湯遠(yuǎn)亮，吳東升，徐永祥，楊麗玲，姚國(guó)新，秦巧玲，劉治安，黃衛(wèi)娟(.東莞東華醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 東莞 530； .暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬東莞醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 東莞 53900)

伊馬替尼是目前治療慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)、費(fèi)城染色體陽(yáng)性的急性淋巴細(xì)胞白血病的首選靶向治療藥物，但該類(lèi)患者常伴有機(jī)體免疫功能低下，尤其是費(fèi)城染色體陽(yáng)性的急性淋巴細(xì)胞白血病患者在使用伊馬替尼的過(guò)程中往往出現(xiàn)粒細(xì)胞缺乏癥而并發(fā)各種感染。為避免由此而導(dǎo)致的侵襲性真菌感染，臨床常聯(lián)合應(yīng)用伏立康唑[1]。伊馬替尼在體內(nèi)主要通過(guò)CYP3A酶代謝，伏立康唑的代謝酶為CYP3A4、CYP2C19及CYP2C9，兩藥對(duì)各自的代謝酶均有抑制作用[2-3]，故聯(lián)合用藥可能存在藥物相互作用。有關(guān)伊馬替尼與伏立康唑在患者體內(nèi)相互作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。有文獻(xiàn)報(bào)道，伊馬替尼、伏立康唑的療效和不良反應(yīng)與血藥濃度密切相關(guān)[3-5]。本研究對(duì)住院患者聯(lián)合應(yīng)用伏立康唑前后伊馬替尼達(dá)穩(wěn)態(tài)后的血漿藥物濃度進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)谷濃度和部分藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行了自身比較，對(duì)聯(lián)合用藥對(duì)臨床治療的影響進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與受試者

1.1 儀器

島津LC-15C型高效液相色譜系統(tǒng)，包括SPD-15C紫外檢測(cè)器、SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-16柱溫箱、Lab Solutions Essentia色譜工作站(日本島津公司)；BT25S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Eppendorf 5424R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf中國(guó)上海有限公司)；G560E型渦旋震蕩器(上海凌初環(huán)保儀器有限公司)；KQ-300型超聲波清洗儀(江蘇昆山超聲波儀器廠)。

1.2 藥品與試劑

伊馬替尼對(duì)照品(連云港潤(rùn)眾制藥有限公司，批號(hào)：03115031，純度>99%)；伏立康唑?qū)φ掌?中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100862-201402，純度>99%)；甲磺酸伊馬替尼膠囊(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：100 mg)；伏立康唑片(成都泰合健康科技集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：50 mg)；甲醇和乙腈為色譜純；磷酸和高氯酸為分析純；水為超純水。

1.3 受試者選擇

納入標(biāo)準(zhǔn)：血液科在正常預(yù)防和治療中連續(xù)單獨(dú)使用伊馬替尼至少4 d、并且聯(lián)合應(yīng)用伊馬替尼與伏立康唑達(dá)4 d的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：18歲以下者；對(duì)伊馬替尼和伏立康唑過(guò)敏者；合并使用了對(duì)伊馬替尼和伏立康唑藥動(dòng)學(xué)有嚴(yán)重影響的藥物者，包括肝藥酶CYP的誘導(dǎo)劑(如利福平、苯妥英、卡馬西平及苯巴比妥等)和抑制劑(如紅霉素、克拉霉素、酮康唑、伊曲康唑、西咪替丁、甲硝唑及葡萄柚汁等)；由于治療無(wú)效或發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)中途停止用藥者；治療初期肝腎功明顯異常者。共納入患者6例，其中男性5例，女性1例；平均年齡(31.7±9.8)歲；平均身高(168.5±4.3) cm；平均體質(zhì)量(62.2±11.5) kg。本研究經(jīng)東莞東華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為WondaSil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；保護(hù)柱為WondaSil C18柱(4.0 mm×10 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫[0 min：A-B(15 ∶85)；5～10 min：A-B(15 ∶85→20 ∶80)；10～18 min：A-B(20 ∶80→65 ∶35)；18～21 min：A-B(65 ∶35→95 ∶5)；21～30 min：A-B(95 ∶5)]；流速為0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μl。

2.2 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品300 μl，置于1.5 ml EP管中，加入蛋白沉淀劑(10%高氯酸甲醇)30 μl，渦旋3 min，15 000 r/min離心15 min，吸取上清液經(jīng)0.22 μm水系微孔過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)樣20 μl，行高效液相色譜分析。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 專(zhuān)屬性：取空白血漿、伊馬替尼和伏立康唑混合對(duì)照品血漿及患者血漿，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，記錄色譜，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，伊馬替尼和伏立康唑峰形良好，分離完全，基線平穩(wěn)，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，伊馬替尼和伏立康唑出峰時(shí)間分別為11.2和22.5 min。

A.空白血漿；B.空白血漿加伊馬替尼和伏立康唑混合對(duì)照品；C.患者血漿樣品；1.伊馬替尼；2.伏立康唑A.blank plasma；B.blank plasma combined with imatinib and voriconazole；C.patient sample；1.imatinib；2.voriconazole圖1 伊馬替尼和伏立康唑的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of imatinib and voriconazole

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量下限：精密量取伊馬替尼和伏立康唑?qū)φ掌啡芤哼m量，加入空白血漿配制成標(biāo)準(zhǔn)混合含藥血漿，伊馬替尼和伏立康唑的血漿質(zhì)量濃度分別為20.0、28.0 μg/ml，然后以2倍稀釋法配成一系列質(zhì)量濃度的伊馬替尼和伏立康唑血漿混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下操作，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(x，μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=52 107x+9 469.3(r=0.999 4，n=7)，伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=19 690x-7 305.8(r=0.999 8，n=7)；伊馬替尼和伏立康唑線性范圍分別為0.31～20.00、0.44～28.00 μg/ml，定量下限分別為0.31、0.44 μg/ml，最低檢測(cè)限分別為0.15、0.21 μg/ml(S/N=3)。

2.3.3 精密度及回收率試驗(yàn)：取空白血漿，按“2.3.2”項(xiàng)下方法，配制成定量下限和低、中、高共4個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行5樣本分析，計(jì)算精密度及相對(duì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 伊馬替尼-伏立康唑的精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab 1 Precision and recovery of imatinib and voriconazole(n=5)

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：按“2.3.2”項(xiàng)下方法配制成低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度(0.62～0.88、5.00～7.00及15.00～21.00 μg/ml)的伊馬替尼-伏立康唑混合血漿對(duì)照樣品各4份，按照“2.2”項(xiàng)下操作得到待測(cè)液，在室溫(25 ℃)條件下分別放置0、12、24 h后進(jìn)樣分析，對(duì)實(shí)測(cè)值進(jìn)行單方向方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，每個(gè)質(zhì)量濃度的均值與標(biāo)示質(zhì)量濃度的偏差在±15%范圍內(nèi)，符合《中華人民共和國(guó)藥典》原則要求，其中低質(zhì)量濃度組伊馬替尼和伏立康唑各時(shí)間點(diǎn)測(cè)量值之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中、高質(zhì)量濃度組各時(shí)間點(diǎn)測(cè)量值之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明中、高濃度樣品處理后室溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，而低質(zhì)量濃度樣品處理完需要即刻測(cè)定。

2.4 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)

所有患者均于每日上午9：00進(jìn)餐時(shí)口服甲磺酸伊馬替尼膠囊400 mg，1日1次，連續(xù)服用至少4 d，在確定將聯(lián)合應(yīng)用伏立康唑前1日上午9：00服用甲磺酸伊馬替尼膠囊后，分別于0、0.5、1、1.5、2、3、4、8、12及24 h取靜脈血4.0 ml，予以肝素抗凝，于離心管中離心后(轉(zhuǎn)速：3 000 r/min)取血漿，置于-20 ℃冰箱保存。繼續(xù)于上午9：00伊馬替尼劑量與用法不變的情況下，加服伏立康唑片200 mg，1日2次，連續(xù)服用4 d，于第5日上午9：00口服上述兩藥后，分別于0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12及24 h取靜脈血4 ml，予以肝素抗凝，于離心管中離心后(轉(zhuǎn)速：3 000 r/min)取血漿，置于-20 ℃冰箱保存，待測(cè)。

2.5 數(shù)據(jù)處理

2.5.1 平均血藥濃度-時(shí)間曲線：根據(jù)6例患者單獨(dú)口服伊馬替尼、聯(lián)合應(yīng)用伏立康唑后的伊馬替尼和伏立康唑的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖2—3。

圖2 伊馬替尼的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 2 Imatinib plasma concentration-time curve of imatinib

圖3 伏立康唑的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 3 Average plasma concentration-time curve of voriconazole

2.5.2 聯(lián)合應(yīng)用伏立康唑前后伊馬替尼的谷濃度及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：記錄6例患者在0 h時(shí)的血漿樣本測(cè)定值，定為谷濃度。采用DAS 3.2.8程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選用非房室模型的統(tǒng)計(jì)矩方法計(jì)算出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)聯(lián)合應(yīng)用伏立康唑前后伊馬替尼谷濃度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行自身配對(duì)t檢驗(yàn)比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥后，僅伊馬替尼的谷濃度較聯(lián)合用藥前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 伊馬替尼和伏立康唑的谷濃度及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)Tab 2 Valley concentration and pharmacokinetics parameters of imatinib and voriconazol(n=6)

注：與聯(lián)合用藥前比較，*P<0.05

Note：combined with drug combination，*P<0.05

3 討論

大多數(shù)研究結(jié)果顯示，伊馬替尼的血藥濃度與其臨床療效密切相關(guān)。Picard等[6]的研究結(jié)果顯示，伊馬替尼的血漿濃度與CML是否能達(dá)到完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解(complete cytogenetic response，CCyR)或主要分子學(xué)緩解(major molecular remission，MMR)相關(guān)；Larson等[7]的研究結(jié)果顯示，伊馬替尼治療CML時(shí)，當(dāng)其血漿谷濃度高，CML的CCyR率、MMR率及無(wú)事件生存率均升高，其血漿濃度的高低決定能否達(dá)到CCyR。朱凌燕等[5]對(duì)伊馬替尼谷濃度與其對(duì)CML的臨床療效之間關(guān)系的研究結(jié)果顯示，當(dāng)其谷濃度在0.99～1.73 μg/ml之間時(shí)，達(dá)到CCyR的CML患者所占比例最高，顯著高于<0.99 μg/ml組，獲得MMR患者的谷濃度明顯高于未獲得MMR的患者。本研究檢測(cè)出的聯(lián)合應(yīng)用伏立康唑前伊馬替尼的谷濃度范圍為0.73～2.17 μg/ml，聯(lián)合用藥后伊馬替尼的谷濃度范圍為0.91～3.24 μg/ml，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示出聯(lián)合應(yīng)用伏立康唑可有效升高伊馬替尼的谷濃度，有助于臨床獲取遺傳學(xué)和分子生物學(xué)療效。

伏立康唑的臨床療效、安全性與其谷濃度關(guān)系密切。一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，伏立康唑的谷濃度≥1 μg/ml時(shí)療效增強(qiáng)，而谷濃度≥4 μg/ml時(shí)神經(jīng)毒性發(fā)生率升高，≥5 μg/ml時(shí)肝毒性發(fā)生率升高，推薦谷濃度范圍為1～4 μg/ml[8]。另一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，伏立康唑谷濃度≥1.0～2.2 μg/ml時(shí)療效增強(qiáng)，谷濃度≥4～6 μg/ml時(shí)不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)增加，建議谷濃度范圍為1～6 μg/ml[9]。國(guó)內(nèi)也有關(guān)于伏立康唑穩(wěn)態(tài)谷濃度值分布情況的研究，邵貝貝等[10]回顧性收集了78例服用伏立康唑的患者，日劑量均為400 mg，檢測(cè)出的穩(wěn)態(tài)谷濃度為(3.88±2.52)(<0.52～10.70) μg/ml；陳懇等[11]通過(guò)檢索計(jì)算得出，伏立康唑慢代謝型患者、雜合子快代謝型患者及純合子快代謝型患者的穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度分別為4.21、2.47及2.00 μg/ml。本研究所測(cè)的伏立康唑穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度略高于文獻(xiàn)報(bào)道，顯示出聯(lián)合應(yīng)用伊馬替尼可能會(huì)適度升高體內(nèi)伏立康唑的血藥濃度，主要是由于伊馬替尼抑制CYP3A酶系所致，但伏立康唑主要通過(guò)CYP2C19代謝，因此伊馬替尼針對(duì)伏立康唑代謝酶的抑制作用有限。參與本研究的6例受試者在聯(lián)合應(yīng)用伊馬替尼后，伏立康唑的谷濃度在2.12～6.42 μg/ml之間，整體偏高于有效濃度，建議聯(lián)合用藥時(shí)宜監(jiān)測(cè)伏立康唑的谷濃度，必要時(shí)調(diào)整劑量；用藥期間，6例患者與感染相關(guān)的臨床癥狀控制良好，均未發(fā)生與伏立康唑相關(guān)的不良反應(yīng)。

由于入選患者均為臨床真實(shí)患者，其病情變化存在許多不定因素可能導(dǎo)致試驗(yàn)中斷，因此，本研究將達(dá)穩(wěn)態(tài)時(shí)間控制在96 h(超過(guò)伊馬替尼或伏立康唑的5個(gè)消除半衰期)，并采取自身對(duì)照以消除誤差。本研究也存在不足，表現(xiàn)在入選患者偏少，患者在用藥過(guò)程中可能存在未知影響血藥濃度的因素，因考慮患者的接受情況而放棄了夜間采血時(shí)間點(diǎn)，這些均可能對(duì)藥動(dòng)學(xué)的研究結(jié)果產(chǎn)生不利影響，提示對(duì)真實(shí)患者的研究中需要嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件。

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