孫 帥 ，田雨苗 ，湯繼明 ，張慶霞 ，胡玉龍 ，王鵬飛 ，薛盧艷 ，劉 力 ，唐 暉

（1.山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院，山西 太原 030025；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；3.阿克蘇地區(qū)公安局，新疆 阿克蘇 843000；4.北京市公安司法鑒定中心，北京 100192；5.鄂爾多斯市公安局禁毒支隊，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000；6.包頭市土默特右旗公安局，內(nèi)蒙古 包頭 014100；7.浙江迪安鑒定科學(xué)研究院，浙江 杭州 310030）

近十年來，DNA自動化分析技術(shù)取得了顯著進步[1-7]。應(yīng)用微流控芯片技術(shù)研發(fā)的RapidHITTM200系統(tǒng)[8]集DNA提取、擴增、電泳和分析四大功能于一體，可實現(xiàn)樣品檢測自動化，減少人為操作，降低產(chǎn)生污染的風(fēng)險，且大幅縮短了檢驗時間，全部檢驗可在2h內(nèi)完成。鑒于該平臺目前在法醫(yī)物證學(xué)實驗室尚未大規(guī)模使用，本研究主要探討該系統(tǒng)對法醫(yī)學(xué)四類常見檢材的檢測效能以及兩次重復(fù)檢測運行中模板、模板DNA和PCR產(chǎn)物的再利用效能，以期為同行提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

RapidHITTM200系統(tǒng)（美國IntegenX公司），Maxwell?16核酸提取儀（美國Promega公司），9700型PCR儀、3130xl基因分析儀（美國AB公司）。

DNA IQTMCasework Pro 試劑盒、PowerPlex?16 HS系統(tǒng)（美國Promega公司），GlobalFilerTMPCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 檢材及實驗方法

選取7名志愿者，使用醫(yī)用棉簽進行口腔擦拭，依次標(biāo)記為A1～A7。首先將A1～A7口腔拭子檢材依序置入RapidHITTM200系統(tǒng)進行檢測，運行結(jié)束后取出拭子檢材再依序置入新的樣品盒進行檢測。

提取兩次檢測過程中產(chǎn)生的模板DNA、PCR產(chǎn)物進行檢測，即模板DNA首次、再次檢測和PCR產(chǎn)物首次、再次檢測。其中，模板DNA首次、再次檢測定義為：使用醫(yī)用棉簽擦拭RapidHITTM200系統(tǒng)首次和再次運行后微流控區(qū)的模板DNA（1 μL），進行PCR擴增和后續(xù)電泳檢測；PCR產(chǎn)物首次、再次檢測定義為：使用槍頭吸取RapidHITTM200系統(tǒng)首次和再次運行后微流控區(qū)的PCR產(chǎn)物（2μL），并進行電泳檢測。

在RapidHITTM200系統(tǒng)進行法醫(yī)學(xué)四類常見檢材檢測分析，涉及口腔拭子9例，血拭子13例，煙蒂9例，心臟、肝、肺、腦、腎、胰腺、皮膚、脾等組織17例（組織為現(xiàn)取未降解的檢材且體積均為1 cm×1 cm×1cm，來自于實際案件，符合倫理學(xué)要求）。同時，針對運行后的檢材采用DNA IQTMCasework Pro試劑盒經(jīng)Maxwell?16核酸提取儀進行DNA提取，并完成PCR擴增及電泳檢測。另外，與上述方法類似，采集檢材在RapidHITTM200系統(tǒng)運行中產(chǎn)生的模板DNA和PCR產(chǎn)物進行后續(xù)檢測，即完成模板DNA首次檢測和PCR產(chǎn)物首次檢測。

因樣品在樣品盒中有可能發(fā)生漂移，使用Rapid-HITTM200系統(tǒng)時需對檢材作固定處理。該系統(tǒng)設(shè)有兩種檢測模式：一種針對常量檢材，選用口腔拭子模式；另一種針對微量檢材，選擇其他工具模式。常量檢材的PCR循環(huán)次數(shù)比微量檢材少兩個循環(huán)，本研究所涉及的檢材均為常量檢材，選擇口腔拭子模式進行檢測。儀器運行結(jié)束后，樣品盒中會留有運行后的檢材、模板DNA、PCR產(chǎn)物，其中經(jīng)過運行的檢材可以通過打開無菌封裝口用消毒鑷子夾取置于微量離心管中（運行前同種檢材的檢材量相同，運行后同種檢材的檢材取等量進行后續(xù)實驗）；模板DNA可以在微流控模板DNA收集區(qū)收集；PCR產(chǎn)物可以經(jīng)由100μL槍頭穿破無菌的樣品盒外包裝塑料膜吸取獲得。本次研究中DNA均采用GlobalFilerTMPCR擴增試劑盒完成PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)3130xl基因分析儀完成電泳，并采用GeneMarker?HID v2.6.13軟件進行DNA分型。

1.3 評判標(biāo)準(zhǔn)

STR基因座檢出率是指所檢出的STR基因座數(shù)目與擴增試劑盒所含STR基因座數(shù)目的比值。一致性檢測結(jié)果好的標(biāo)準(zhǔn)定義為相比較的兩次檢測STR基因座檢出率均〉95%。

2 結(jié) 果

2.1 口腔拭子的檢測結(jié)果

口腔拭子（A1～A7）經(jīng) RapidHITTM200系統(tǒng)兩次運行后的結(jié)果見表1。首次運行后的檢材經(jīng)電泳檢測基因座均完全檢出，然而再次運行的檢材存在部分等位基因丟失現(xiàn)象。上述檢材進行兩次系統(tǒng)檢測的平均STR基因座檢出率均可達(dá)95%以上，可認(rèn)為一致性檢測結(jié)果好。

表1 口腔拭子經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)兩次運行后的STR基因座檢出率 （%）

口腔拭子A2經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)首次與再次運行后的DNA分型圖譜見圖1，發(fā)現(xiàn)首次運行后各基因座的峰值范圍為1000～10000RFU，再次運行后各基因座的峰值范圍為200～1500RFU。

口腔拭子經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)兩次運行后，模板DNA首次、再次檢測和PCR產(chǎn)物首次、再次檢測的結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，這四種檢測的平均STR基因座檢出率均〈95%，模板DNA再次檢測和PCR產(chǎn)物再次檢測的平均STR基因座檢出率〈50%。

2.2 法醫(yī)學(xué)常見檢材的檢測

口腔拭子、血拭子、煙蒂及人體組織檢材經(jīng)Rapid-HITTM200系統(tǒng)首次運行后STR基因座檢出率可達(dá)到80%以上，均優(yōu)于運行后檢材的再檢測效果。另外，模板DNA的首次檢測效果優(yōu)于PCR產(chǎn)物的首次檢測效果，但比檢材經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)檢測的效果要差。其中，經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)運行后的組織類檢材進行再檢測的平均STR基因座檢出率為94.9%，優(yōu)于其他三類檢測。煙蒂類檢材在四種檢測中效果均低于其他類型檢材，特別是經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進行檢測時平均STR基因座檢出率僅為11.1%。具體結(jié)果見表3。

圖1 口腔拭子A2經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)兩次運行后的DNA分型圖譜

表2 口腔拭子經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)兩次運行后模板DNA首次、再次檢測和PCR產(chǎn)物首次、再次檢測的STR基因座檢出率 （%）

表3 法醫(yī)學(xué)常見檢材的STR基因座檢出率 （%）

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，口腔拭子經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)先后運行兩次的STR基因座檢出率高，一致性檢測結(jié)果好，但是再次運行檢測的峰值較首次降低，而且再次運行后的檢材可能存在部分等位基因丟失現(xiàn)象。同時，口腔拭子經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)兩次運行后，模板DNA和PCR產(chǎn)物首次檢測的效果均優(yōu)于再次檢測的結(jié)果，提示DNA實驗流程中的每一步均會存在一定程度的DNA損失，降低STR基因座檢出率。另外，在對法醫(yī)學(xué)常見檢材的檢測中發(fā)現(xiàn)，血拭子和煙蒂較組織與口腔拭子的STR基因座檢出率低，主要由于：血拭子檢材常含有血紅素，會抑制PCR擴增或降低PCR擴增效果[9]；煙蒂檢材常受到抑制或降解，以及可能攜帶少量煙草和皮膚角化組織DNA所致[10]。

綜上，RapidHITTM200系統(tǒng)對于口腔拭子檢材的兩次檢測可獲得較好的一致性檢測效果；首次運行后的相應(yīng)檢材、模板DNA、PCR產(chǎn)物延續(xù)后續(xù)實驗流程所獲得的STR基因座檢出率呈遞減趨勢且均小于95%，一次性檢測結(jié)果差；模板DNA和PCR產(chǎn)物進行首次和再次檢測的STR基因座檢出率相差大，一次性檢測結(jié)果差。結(jié)果提示，經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)首次運行后的檢材、模板DNA、PCR產(chǎn)物以及經(jīng)RapidHITTM200系統(tǒng)再次運行后的模板DNA與PCR產(chǎn)物不應(yīng)直接用于法醫(yī)學(xué)后續(xù)應(yīng)用及研究。采用RapidHITTM200系統(tǒng)進行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用時，在有條件的情況下，優(yōu)先選擇組織與口腔拭子檢材。

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