劉謙等

摘 要：建立固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定熏腸中苯并（α）芘的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)Cleanert BaP-3固相萃取柱凈化、濃縮，C18色譜柱進(jìn)行分離。結(jié)果表明：苯并（α）芘在線性范圍0.5～10 ng/mL內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于0.99，最低檢出限為0.06 ?g/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，回收率97.8%～107.0%。本方法快速簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，可以用于熏腸中苯并（α）芘含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：苯并（α）芘；熏腸；固相萃取

Abstract： A high performance liquid chromatography with solid-phase extraction method was developed for the determination of benzo（α）pyrene in smoked sausage. The extracted sample was purified on a Cleanert BaP-3 solid-phase extraction column and separated on a C18 column. Benzo（α）pyrene was measured using a fluorescence detector at an excitation wavelength of 384 nm and an emission wavelength of 406 nm. The resultsshowed that benzo（α）pyrene displayed good linearity relationship over the concentration range of 0.5–10 ng/mL， with a coefficient correlation of 0.99. The limit of detection was 0.06 μg/kg， and the precision was below 5%. The average recoveries for blank spiked samples were in the range of 97.8%—107.0%. This method was rapid， simple， reproducible， and applicable for benzo（α）pyrene determination in smoked sausage.

Key words： benzo（α） pyrene； smoked sausage； solid-phase extraction

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2015）03-0020-03

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201503005

熏腸是人們生活中非常喜愛的食品，但是在加工過程中，有機(jī)物會(huì)產(chǎn)生不完全燃燒現(xiàn)象并在肉制品表面沉積，脂肪、蛋白質(zhì)等有機(jī)物在高溫下的分解會(huì)產(chǎn)生多環(huán)芳類物質(zhì)?，F(xiàn)在已知的熏烤肉制品中多環(huán)芳烴類物質(zhì)中苯并（α）芘是一種強(qiáng)致癌物[1-4]，它是多環(huán)芳烴類中毒性最大的一種，其毒性超過黃曲霉毒素。它對(duì)人體健康危害巨大，被人體的腸道吸收后，容易導(dǎo)致皮膚癌等疾病。許多國(guó)家已經(jīng)規(guī)定其相應(yīng)的膳食攝入量和食品的限量標(biāo)準(zhǔn)，德國(guó)規(guī)定肉制品中其限量為1.0 μg/kg[5-6]，GB2762—2012《食品中污染物限量》限定其在肉制品中最高殘留量為5.0 μg/kg。

由于熏腸中的苯并（α）芘含量較低，含油脂多，基體復(fù)雜，干擾成分也多，在分析中干擾現(xiàn)象比較嚴(yán)重[7-9]。目前在實(shí)際工作中使用到的檢測(cè)方法有

GB/T 5009.27—2003《食品中苯并（α）芘的測(cè)定》，NY/T 1666—2008《肉制品中苯并（α）芘的測(cè)定》，

GB/T 22509—2008《動(dòng)植物油脂：苯并（α）芘的測(cè)定：反相高效液相色譜法》。根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的學(xué)習(xí)、實(shí)驗(yàn)條件的摸索和已有文獻(xiàn)的分析，GB/T 5009.27—2003因?yàn)槭褂脽晒夤舛群湍繙y(cè)，操作過程中使用的溶劑量大，準(zhǔn)確度低[10]；NY/T1666—2008雖然分離效果好，檢出限低，但是因?yàn)槭褂枚啻苇h(huán)己烷反萃取，回收率不高[11]；而

GB/T22509—2008中采用中性氧化鋁自裝柱，在實(shí)驗(yàn)中制作了柱子，但氧化鋁等級(jí)難以控制，自裝柱柱效不穩(wěn)定，石油醚洗脫過程繁瑣，收集的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后還繼續(xù)使用氮吹和再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后使用乙腈-四氫呋喃轉(zhuǎn)移定容，回收率低[12-14]。已有文獻(xiàn)報(bào)道中提取肉制品中的苯并（α）芘的方法主要有液液萃取法、GPC凈化法、C18固相萃取法[15-20]。本實(shí)驗(yàn)采用專用的Cleaner tBaP-3固相萃取柱，對(duì)原有的方法進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行優(yōu)化，回收率穩(wěn)定、準(zhǔn)確度更高、方法的專屬性更強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熏腸 市購(gòu)。

苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg/mL）（編號(hào)SB05-194-2008） 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；正己烷、乙腈、四氫呋喃均為色譜純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT液相色譜儀 日本島津制作所；KQ-500型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；氮吹儀 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；CleanertBAP-3固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

吸取100 μL 20μg/mL儲(chǔ)備液用甲醇定容到100 mL，配制20 ng/mL的儲(chǔ)備液。移取25、50、100、250、500 μL質(zhì)量濃度為20 ng/mL的儲(chǔ)備液，用四氫呋喃稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其線性范圍為0.5～10 ng/mL。

1.3.2 色譜條件

C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相乙腈∶水體積比為88∶12；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 ?L；熒光檢測(cè)器：發(fā)射波長(zhǎng)406 nm，激發(fā)波長(zhǎng)384 nm；柱溫40 ℃。

1.3.3 樣品處理

1.3.3.1 樣品制備

取熏腸樣品，放入粉碎機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取粉碎樣品10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入25 mL正己烷溶解，旋渦混合均勻，超聲處理15 min，

5 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至燒杯中，向殘?jiān)性偌尤?5 mL正己烷，重復(fù)上述步驟，合并兩次上清液，濃縮到5.0 mL待凈化。

1.3.3.2 BAP-3固相萃取柱凈化

用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化固相萃取柱。將1.3.3.1節(jié)中待凈化液上樣到Cleanert BAP-3柱上，然后再用2.0 mL正己烷潤(rùn)洗燒杯，將潤(rùn)洗液也上樣到柱上。用10 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液。5 mL二氯甲烷洗脫，將洗脫液收集于玻璃試管中。將洗脫液在40 ℃條件下氮?dú)獯蹈?，? mL四氫呋喃定容，超聲10 s，過0.45 ?m微孔濾膜，收集于2 mL樣品瓶中，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 洗脫溶劑的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選出有代表性的二氯甲烷、正己烷、異丙醇。固定樣品的前處理的其他條件，分別用上述3種溶劑對(duì)填加了苯并（α）芘的小柱進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)使用二氯甲烷的洗脫力比正己烷和異丙醇更強(qiáng)，因此使用二氯甲烷作為洗脫溶劑。實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步對(duì)洗脫溶劑量分析，使用2.0、5.0、8.0、10.0 mL進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)5.0 mL即能對(duì)樣品進(jìn)行充分洗脫，因此選用5.0 mL作為洗脫體積。

2.2 固相萃取柱的選擇

趙冰等[3]使用Welchrom C18E（200 mg/3 mL）Welchrom BaP萃取柱，回收率在87.6%以上；林慧等[4]使用HiCapt Benzo（500 mg/3 mL）和CleanertBaP的小柱，回收率也在70%以上。上述3 種固相萃取柱是以中性氧化鋁作為填料，對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的樣品如香油等出現(xiàn)過回收不穩(wěn)定的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)使用CleanertBaP-3采用高分子印記填料，具有更強(qiáng)的專屬性，且處理過程中使用5.0 mL二氯甲烷和5.0 mL正己烷作為活化溶劑，上樣之后使用10.0 mL正己烷淋洗，最后使用5.0 mL二氯甲烷洗脫，將洗脫液吹干后用乙腈定容，可以直接上機(jī)檢測(cè)。整個(gè)過程使用溶劑量減小，且操作簡(jiǎn)單、樣品回收情況較穩(wěn)定。

2.3 檢測(cè)結(jié)果分析

2.4 檢出限和定量限

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液適當(dāng)稀釋后制得一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣分析，以RSN=3作為檢出限，苯并（α）芘的檢出限為0.06 μg/kg；以RSN=10作為定量限，苯并（α）芘的定量限為0.2 ?g/kg。

2.5 工作曲線和線性范圍

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3.2節(jié)色譜條件上機(jī)測(cè)定，計(jì)算線性回歸方程，其中，橫坐標(biāo)為檢測(cè)樣品含量（X），縱坐標(biāo)為樣品檢測(cè)出峰的峰面積（Y）。得回歸方程為Y=2.569×10―5X+2.487×10―2，相關(guān)系數(shù)為0.990以上。

2.6 回收率

取空白熏肉樣品18 份，按0.3、0.6、3.0 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平加標(biāo)，按照1.3.3節(jié)樣品處理方法處理樣品，按照1.3.2節(jié)色譜條件上機(jī)測(cè)定，測(cè)得苯并（α）芘的加標(biāo)回收率見表1。加標(biāo)回收率在97.8%～107.0%，回收結(jié)果比較滿意，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。

3 結(jié) 論

本研究采用凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)熏腸中苯并（α）芘殘留量進(jìn)行測(cè)定，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：苯并（α）芘在線性范圍0.5～10 ng/mL 內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于0.99，最低檢出限為0.06 ?g/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，回收率97.8%～107.0%。本方法快速簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，可以用于熏腸中苯并（α）芘含量的測(cè)定。

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