楊錫彤，秦 燕，杜小珊，徐弘揚(yáng)，王光明*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

PPAR（過氧化物酶體增殖物激活受體）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族成員之一，包括α，β，γ 3種亞型，均具有調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的功能〔1〕。非諾貝特是PPARα的配體，因能降低甘油三脂和膽固醇而在臨床上作為降脂藥物廣泛使用〔2〕。而近年研究表明，貝特類藥物除降脂作用外，還是PPARα的激動劑〔3〕。PPARα的配體包括Clofibrate、Gemfibrozil、Wy14634和非諾貝特等，除了降脂作用外還有抗炎和抗氧化作用等〔4〕。SODs是ROS（活性氧）防御系統(tǒng)中最原始也是最重要的抗氧化酶〔5〕。SODs 包括SOD1（Cu∕Zn-SOD）、SOD2（Mn-SOD）、SOD3（ecSOD）3種亞型，其中SOD2作為輔因子存在于需氧細(xì)胞的線粒體內(nèi)，其物理結(jié)構(gòu)由5個外顯子和4個內(nèi)含子構(gòu)成。SOD2以同源四聚體存在，在促進(jìn)細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生過程中起重要的作用，并能防止氧過多而引起的肺毒性作用〔6〕。

前期研究表明，小鼠在腦缺血狀態(tài)下，SODs的表達(dá)下降，但經(jīng)過PPARα的激動劑非諾貝特或Wy14643處理后，SODs表達(dá)明顯升高〔7-8〕，從而非諾貝特和Wy14643能起到保護(hù)神經(jīng)的作用，但是目前非諾貝特或Wy14643如何影響SODs的表達(dá)其機(jī)制尚不清楚。因此在2013年3月至2016年5月本研究通過在細(xì)胞水平，利用培養(yǎng)的BMEC經(jīng)非諾貝特處理后，用實時熒光定量PCR的方法檢測非諾貝特是否影響PPARα和SOD2的表達(dá)；利用C57BL∕6小鼠經(jīng)非諾貝特處理，分離腦微血管，用實時熒光定量PCR的方法檢測非諾貝特是否在動物水平影響PPARα和SOD2的表達(dá)；用pGL4 mSOD2（含SOD2基因啟動子序列）或pGL4 mu mSOD2（含SOD2基因啟動子中PPRE結(jié)合區(qū)域突變）熒光素酶報告質(zhì)粒，BMEC經(jīng)過轉(zhuǎn)染后用非諾貝特處理，檢測BMEC中的熒光素酶活性，以研究非諾貝特如何調(diào)節(jié)SOD2的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑15只6～8周齡的雄性C57BL∕6小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，合格證號：SCXK2016（湘）0002）；CMC（羧甲基纖維素，Sigma公司）；DMSO（二甲基亞砜，Sigma公司）；非諾貝特（Sigma公司）；lipofectamine2000引物合成，總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒和定點突變試劑盒均由Invitrogen公司（Carlsbad，CA）提供，實時熒光定量PCR試劑盒購自Bio-Rad公司（Richmond，CA），熒光素酶報告系統(tǒng)購自Promega公司（Madison，WI），BMEC細(xì)胞購自北京鈞堯偉業(yè)生物科技有限公司（CRL-3245），其余試劑未作特殊說明均來自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及非諾貝特處理BMEC生長在含10%的胎牛血清、100 IU∕mL青霉素和鏈霉素的F12培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4天傳代1次，5～6代用于實驗。細(xì)胞傳代后，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)皿底部的70%～80%，換不含血清和雙抗的F12培養(yǎng)基過夜處理，第2天加入終濃度為10 μg∕mL的非諾貝特（溶解于DMSO中）處理12 h（實驗組），對照組用同等體積的DMSO處理。收獲細(xì)胞，提取總RNA。

1.3 C57BL∕6小鼠的處理雄性C57BL∕6小鼠購買回來后，隨機(jī)分為2組，實驗組7只，在試驗中給予Feno干預(yù)；對照組（8只）用制作非諾貝特混懸液的試劑CMC處理。為適應(yīng)環(huán)境，在大理大學(xué)動物中心飼養(yǎng)1周，然后灌胃給藥，分別給予30 mg∕kg Feno、10 mL∕kg 5%CMC混懸液處理，連續(xù)給藥7 d，每次給藥時間均控制在上午8：00—8：30間。在第7天給藥30 min內(nèi)處死小鼠，取腦組織置于4℃的PBS（pH 7.4）中分離腦微血管用于后續(xù)實驗。

1.4 腦微血管的分離按照參照文獻(xiàn)〔7〕介紹的方法分離小鼠腦微血管，上述腦組織去除腦膜后在3 mL的0.1 mol∕L PBS中勻漿，4 ℃、2 000 g離心5 min，沉淀物用3 mL 0.1 mol∕L PBS混懸后在混懸液的上方加入5 mL的15%右旋糖苷溶液（0.1 mol∕L PBS配制）中，4℃、3 500 g離心35 min后，沉淀物用冷的0.1 mol∕L PBS混懸，過孔徑為40 μm的尼龍膜，收獲尼龍膜上方的部分即為腦微血管，提取總RNA。

1.5 實時熒光定量PCR檢測PPARα和SOD2的表達(dá)為了在細(xì)胞水平和動物水平闡明非諾貝特對SOD2表達(dá)的影響及是否激活PPARα，從非諾貝特處理的BMEC和非諾貝特處理的小鼠腦微血管提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA?？俁NA的提取和反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA均依照Invitrogen公司的RNA提取試劑盒和cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行，然后用Bio-Rad公司的iQ SYBR Green試劑盒進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系為50 μL，其中cDNA 2 μL，SYBR Green混合物25 μL，引物各0.5 μL，其余用DEPC處理的水補(bǔ)齊50 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，35個循環(huán)。PPARα、SOD2和內(nèi)參18 s的引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增及克隆用引物

1.6 含SOD2啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫：http：∕∕genome.ucsc.edu∕index.html，調(diào)取小鼠SOD2基因的啟動子序列，設(shè)計引物，用小鼠的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物插入pGL4.10 Luciferase Reporter Vectors中，得到含SOD2啟動子序列的熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4mSOD2。

1.7 含SOD2啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒的定點突變在1 633至1 660堿基序列中，有PPAR的結(jié)合位點；序列為cgttggGGTCagagtccccgttgtttct，根據(jù)該序列及突變試劑盒的說明書，設(shè)計用于突變的引物，然后利用點突變試劑盒，把GGTC突變?yōu)镃CAG，插入pGL4 Luciferase Reporter Vectors中，可得到含突變的SOD2啟動子序列的熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4 mu mSOD2。

1.8 熒光素酶活性檢測為了闡明PPARα對SOD2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以pGL4.74所攜帶的熒光素酶信號為內(nèi)參，pGL4 mSOD2攜帶的信號為目的信號。為了排除細(xì)胞數(shù)量的差異，用內(nèi)參信號對目的信號進(jìn)行同一化處理。本研究用含SOD2啟動子序列的熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4 mSOD2與pGL4.74用lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染BMEC，轉(zhuǎn)染24 h后用最終濃度為10 μg∕mL的非諾貝特處理12 h，收獲細(xì)胞后按照試劑盒說明檢測細(xì)胞中的熒光素酶活性；為了進(jìn)一步研究PPARα通過與SOD2基因啟動子上的PPRE結(jié)合以調(diào)節(jié)SOD2的表達(dá)，本研究用pGL4 mu mSOD2與pGL4.74共轉(zhuǎn)染BMEC，24 h后經(jīng)10 μg∕mL的非諾貝特處理12 h，收獲細(xì)胞檢測細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析PPARα和SOD2 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，熒光素酶活性用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行one-way ANOVA分析，并進(jìn)行Scheffe post hoc統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 BMEC中PPARα和SOD2的表達(dá)BMEC給予10 μg∕mL的非諾貝特刺激12 h后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA，熒光定量PCR檢測結(jié)果表明PPARα和SOD2的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。見圖1～2。

BMEC給予非諾貝特處理12 h后，PPARα的表達(dá)升高；C57BL∕6經(jīng)連續(xù)灌胃給非諾貝特7 d后，分離腦組織中的微血管成分，實時熒光定量PCR檢測PPARα的表達(dá)升高。

圖1 PPARα的表達(dá)圖

2.2 C57BL∕6小鼠腦微血管中PPARα和SOD2的表達(dá)C57BL∕6小鼠灌胃給予30 mg∕kg體重的非諾貝特處理7 d后，其腦微血管中PPARα和SOD2的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。見圖1～2。BMEC給予非諾貝特處理12 h后，SOD2的表達(dá)升高；C57BL∕6經(jīng)連續(xù)灌胃給非諾貝特7 d后，分離腦組織中的微血管成分，實時熒光定量PCR檢測SOD2的表達(dá)升高。

圖2 SOD2的表達(dá)圖

2.3 熒光素酶活性變化BMEC轉(zhuǎn)染pGL4.74和pGL4 mSOD2或pGL4 mu mSOD2 24 h后，BMEC給予10 μg∕mL的非諾貝特處理12 h，測定熒光素酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非諾貝特能夠增強(qiáng)pGL4 mSOD2的活性（P＜0.01），但是把SOD2基因啟動子中PPRE結(jié)合序列的關(guān)鍵堿基突變后，即使給予非諾貝特刺激，pGL4 mu mSOD2的活性沒有明顯的改變。

BMEC共轉(zhuǎn)染pGL4.74和pGL4 mSOD2后，給予非諾貝特刺激，熒光素酶活性增強(qiáng)；當(dāng)SOD2啟動子區(qū)與PPRE結(jié)合的關(guān)鍵堿基突變后，即使給予非諾貝特刺激，熒光素酶活性也并未改變。見圖3。

圖3 熒光素酶活性檢測圖

3 討論

PPARα主要分布在代謝活躍的組織中，例如肝臟、腎臟和心臟，其作用主要是調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝〔9-10〕。另外，PPARα在腦組織中也廣泛表達(dá)，在小鼠I∕R（缺血∕再灌注）損傷中可以抑制NOX的表達(dá)和減少氧自由基ROS的含量〔11〕以保護(hù)由于I∕R引起的損傷。非諾貝特和Wy-14643，都作為PPARα的配體，能導(dǎo)致過氧化物酶體的增殖和肝臟腫大。近年來的研究表明PPARα可作為部分抗氧化酶的一種表達(dá)促進(jìn)劑，例如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶（SODs）和抗炎介質(zhì)〔12〕。

體內(nèi)的ROS主要來源于還原型輔酶Ⅱ（NADPH oxidase）等的作用，而ROS的清除主要依賴于SODs〔13〕。有研究表明，在心臟、胃、小腸、腦、視網(wǎng)膜等組織缺血過程中，ROS的含量升高〔14-16〕。Boshra等〔17〕在研究肝臟缺血-再灌注損傷時發(fā)現(xiàn)非諾貝特可以促進(jìn)SODs的表達(dá)以降低ROS含量而對肝臟缺血∕再灌注損傷進(jìn)行保護(hù)；Ibarra-Lara等〔18〕在心肌缺血損傷時也發(fā)現(xiàn)非諾貝特的類似物Clofibrate也具有相似的功能；同樣的保護(hù)機(jī)制在其他臟器的缺血∕再灌注損傷的研究中得到進(jìn)一步證實〔19-20〕，說明非諾貝特可能具有調(diào)節(jié)SODs表達(dá)的功能。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)給予非諾貝特處理后，缺血小鼠腦組織中的ROS含量降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PPARα的表達(dá)、SOD2含量及SODs活性升高，結(jié)合PPARα作為核轉(zhuǎn)錄因子的功能，進(jìn)一步說明非諾貝特可能是通過促進(jìn)PPARα的表達(dá)以影響SOD2在體內(nèi)的含量及其活性，以維持ROS在體內(nèi)含量的相對穩(wěn)定，從而在缺血∕再灌注損傷起保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步闡明非諾貝特調(diào)節(jié)SOD2的機(jī)制，本研究用體外實驗BMEC經(jīng)非諾貝特處理和體內(nèi)實驗C57BL∕6小鼠給予非諾貝特處理后分離腦組織中的微血管，其PPARα和SOD2的表達(dá)均升高，說明非諾貝特可以促進(jìn)PPARα和SOD2的表達(dá)；進(jìn)一步用SOD2基因啟動子序列構(gòu)建的熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，經(jīng)非諾貝特刺激，可以導(dǎo)致熒光素酶活性升高，說明非諾貝特調(diào)控SOD2的表達(dá)依賴于非諾貝特與SOD2基因間可能存在某種聯(lián)系；而當(dāng)SOD2基因啟動子上PPRE結(jié)合序列的關(guān)鍵堿基發(fā)生突變后，即使給予非諾貝特刺激，pGL4 mu mSOD2的活性幾乎沒有改變，即由于SOD2基因啟動子上的PPRE與PPARα結(jié)合的堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致PPARα無法與SOD2基因啟動子上的PPRE結(jié)合，從而非諾貝特激活SOD2基因啟動子活性的作用消失，說明非諾貝特調(diào)節(jié)SOD2的表達(dá)依賴于PPARα與SOD2基因啟動子區(qū)域上的PPRE結(jié)合，結(jié)合體內(nèi)和體外實驗研究得到非諾貝特具有促進(jìn)PPARα和SOD2的表達(dá)功能，說明非諾貝特對SOD2表達(dá)的調(diào)控作用依賴于激活的PPARα結(jié)合到SOD2基因啟動子的PPRE區(qū)域以促進(jìn)SOD2基因啟動子的活性，從而促進(jìn)SOD2的表達(dá)。

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