophilin-like domainXP_008645736.1,NP_001149265.11.90親環(huán)素類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域Cyclophilin-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase domainXP_008645736.1,NP_001149265.1,1.90硫氧還蛋白折疊Thioredoxin-like foldNP_001151414.1,NP_001104979.2,ACG35158.1,ACG45880.11.82谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶,N-末端Glutathione S-transferase, N-terminalNP_001151414.1,NP_001104979.21.32XT3/XT0血紅素過氧化物酶,植物/真菌/細菌Haem peroxidase, plant/fungal/bacterialNP_001241719.1,NP_001132505.1,XP_008667271.1,NP_001131430.13.15親環(huán)素類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域Cyclophilin-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase domainCBD32860.1,NP_001149265.11.80親環(huán)蛋白類似結(jié)構(gòu)域Cyclophilin-like domainCBD32860.1,NP_001149265.11.80分泌過氧化物酶Secretory peroxidaseNP_001241719.1,NP_001131430.11.46RNA識別結(jié)構(gòu)域RNA recognition motif domainXP_008676441.1,ACN29319.1,ACN25391.11.39XT3/XT0.5α晶狀體蛋白/HSP20結(jié)構(gòu)域Alpha crystallin/Hsp20 domainNP_001146967.1,CBM38941.1,NP_001105583.1,NP_001130454.12.51水孔蛋白Aquaporin-likeQ84RL7.2,Q9ATM6.12.40HSP20同類伴侶HSP20-like chaperoneNP_001146967.1,CBM38941.1,NP_001105583.1,NP_001130454.12.26泛素結(jié)合酶E2Ubiquitin-conjugating enzyme E2ACG35158.1,NP_001148188.12.19熱激蛋白70 ku,C端結(jié)構(gòu)域Heat shock protein 70 ku, C-terminal domainNP_001183165.1,XP_008654914.1,P24067.32.12熱激蛋白70 ku,肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域Heat shock protein 70 ku, peptide-binding domainNP_001183165.1,XP_008654914.1,P24067.32.04組氨酸激酶樣ATP酶,C-末端結(jié)構(gòu)域Histidine kinase-like ATPase, C-terminal domainXP_008670278.1,NP_001135416.32.02熱激蛋白HSP90,N-末端Heat shock protein Hsp90, N-terminalXP_008670278.1,NP_001135416.32.02泛素結(jié)合酶/類似RWD Ubiquitin-conjugating enzyme/RWD-likeACG35158.1,NP_001148188.12.02CCHC類型鋅指結(jié)構(gòu)Zinc finger, CCHC-typeNP_001132009.1,XP_008677172.11.76三四氨基酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域Tetratricopeptide repeat-containing domainNP_001151932.1NP_001149790.11.57硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域Thioredoxin domainACG35158.1,CBM39951.1,ACG45880.11.49類似螺旋結(jié)構(gòu)域Tetratricopeptide-like helical domainNP_001151932.1,NP_001149790.11.42

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，差異上調(diào)蛋白和差異下調(diào)蛋白中均無共同細胞組分，但兩者均具有蘋果酸脫氫酶和L-蘋果酸脫氫酶活性的分子功能，也具有共同參與蘋果酸代謝過程(GO：0006108)、應(yīng)激反應(yīng)(GO：0050896)、二元酸代謝過程(GO：0043648)和抗逆反應(yīng)(GO：0006950)生物過程，尤其是上調(diào)表達蛋白中AFW67420.1和CBM38382.1蛋白，它們是與耐熱反應(yīng)(GO：0009408)和對溫度刺激的反應(yīng)(GO：0009266)相關(guān)的蛋白。

KEGG分析發(fā)現(xiàn)，差異上調(diào)蛋白和差異下調(diào)蛋白均參與生物光合作用中的碳固定-大豆gmx00710與半胱氨酸和蛋氨酸代謝-大豆gmx00270基因的代謝途徑，與之相關(guān)的蛋白有XP_008677788.1、NP_001142100.1、NP_001141337.1、ACG41594.1和NP_001152396.1，而NP_001142100.1和NP_001141337.1蛋白在上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白相同代謝途徑中均發(fā)揮作用，說明在玉米響應(yīng)熱脅迫中需要這些途徑中的不同蛋白表達上調(diào)與下調(diào)保持平衡，可能與玉米更好地維持生長與熱脅迫響應(yīng)的平衡有關(guān)。除了上述途徑之外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白加工和泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑也參與玉米響應(yīng)熱脅迫過程，這與以往植物通過蛋白質(zhì)合成與周轉(zhuǎn)途徑變化來應(yīng)對高溫脅迫的機制[19]基本一致。

Domain分析發(fā)現(xiàn)，差異上調(diào)蛋白與差異下調(diào)蛋白有很多相同的結(jié)構(gòu)域，包括α晶狀體蛋白/HSP20結(jié)構(gòu)域、水孔蛋白、HSP20同類伴侶、泛素結(jié)合酶E2、熱激蛋白70ku-C端和肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、熱激蛋白HSP90-N末端、泛素結(jié)合酶/類似RWD、三四氨基酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域、類似螺旋結(jié)構(gòu)域、CCHC類型鋅指結(jié)構(gòu)域和硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，其中許多含有與熱激蛋白相類似的結(jié)構(gòu)域，且與這些功能相關(guān)的蛋白有19個，包括：NP_001146967.1、CBM38941.1、NP_001105583.1等。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中信息對上述相關(guān)蛋白進行搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白可大致分為5類，分別為假定Dna J分子伴侶蛋白家族、熱休克蛋白、硫氧還蛋白H型、脫氫酶和泛素結(jié)合酶類，其中熱休克蛋白有HSP1、16.9ku Ⅰ型HSP 1、Ⅰ型HSP3、HSP82、HSP81-1、HSP26等，而以往并未對這些熱休克蛋白有研究報道，今后可深入對其進行研究。

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Proteomicanalysisofmaizeseedlingleavesinresponsetoheatstress

SHI Jiang1，ZHAO Lin1，ZHU Yueqing2，LOU Xuping3，YU Jianzhong4，RUAN Songlin1，CHEN Wenyue1，*

(1.HangzhouAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310024，China;2.Lin’anDistrictForestryBureau(AgriculturalBureau)ofHangzhou，Hangzhou311300，China;3.AgriculturalScienceandTechnologyInstituteofXiaoshanDistrictofHangzhouCity，Hangzhou311202，China;4.AgriculturalBureauofChun’anCountyofHangzhouCity，Hangzhou311700，China)

Abstract:Maize is a warm-tempered crop，but it is sensitive to high temperature weather during its growth and development，which is easy to cause the decline of yield.In this study，seedlings of a heat-resistant maize variety Xiantian No.5 as experimental materials were treated for 0，0.5，3.0h at 42℃，and leaf proteins from all treatments was extracted to carry out screening of differential proteins，and then the GO classification and KEGG pathway were analyzed.The results showed that 181 proteins including 95 up-regulated proteins(quantitative ratio>1.20 andP<0.05) and 86 down-regulated proteins(quantitative ratio<0.83 andP<0.05) were identified.Compared with the control，the number of up-regulated proteins increased with the increase of heat treatment time，while the number of down-regulated proteins decreased.GO classification indicated that in these differentially up-regulation proteins，there were 2 proteins enriched and designated to 2 cell components，18 proteins enriched and designated to 8 molecular functions and 15 proteins enriched and involved in 17 biological processes.Similarly，in differentially down regulated proteins，there were 2 proteins enriched and distributed in 8 cell components，29 proteins were enriched and designated to 11 molecular functions.45 proteins involved in 18 biological processes.KEGG pathway analysis revealed that 16 differentially up-regulated proteins were enriched and designated to participate in 6 pathways，while 14 differentially down-regulated proteins were enriched and designated to participate in 8 pathways.Domain analysis revealed that 27 differentially up-regulated proteins were enriched and designated to 22 various domains，while 34 differentially down-regulated proteins were enriched and designated to 21 different domains.According to the searching information in NCBI database，we found that 5 proteins of Dna J molecular chaperone family including heat shock protein，thioredoxin H type，dehydrogenase and ubiquitin binding enzyme were likely to be closely related to heat resistance.In conclusion，identification of proteins related to heat stress response can provide an insight to further revealing the underlying molecular mechanism of maize response to heat stress.

Key words:maize;heat response;proteomics;GO classification;KEGG pathway analysis

中圖分類號：S513

A

文章編號：1004-1524(2018)06-0893-16

收稿日期：2018-02-15

作者簡介：石江(1969—)，男，浙江紹興人，副研究員，主要從事旱糧作物育種與栽培研究。E-mail:569546851@qq.com

，陳文岳，E-mail:21572608@qq.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.03

(責(zé)任編輯張 韻)