張延平 姜春麗 蔣興旺 李麗娜 宋徽 劉金偉 于麗玫

老年性聾（presbycusis）或年齡相關(guān)性聽力下降(age-related hearing loss)是人體老化過程在聽覺器官中的表現(xiàn)[1]。隨著人口老齡化的加重，老年性耳聾發(fā)病率不斷增加，據(jù)統(tǒng)計，世界上每3個65歲以上成年人中就有一個患有聽力障礙，在60～74歲的老年人中，老年性耳聾的病例高達(dá)30%～50%[2]。聽力障礙嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，因此，老年性耳聾的防治已經(jīng)成為研究的熱點。目前認(rèn)為老年性耳聾屬于多基因病范疇，具有高度的異質(zhì)性，是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，個體遺傳背景在一定程度上決定了老年性耳聾表型的差異[3，4]，不同的遺傳背景代表了不同的遺傳易感性，如何判斷老年性耳聾易感個體成為研究者關(guān)注的問題。目前針對老年性耳聾遺傳易感性分子機制的研究較少，進(jìn)展相對緩慢。本文應(yīng)用弱陽離子磁珠和MALDI-TOF/TOFMS技術(shù)篩選并鑒定老年性耳聾易感個體血清差異蛋白，初步探討了老年性耳聾易感個體血清差異蛋白表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究老年性耳聾易感個體的發(fā)生機制和篩選提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集解放軍第309醫(yī)院眼科及耳鼻喉科2015年1月～2015年11月非耳科疾病住院患者78例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡大于或等于60歲；②排除傳染病史、中耳炎疾病史、耳毒性藥物服用史、遺傳性耳聾、突發(fā)性耳聾、噪聲性耳聾病史；③排除腦血管意外、阿爾茲海默病等嚴(yán)重全身疾病。行全身查體、?？茩z查及純音測聽檢查，空腹抽取靜脈血，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器及試劑 MALDI-TOF質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)及自帶的BioExplorer軟件(德國Bruker公司)，磁力架（磁珠分離器）(德國Bruker公司)，磁珠試劑盒(SB-WCX)以及緩沖液體系（德國布魯克.道爾頓公司），NanoAcuity超高壓納升級液相色譜（Waters公司），LTQ-Qrbitrap質(zhì)譜儀 （Thermo Scientific公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 Z值的計算 選取符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的患者，使用純音測聽儀（丹麥，Madsen VOYAGER 502型）于耳鼻喉科聽力檢查室進(jìn)行純音測聽，逐一測聽1000、2000、4000、8000、1000、500、250 Hz共6個頻率的純音氣導(dǎo)聽閾。參照聲學(xué)聽閾與年齡關(guān)系的統(tǒng)計分布(GB/T 7582-2004/ISO 7029：2000)國家標(biāo)準(zhǔn)將頻率特異性聽閾轉(zhuǎn)換為Z值（Z值為在給定頻率上個體實際聽閾與中位聽閾的差異），將每個研究對象按照Z值進(jìn)行排序，選取最好的聽力樣本作為對照組（即非易感組），最差的聽力樣本作為病例組（即易感組）。樣本的選取依據(jù)Z值得大小進(jìn)行。按照Z值的大小進(jìn)行排序，Z值排列處于最頂端與最底端的分別匯入對照組與病例組。Z值的計算公式如下：

其中Hmd，Y指聽閾中值；md，Y代表年齡的中位數(shù)；Y代表指定年齡；α指男性和女性的系數(shù)，可以在GB/T 7582-2004/ISO 7029：2000（聲學(xué) 聽閾與年齡關(guān)系的統(tǒng)計學(xué)分布）中查找。參照GB/T 7582-2004/ISO 7029：2000，得知中值以上的分布為近似標(biāo)準(zhǔn)偏差是Su的高斯分布，中值以下的分布近似標(biāo)準(zhǔn)偏差是Sl的高斯分布。上述參數(shù)bu和bl的值可在GB/T 7582-2004/ISO 7029：2000表2中查找。按照上述計算公式，當(dāng)Z值大于0時為易感者，Z值小于0時為非易感者。因老年性耳聾患者主要是出現(xiàn)高頻聽力的下降，所以在計算中多采用Z248（即分別算出2 kHz、4 kHz和8 kHz對應(yīng)的Z值，再計算其平均數(shù)即為Z248）[5，6]。

1.2.2 研究對象 共選出易感者52例，非易感者26例，共78例樣本，隨機選取50例組成建模組（易感者30例，非易感者20例）、28例組成模型驗證組（易感者22例，非易感者6例）。其中實驗組男性19例，女性33例，平均年齡71.5±7.85；對照組男性20例，女性6例，平均年齡70.69±7.23。52例患者按聽力損失程度按照世界衛(wèi)生組織（WHO1997）聽力障礙分級標(biāo)準(zhǔn)可分為輕度31例，中度20例，重度1例。易感組52例中患2型糖尿病3人、高血壓病3人、同時患2型糖尿病和高血壓病1人；非易感組26例中患2型糖尿病2人、高血壓病1人，口服二甲雙胍5人、口服硝苯地平緩釋片6人、阿司匹林腸溶片10人（抽血前1周停藥）。易感組與非易感組年齡、性別、合并全身疾病情況相比，均無顯著性差異（P＜0.05）。所有的受試對象簽署知情同意書，實驗方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.3 血清的采集及處理 采集受試對象空腹外周靜脈血約4 ml，用臨床離心機以3000 r／m離心7 min，立即凍存血清樣品于-80 ℃冰箱中。自4℃冰箱取出磁珠試劑盒，取200 μl 八連排樣品管置于孔板上，依次加入10 μl磁珠，加入95 μl磁珠結(jié)合緩沖液，加入10 μl血清樣本，在室溫靜置5 min，將樣品管在磁珠分離器上靜置1 min，磁珠富集到管底并貼壁，與懸浮的液體分離，液體應(yīng)該變?yōu)槌吻?，吸去上清的液體。將樣品放入孔板中，加入100 μl磁珠清洗液緩沖液，靜置2 min。然后將樣品管在磁珠分離器上靜置1 min，吸去上清液體。將樣品放置于孔板上，加入10 μl磁珠洗脫液反復(fù)吸打十次以上，放置5 min，使磁珠和洗脫液混懸均勻。將樣品放于磁珠分離器上，靜置1 min，使磁珠與懸浮液充分分離，將上清液移出到已標(biāo)記的0.2 ml樣品管，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.4 差異蛋白的鑒定 質(zhì)譜儀按照以下參數(shù)檢測肽段信號：正離子模式，以及掃描范圍400～1500Da，二級掃描范圍依賴于一級母離子質(zhì)核比自動選擇，離子源電壓2900 V。獲得質(zhì)譜圖后輸入proteome discoverer 1.4（PD，thermo）軟件，軟件先對質(zhì)譜譜圖進(jìn)行篩選，然后用mascot進(jìn)行搜索，搜索結(jié)束后，PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析。定量參數(shù)設(shè)置如下：肽段取值方法和標(biāo)準(zhǔn)化方法均為中位數(shù)，差異倍數(shù)大于1.2倍、P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 出峰差異顯著性統(tǒng)計

建模組50個血清多肽樣品，共分析出104個峰，其中有任一樣品中峰強度高于300 Da的多肽峰個數(shù)為40個。利用軟件對病例與對照組的血清蛋白指紋圖譜進(jìn)行分析對比后得到出峰差異性有統(tǒng)計學(xué)意義的有9個（P＜0.05），分子量分別為4047.1 Da、2957.1 Da、4084.5 Da、4260.1 Da、2102.9 Da、1288 Da、3276 Da、4146.2 Da、3153.4 Da，其中6個表達(dá)上調(diào)，3個表達(dá)下調(diào)（見表1）。

2.2 差異蛋白的鑒定

9個差異多肽峰中，通過搜庫鑒定出8個，未鑒定出4047.1多肽峰。去除血清高峰度蛋白IgG，7個多肽分別代表5種蛋白，分別為載脂蛋白J、胰蛋白酶抑制劑、血小板生成素、補體C4b和角蛋白（hornerin）。具體多肽序列及相關(guān)信息見表1。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，50%以上的超過80歲的老年人有25 dB或以上的聽力損失，聽力下降正在嚴(yán)重影響老年人的生理和心理健康[7]，降低其生活質(zhì)量，研究老年性耳聾的發(fā)生機制和有效的防治措施已經(jīng)刻不容緩。在研究老年性耳聾過程中人們發(fā)現(xiàn)，盡管隨著年齡的增加聽覺敏感度逐漸下降，但是聽閾的變化在人群中還是具有很大的差異，40%～50%的老年性耳聾與遺傳有關(guān)[8]，于是尋找老年性耳聾易感基因就成了研究者探索老年性耳聾發(fā)病機制的熱點。

近年，基因水平研究老年性耳聾發(fā)病機制的進(jìn)展緩慢。目前研究者主要使用候選基因關(guān)聯(lián)分析和全基因關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行老年性耳聾易感基因的篩選，其中候選基因關(guān)聯(lián)分析是研究中常用的方法，通過此方法發(fā)現(xiàn)的易感基因包括NAT2，GSTT1，GATM1，GTHL2，GRM7，CDH23等[9]。由于老年性耳聾發(fā)病機制復(fù)雜，牽涉多個基因、基因與基因的相互作用以及基因與環(huán)境的相互作用等方面，許多已經(jīng)發(fā)表的研究所得結(jié)論差異性較大，因此Fransen等[10]提出老年性耳聾可能從本質(zhì)上是高度多基因化的，可能并不存在某個主要基因起作用的可能。

蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步提供了篩選差異蛋白的方法，為探討老年性耳聾易感性、篩選易感個體帶來新的希望。已有研究選用弱陽離子磁珠結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)篩選老年性耳聾易感者與非易感者血清差異蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的多肽峰有9個（P＜0.05），其中6個在易感組中上調(diào)，3個下調(diào)，并利用編號為55和49的兩個多肽建立了老年性耳聾易感個體診斷模型[6]。本研究在上述基礎(chǔ)上進(jìn)一步對差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行了鑒定，結(jié)果提示載脂蛋白J、胰蛋白酶抑制劑、血小板生成素、補體C4b和角蛋白（hornerin）在老年性耳聾易感個體血清中存在差異性表達(dá)，有可能成為老年性耳聾易感個體血清特異性標(biāo)記物。

載脂蛋白J（apolipoprotein j，ApoJ）又稱clusterin，是由CLU基因編碼的糖基化α-β異源二聚體細(xì)胞外伴侶蛋白，主要存在于人高密度脂蛋白和極高密度脂蛋白中，在多種組織中都有表達(dá)，其中在腦組織中含量最高，主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。ApoJ的生理功能錯綜復(fù)雜，主要是通過伴侶作用清除細(xì)胞碎片和錯誤折疊蛋白執(zhí)行細(xì)胞保護(hù)功能，還可以作為細(xì)胞信使作用調(diào)節(jié)促凋亡通路，從而促進(jìn)脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)、抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞間相互作用[11]。動物實驗研究結(jié)果提示CLU在內(nèi)耳的發(fā)育和正常聽覺功能維持中可能起重要作用[12，13]，ApoJ可能參與了阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病病理過程[11]，而病例對照研究顯示聽力減退是阿爾茲海默病的危險因素[14]，提示兩種疾病具有一定的相關(guān)性。我們的研究結(jié)果顯示在老年性耳聾易感個體血清中，ApoJ表達(dá)上調(diào)，提示該蛋白也可能參與了老年性耳聾這種神經(jīng)退行性病變的發(fā)生和發(fā)展過程，易感個體可能希望通過上調(diào)ApoJ來保護(hù)聽覺相關(guān)的神經(jīng)元、清除細(xì)胞內(nèi)垃圾，因此可能對聽功能具有保護(hù)作用。

表1 差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)

血小板反應(yīng)素（thrombospondin，TSP）是一類三聚體調(diào)節(jié)性糖蛋白，也是一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，參與了細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的信息交流，在細(xì)胞表面調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，并在組織和細(xì)胞的生長和分化中起重要作用。TSP-1是TSP家族中重要的一員，具有促進(jìn)粒細(xì)胞趨化反應(yīng)、促進(jìn)血小板激活和聚集、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖等作用[15]，與腫瘤[15]、糖尿病[16]、腎臟疾病[17]等的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，目前還未見到與耳聾相關(guān)的報道，本研究發(fā)現(xiàn)在老年性耳聾易感者血清中TSP表達(dá)下調(diào)，提示血管因素與老年性耳聾的發(fā)生可能存在密切相關(guān)性，積極改善血管狀態(tài)有助于減緩老年性耳聾進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸和金屬蛋白酶家族在中耳炎的發(fā)生中起重要作用，其蛋白酶抑制劑可以抑制中耳炎癥反應(yīng)進(jìn)程，為了評價其安全性，有研究將α1抗胰蛋白酶制劑直接注射入南美洲栗鼠聽泡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥物對內(nèi)耳未造成明顯毒性作用，提示α1抗胰蛋白酶制劑治療中耳慢性炎癥具有潛在的價值和較高的安全性[18]。角蛋白和補體C4b均未見到與耳聾相關(guān)的報道。

上述5種蛋白在老年性耳聾易感者血清中出現(xiàn)差異性表達(dá)，提示這些分子有可能成為老年性耳聾易感個體特異性血清標(biāo)志物，其在老年性耳聾發(fā)病機制中所起的作用還需要進(jìn)一步研究。

老年性耳聾主要由聽覺器官老化所致，這一過程快慢不一，是生物的恒定規(guī)律，老年性耳聾發(fā)生與多種原因有關(guān)，但存在個體差異性[19]。是否合并全身疾病是影響老年性耳聾發(fā)生的重要因素之一，普遍認(rèn)為患有糖尿病、高血壓等疾病的老年人身體機能減退發(fā)生率顯著高于無上述疾病的老年人[19]，為了排除干擾因素、更好地研究遺傳易感性在老年性發(fā)生機制中的作用，我們的研究在選取研究對象時進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選，將患有多種老年疾病的患者排除在外，并在抽血采樣前停用阿司匹林腸溶片1周，使易感組和非易感組具有更強的可比性，結(jié)果也更有利于反映個體遺傳易感性。因此本次研究鑒定的5個老年性耳聾易感個體血清差異有可能成為老年性耳聾易感個體篩選的血清特性分子生物標(biāo)記物，本文為進(jìn)一步研究老年性耳聾發(fā)病機制提供了實驗數(shù)據(jù)，上述結(jié)果還需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。

[1]周彬，徐鵬，崔忠濤，等.哈爾濱地區(qū)老年性耳聾與 GRHL2 基因SNP位點的相關(guān)性[J].中華耳科學(xué)雜志，2015，13（3）：529-532.

[2]胡鈺娟. 線粒體DNA4834缺失突變在內(nèi)耳擬老化模型中的作用及其機制研究[D].華中科技大學(xué)，2007.

[3]Van Laer L，Van Eyken E，F(xiàn)ransen E，et al.The grainyhead like 2 gene (grhl2)，alias tfcp2l3，is associated with age-related hearing impairment[J].Hum Mol Genet，2008，17(2)：159-227.

[4]Viljanen A，Era P，Kaprio J，et al.Genetic and environmental influences on hearing in older women[J].J Gerontol A Bid Sci Med Sci，2007，62(4)：447-452.

[5]Fransen E，Van Laer L，Lemkens N，et al.A novel Z-scorebased method to analyze candidate genes for age-related hearing impairment[J].Ear Hear，2004，25（2）：133-141.

[6]姜春麗，張延平，劉金偉，等.老年性耳聾易感個體血清差異蛋白的篩選[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志.2016，24（6），549-553.

[7]Christensenk，F(xiàn)rederiksen H，Hoffman HJ.Genetic and environmental influences on self-reported reduced hearing in the old and oldest[J].J Geriatr Soc，2001，49(11)：1512-1517.

[8]Zhu M，Yang T，Wei S，et a1.Mutations in the γ-actfn gene(ACTGl) are associated with dominant progressive deafness(DFNA20/26)[J].Am J Hum Genet，2003，75(5)：1082-1091.

[9]姜春麗，張延平，于麗玫.人類老年性耳聾遺傳易感性研究進(jìn)展[J].中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志，2015，13(6)：443-448.

[10]Fransen，E，Bonneux，S，Corneveaux JJ，et al.Genome-wide association analysis demonstrates the highly polygenic character of age-related hearing impairment[J].Eur J Hum Genet，2015，23（1）：110-115.

[11]徐艷，李輝華.載脂蛋白J與神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系的研究進(jìn)展[J].南昌大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2013，53（11）：94-99.

[12]Lee S，Shin JO，Sagong B，et al.Spatiotemporal expression patterns of clusterin in the mouse inner ear[J].Cell Tissue Res，2017，370(1)：89-97.

[13]Xue T，Wei L，Zha DJ，et al.Exposure to acoustic stimuli promotes the development and differentiation of neural stem cells from the cochlear nuclei through the clusterin pathway[J].Int J Mol Med. 2015，35(3)：637-644.

[14]Hung SC，Liao KF，Muo CH，et al.Hearing Loss is Associated With Risk of Alzheimer’s Disease：A Case-Control Study in Older People[J]. J Epidemiol 2015，25(8)：517-521.

[15]張露丹.Ang-2、TSP-1在子宮頸癌組織中的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系[D].鄭州大學(xué)，2012，32-34.

[16]季肖麗，姚圣蜜，王倩，等.血小板反應(yīng)素-1與糖尿病心肌病關(guān)系研究[J].中國老年學(xué)雜志，2014，11（34）：6229-6230.

[17]陳芷珉，鄭法雷.血小板反應(yīng)蛋白1的作用及與腎纖維化的關(guān)系[J].國際泌尿系統(tǒng)雜志，2008，28（1）：91-95.

[18]Antonelli PJ，Schultz GS，Sundin DJ，et al.Protease inhibitors alpha1-antitrypsin and ilomastat are not ototoxic in the chinchilla[J].Laryngoscope，2003，113(10)：1764.

[19]于麗玫，孫勍.老年性耳聾相關(guān)機制[J].中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志，2008，6(2)：64-67.