包 云 ，盛 翔 ，張家碩 ，李 敏 ，李亞男 ，徐倩南 ，李成濤 ，陳麗琴

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 215123；4.溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035）

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）具有高度多態(tài)性，結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)可快速完成檢測(cè)，已成為法醫(yī)DNA分型的主流遺傳標(biāo)記及主要檢測(cè)技術(shù)[1-2]。目前，法醫(yī)DNA領(lǐng)域常染色體STR商品化試劑盒多達(dá)十余種，可檢測(cè)的遺傳標(biāo)記包括CODIS核心STR基因座、拓展CODIS基因座，歐洲核心（European Standard Set，ESS） STR基因座及補(bǔ)充ESS基因座[3]。

2017年，司法鑒定科學(xué)研究院（原司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所）針對(duì)中國漢族人群的特點(diǎn)，結(jié)合SF/Z JD0105001—2016《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》對(duì)案件檢測(cè)提出的最新要求，開發(fā)了一款可并行擴(kuò)增21個(gè)常染色體STR基因座、DYS391基因座和Amelogenin性別基因座的檢測(cè)試劑盒，即SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)。21個(gè)常染色體STR基因座中包含了全部CODIS基因座（13個(gè)）和5個(gè)拓展CODIS基因座（D1S1656、D2S1338、D10S1248、D12S391、D19S433），并將拓展CODIS基因座中的D2S441和D22S1045替換成在中國漢族人群中多態(tài)信息含量更為豐富的Penta D和Penta E基因座，另外，還加入了針對(duì)漢族人群開發(fā)的多態(tài)性STR基因座D6S1043[4]。

為有效評(píng)估上述STR基因座在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用效力，本研究擬通過大樣本調(diào)查及大量案件的應(yīng)用，分析上述STR基因座的遺傳學(xué)參數(shù)信息、突變信息及這一檢測(cè)試劑盒的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本

收集本實(shí)驗(yàn)室采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］檢測(cè)后親子鑒定意見為支持的3198例華東地區(qū)案例，其中三聯(lián)體859例，二聯(lián)體2339例。案件樣本均為漢族，且簽署知情同意書。

對(duì)上述案件采用SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)（司法鑒定科學(xué)研究院）進(jìn)行檢測(cè)。其中，三聯(lián)體案件中被檢父親與被檢母親認(rèn)為系無關(guān)個(gè)體，則含有無關(guān)個(gè)體1 718名；二聯(lián)體案件中選擇被檢孩子作為無關(guān)個(gè)體，則產(chǎn)生2339名無關(guān)個(gè)體。采用隨機(jī)函數(shù)法從中選擇2000名個(gè)體（男性1000名，女性1000名）進(jìn)行群體遺傳學(xué)調(diào)查。

1.2 DNA提取和STR分型

采用GA/T 383—2014《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》中Chelex-100法對(duì)樣本基因組進(jìn)行DNA提取[5]。用SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為 10 μL，包括：2×PCR 反應(yīng)預(yù)混液Ⅴ 5 μL，5×SiFaSTRTM23 引物混合物 2 μL，6×Enhancer 1.6 μL，DNA 模板 1 μL，去離子水 0.4 μL。 擴(kuò)增條件為：95℃ 5min預(yù)變性；95℃ 15s，61℃ 30 s，72℃ 30 s，29個(gè)循環(huán)；60℃ 30 min延伸；15℃保存。選用9700型PCR儀（美國AB公司）的MAX模式進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl基因分析儀（美國AB公司）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，采用GeneMapperTMID-X軟件進(jìn)行基因分型。

1.3 突變基因座的確定

根據(jù)SF/Z JD0105001—2016《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》，確定親子關(guān)系的案件要求累積父權(quán)指數(shù)（CPI）大于10000，其中不符合遺傳規(guī)律的基因座視為突變基因座。本研究中當(dāng)采用SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)對(duì)親子鑒定樣本進(jìn)行21個(gè)常染色體STR基因座檢測(cè)無法滿足CPI〉10000時(shí)，采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)22NC試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］進(jìn)行補(bǔ)充檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Modified-Powerstates軟件[6]對(duì)21個(gè)常染色體STR基因座進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，獲得21個(gè)常染色體STR基因座的等位基因、等位基因頻率、個(gè)體識(shí)別率（DP）、多態(tài)信息含量（PIC）等群體遺傳學(xué)參數(shù)。采用Arlequin v3.5.2.2軟件計(jì)算期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho），并完成 STR 基因座之間連鎖不平衡分析；三聯(lián)體非父排除率（PEtrio）、二聯(lián)體非父排除率（PEduo）、三聯(lián)體累積非父排除率（CPEtrio）及二聯(lián)體累積非父排除率（CPEduo）按照司法部發(fā)布的SF/Z JD0105001—2016《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》計(jì)算；累積個(gè)體識(shí)別率（CDP）、基因多樣性（GD）參照文獻(xiàn)[1]計(jì)算。

使用網(wǎng)站（http://statpages.org/confint.html）在線計(jì)算突變率和 95%置信區(qū)間（95%CI）[7]，并通過 SPSS 13.0軟件分析各基因座之間突變率的差異。通過STRbase 網(wǎng)站（http://www.cstl.nist.gov/strbase/）查閱21個(gè)常染色STR基因座的突變率，并使用SPSS 13.0軟件分析本研究報(bào)道的突變率與該突變率是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 等位基因分布情況

通過對(duì)2 000名隨機(jī)漢族無關(guān)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)分析，21個(gè)常染色體STR基因座共檢出289個(gè)等位基因，1252種基因型，等位基因頻率范圍為0.0003～0.5225，其中Penta E基因座檢出的等位基因最多，為27個(gè)，TH01基因座檢出的最少，為7個(gè)。DYS391基因座共檢出5個(gè)等位基因，等位基因頻率范圍為0.0040～0.7290，GD 為 0.4189，DYS391與 Amelogenin基因座性別基因完全匹配，在女性樣本中未發(fā)現(xiàn)DYS391基因座擴(kuò)增產(chǎn)物。21個(gè)常染色體STR基因座及DYS391基因座的等位基因及其頻率分布詳見表1。

表1 21個(gè)常染色體STR基因座及DYS391基因座的等位基因頻率分布 （n=2000）

表1（續(xù)）

2.2 群體遺傳學(xué)參數(shù)

經(jīng)Bonferroni校正后，21個(gè)常染色體STR基因座的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05）。

21個(gè)常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)見表2，其中 Ho為 0.6175～0.9270，DP 為 0.7964～0.9869，PIC為0.5611～0.9123。經(jīng)Arlequin v3.5.2.2軟件分析，各基因座之間相互獨(dú)立，屬于連鎖平衡狀態(tài)，可以運(yùn)用乘積定理計(jì)算，CDP 為 0.999999999999999，CPEduo為0.999997431701961，CPEtrio為 0.999999999654865。

表2 21個(gè)常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=2000）

2.3 突變情況

3198例華東地區(qū)支持親子關(guān)系的案件中，共觀察到4 057次減數(shù)分裂，21個(gè)常染色體STR基因座上有85 197次等位基因傳遞。本次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：有73例案件存在突變，其中3例出現(xiàn)2個(gè)STR基因座同時(shí)發(fā)生突變；除D13S317和D10S1248基因座外，其余19個(gè)基因座上共發(fā)生76次等位基因傳遞不平衡，突變率為 0.2465×10-3～2.711 4×10-3。 19 個(gè)常染色體STR基因座中突變率最高的基因座為FGA（95%CI為1.40×10-3～4.80×10-3），突變率最低的基因座為 D7S820、Penta D 和 TPOX（95%CI為 0～1.40×10-3），21 個(gè)常染色體STR基因座的平均突變率為0.8921×10-3（95%CI為 0.70×10-3～1.10×10-3），各基因座的突變情況見表3。

表3 21個(gè)常染色體STR基因座在華東地區(qū)漢族人群中的突變來源及突變率

對(duì)各STR基因座的突變率經(jīng)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，χ2=51.704，P〈0.05，提示各基因座的突變率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，與STRbase網(wǎng)站可查閱的基因座突變率數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除D13S317和TH01外，其余基因座突變率與網(wǎng)絡(luò)公布的數(shù)據(jù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 突變來源、突變步數(shù)及重復(fù)單位增減分析

73例突變案例中，三聯(lián)體為33例（34次突變），二聯(lián)體為40例（42次突變）。父親來源的突變?yōu)?9例（62次突變），母親來源的突變?yōu)?4例（14次突變）。33例三聯(lián)體中來自父系的突變23次，來自母系的突變11次，父、母源性突變比例為2.09∶1。

76次突變事件中，75次（98.68%）為一步突變，1次（1.32%）為三步突變。突變表現(xiàn)為重復(fù)單位增加的有38次，重復(fù)單位減少的有31次，不能確定的有7次，增加和減少的比例為 1.23∶1。 經(jīng) χ2檢驗(yàn)，χ2=0.828，P〉0.05，提示一步突變與二步以上突變中重復(fù)單位增加和減少的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

3.1 STR基因座的法醫(yī)學(xué)參數(shù)

GILL等[8]認(rèn)為 DP≥0.9、Ho≥0.7的基因座具有高鑒別能力，本研究21個(gè)常染色體STR基因座中，除 D3S1358、CSF1PO、TPOX 和 TH01基因座外，其余17個(gè)常染色體STR基因座均具有高度多態(tài)性。由于D3S1358、CSF1PO、TPOX和 TH01基因座屬于美國聯(lián)邦調(diào)查局（Federal Bureau of Investigation，F(xiàn)BI）于2017年1月1日強(qiáng)調(diào)要求的CODIS核心基因座[9]，故SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)仍將其包括在內(nèi)。21個(gè)常染色體STR基因座中，Penta E基因座多態(tài)性程度最高（Ho為 0.9270，DP 為 0.9869，PIC 為 0.9123），其次為D6S1043基因座（Ho為0.8810，DP為0.9685，PIC為0.8565）。D6S1043基因座最早應(yīng)用于商業(yè)化Sinofiler試劑盒（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）[9]，是針對(duì)中國人群開發(fā)的多態(tài)性STR基因座。

3.2 21個(gè)常染色體STR基因座的突變率

21個(gè)常染色體STR基因座中，有19個(gè)基因座共出現(xiàn)76次等位基因傳遞不平衡，D13S317和D10S1248基因座中未觀察到突變，除Penta E和FGA基因座外，其余19個(gè)常染色體STR基因座的突變率均小于0.002，各基因座的突變率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，本研究發(fā)現(xiàn)D13S317和TH01基因座的突變率與STRbase公布的突變率數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)與兩個(gè)原因相關(guān)：一是調(diào)查家系的大小，STRbase突變數(shù)據(jù)庫的調(diào)查來自于44個(gè)實(shí)驗(yàn)室多年數(shù)據(jù)的積累，其中D13S317基因座的研究涉及1 103 282次減數(shù)分裂，TH01基因座的調(diào)查涉及779 554次減數(shù)分裂；二是調(diào)查人群的差異，本次研究對(duì)象為華東地區(qū)漢族人群，而STRbase研究對(duì)象主要為歐洲及美國高加索人群。這一現(xiàn)象也提示我們，對(duì)于研究人群及家系的深入調(diào)查有助于獲取更為準(zhǔn)確的突變率信息。

本研究21個(gè)常染色體STR基因座的平均突變率為 0.892 1×10-3（95%CI為 0.70×10-3～1.10×10-3），比SF/Z JD0105001—2016《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》中推薦的平均突變率低，推測(cè)這主要是由于一些突變事件在二聯(lián)體案件中可能被忽略。

本研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)雜合度高的STR基因座，通常具有較高的突變率，但個(gè)別存在差異，如D6S1043基因座有較高雜合度，突變率卻為 0.9860×10-3（0.30×10-3～2.50×10-3）。這一現(xiàn)象在邱平明等[10]研究中進(jìn)行過深入調(diào)查，認(rèn)為雜合度與突變率之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，可認(rèn)為D6S1043基因座具有高多態(tài)性和低突變率，在親子鑒定中應(yīng)用價(jià)值較高。

3.3 21個(gè)常染色體STR基因座的突變情況

目前，逐步突變模式（stepwise mutation model，SMM）是多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的STR基因座突變模式，即多步突變是在一步突變的基礎(chǔ)上逐步形成的，并且概率非常低[11]。其主要機(jī)制是復(fù)制滑動(dòng)或者滑鏈錯(cuò)配，90%以上STR基因座的突變表現(xiàn)為增加或減少一個(gè)重復(fù)單位[11]。本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果與其一致，一步突變占98.68%，二步以上突變占1.32%，一步突變與二步以上突變中重復(fù)單位增加和減少的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

STR基因座的突變存在性別差異，父源突變比母源突變更常見，原因是突變與干細(xì)胞分化過程中細(xì)胞所經(jīng)過的分裂次數(shù)有關(guān)[12]。本研究中，三聯(lián)體父源性與母源性突變的比例為2.09∶1，父源突變率較高，但突變比例與文獻(xiàn)報(bào)道的中國群體研究的結(jié)論（3.06∶1[13]，4.3∶1[14]，7.2∶1[15]）有差異，分析可能與研究的樣本量、群體結(jié)構(gòu)及STR基因座的突變特征等有關(guān)[10]。

綜上，SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)在華東地區(qū)漢族人群中具有良好的遺傳多態(tài)性。根據(jù)SF/Z JD0105001—2016《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》要求計(jì)算，得到該身份鑒定系統(tǒng)的CPEduo值為0.999997431701961，CPEtrio值0.999999999654865，可滿足法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定要求。

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