張盼盼，肖朝江，劉 健，邱 琳，沈 怡，董 相，姜 北

（大理大學(xué)藥物研究所，云南大理 671000）

頭狀四照花［Dendrobenthamia capitata（Wall.）Hutch.］系山茱萸科（Cornaceae）四照花屬（Dendro?benthamia）植物，主要分布于我國云南、貴州、四川、西藏、廣西等西南地區(qū)〔1〕。該植物為常綠喬木，稀灌木，高3～15 m，稀達(dá)20 m；葉對(duì)生；頭狀花序球形，花萼管狀；果序扁球形，直徑1.5～2.4 cm，成熟時(shí)紫紅色；花期5～6月；果期9～10月。頭狀四照花又名野荔枝、山荔枝和雞嗉子等，全株均能藥用〔2〕。頭狀四照花的葉主治食積、小兒疳積、蟲積腹痛、肝炎、腹水、水火燙傷、外傷出血和瘡瘍；根用于濕熱痢疾和泄瀉；果實(shí)也可用于治療食積氣脹、小兒疳積、肝炎、蛔蟲病、燒燙傷和外傷出血等〔2〕。

本課題組前期研究結(jié)果顯示該植物提取物具有一定的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性。為此本研究采用HPLC、柱層析等手段進(jìn)行活性成分追蹤，結(jié)果從頭狀四照花枝葉中追蹤得到3個(gè)活性強(qiáng)于粗提物的化合物，以及1個(gè)非活性化合物，分別鑒定為兒茶素（1）、槲皮素（2）、異槲皮苷（3）和2α-羥基烏索酸（4）。見圖1。

圖1 化合物1～4的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；色譜柱（Phenomenex 125 C18250 mm×4.6 mm；5 μm）；AL-204電子天平［梅特勒-托利（上海）有限公司］；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；BioTek Synergy HT酶標(biāo)儀（美國BioTek儀器公司）；Bruker AvanceⅢ-400核磁共振儀（德國布魯克公司），四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)；柱層析硅膠和薄層層析硅膠板GF254（青島海洋化工廠）。

氯化鐵血紅素、磷酸氯喹、HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸，美國Sigma公司）；DMSO［二甲基亞砜，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司］；吡啶、冰醋酸（上海申博化工有限公司）；三水合乙酸鈉（天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司）；高效液相色譜純甲醇、乙腈［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；超純水［（自制）艾柯DZG-303A］。

本實(shí)驗(yàn)所用頭狀四照花［Dendrobenthamia capi?tata（Wall.）Hutch.］枝葉于2015年5月采自云南省大理市漾濞縣，由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥學(xué)教研室張德全博士鑒定，植物標(biāo)本（20150507-6-A）存放于大理大學(xué)藥物研究所姜北教授研究組。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取分離頭狀四照花枝葉8.5 kg，分別用95%乙醇和70%乙醇各冷浸提取2次，減壓濃縮所得總浸膏（1.4 kg）用水分散后依次用乙酸乙酯、正丁醇分配數(shù)次，得相應(yīng)萃取物。乙酸乙酯萃取物（430 g）經(jīng)200～300目硅膠柱色譜，氯仿-丙酮混合溶劑（1：0至0：1）梯度洗脫，得到7個(gè)組分（A～G）。C組分經(jīng)反復(fù)反相RP18柱色譜（甲醇-水）得化合物2（17.1 mg）。D組分經(jīng)ODS（甲醇-水0：1～1：0）和凝膠反復(fù)柱層析（Sephadex LH-20，氯仿-甲醇1：1）依次得化合物1（26.2 mg）、3（375.3 mg）和4（13.5 mg）。

2.2 β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)精密稱取上述粗提物、粗分段和單體化合物，配成系列濃度溶液備用。將50 μL不同濃度的供試樣品加入于96孔板中，平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔。隨后每孔依次加入50 μL氯高鐵血紅素儲(chǔ)備液（1.0 mmol∕L，溶解于DMSO中）和80 μL醋酸鹽緩沖液（4 mol∕L，pH 5.0）與之混合。置于50℃孵育5 h，取出待室溫后，每孔加入100 μL 30%（v/v）的吡啶-HEPES（20 mmol∕L，pH 7.5）溶液。室溫放置10 h后，從每孔中移取50 μL上清液至另一96孔板中，之后每孔加入200 μL吡啶-HEPES（20 mmol∕L，pH 7.5）溶液，并在405 nm波長處測(cè)定吸收值。由羥高鐵血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線得出未反應(yīng)的羥高鐵血紅素的濃度，從而計(jì)算出供試品對(duì)β-羥高鐵血紅素形成的半數(shù)抑制濃度（IC50）。設(shè)置氯喹為陽性對(duì)照，蒸餾水為溶媒對(duì)照〔3-5〕。

2.3 數(shù)據(jù)處理所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和組間LSD檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 β-羥高鐵血紅素形成抑制活性按“2.2”項(xiàng)下方法對(duì)頭狀四照花粗提物進(jìn)行抗瘧活性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該樣品具有一定的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，因此，又對(duì)其各萃取部位進(jìn)行活性測(cè)試。見表1。從表1中可以看出，乙酸乙酯萃取物和萃余水相均具有一定的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性；其中，乙酸乙酯萃取物活性較好，IC50值為（902.7±6.4）μg∕mL。

表1 頭狀四照花不同部位β-羥高鐵血紅素形成抑制結(jié)果（±s，n=3）

表1 頭狀四照花不同部位β-羥高鐵血紅素形成抑制結(jié)果（±s，n=3）

樣品名不同濃度（μg∕mL）植物提取物的β-羥高鐵血紅素形成抑制率∕%1 388.9277.855.611.12.2 IC50∕(μg∕mL)磷酸氯喹粗提物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物萃余水相86.5±6.3 56.6±8.4 79.9±6.3 0.5±4.2 68.4±3.0 83.8±6.8-5.1±1.1 5.6±1.3-9.6±0.3-6.4±1.0 80.0±7.5-2.5±1.7 4.2±1.5-10.3±1.4-6.4±1.5-5.4±2.2-3.6±0.8-3.0±2.9-3.9±0.7-2.1±0.4-1.7±2.2-1.2±3.1 0.6±0.6-2.4±4.6-0.1±3.0 38.4±3.4 1 236.8±7.9 902.7±6.4無活性1 038.8±5.1

繼而采用硅膠柱層析對(duì)乙酸乙酯萃取物進(jìn)行粗劃段及活性測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)粗分段C和D具有較好的活性。見表2。隨后又利用HPLC和RP18等柱層析技術(shù)方法追蹤分離粗分段C和D中的活性成分。結(jié)果從二者中得到3個(gè)活性顯著強(qiáng)于粗提物的化合物（1～3），IC50值分別為＞277.8、（155.7±6.5）和＞277.8 μg∕mL，以及1個(gè)非活性化合物（4）。見表3。

表2 頭狀四照花乙酸乙酯萃取物粗分段A～G的β-羥高鐵血紅素形成抑制結(jié)果（±s，n=3）

表2 頭狀四照花乙酸乙酯萃取物粗分段A～G的β-羥高鐵血紅素形成抑制結(jié)果（±s，n=3）

不同濃度（μg∕mL）粗分段的β-羥高鐵血紅素形成抑制率∕%樣品名IC50∕(μg∕mL)磷酸氯喹A B C D E F G 1 388.9 86.5±6.3-3.8±1.4 52.6±6.3 103.8±1.9 75.1±5.5 56.2±3.8 67.7±2.0 9.3±3.5 277.8 83.8±6.8-7.6±0.1 18.7±4.7-1.9±1.9 52.9±5.9 16.3±0.8 10.2±0.4 2.6±5.8 55.6 80.0±7.5-5.6±0.4-1.2±1.5 0.4±2.4 0.9±2.8 2.9±0.9-0.1±0.2-0.7±3.3 11.1-5.4±2.2-2.1±1.1 0.2±0.6-2.3±2.4-2.3±2.1 2.4±2.5 2.4±1.1-1.8±1.8 2.2-1.7±2.2-0.9±0.8 0.2±1.8-1.3±2.7 0.3±1.6-4.9±0.5-4.1±4.3-0.5±1.7 38.4±3.4無活性1 324.4±3.8 687.8±15.2 934.3±7.4 1 233.7±9.0 1 034.7±2.2＞1 388.9

表3 頭狀四照花單體化合物的β-羥高鐵血紅素形成抑制結(jié)果（±s，n=3）

表3 頭狀四照花單體化合物的β-羥高鐵血紅素形成抑制結(jié)果（±s，n=3）

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3.2 化合物結(jié)構(gòu)解析化合物1：C15H14O6，淡黃色粉末。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.86（1H，d，J=1.9 Hz，H-2′），6.79（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），6.74（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），5.96（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），5.88（1H，J=2.3 Hz，H-6），4.59（1H，d，J=7.5 Hz，H-2），4.00（1H，td，J=7.8，5.4Hz，H-3），2.87（1H，dd，J=16.1，5.4Hz，H-4a），2.53（1H，dd，J=16.1，8.1 Hz，H-4b）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：82.8（C-2），68.8（C-3），28.5（C-4），156.9（C-5），96.2（C-6），157.8（C-7），95.5（C-8），157.5（C-9），100.8（C-10），132.2（C-1′），115.2（C-2′），146.2（C-3′，4′），116.1（C-5′），120.0（C-6′）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔6〕報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為兒茶素。

化合物2：C15H10O7，黃色針晶（吡啶）。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：13.24（1H，s，5-OH），8.53（1H，d，J=2.1 Hz，H-2′），8.01（1H，dd，J=8.5，2.1 Hz，H-6′），7.31（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），6.68（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.64（1H，d，J=2.0 Hz，H-8）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：149.9（C-2），138.4（C-3），177.8（C-4），162.9（C-5），99.7（C-6），166.0（C-7），94.8（C-8），157.9（C-9），104.9（C-10），124.4（C-1′），117.1（C-2′），148.2（C-3′），147.6（C-4′），117.1（C-5′），121.5（C-6′）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔7〕報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為槲皮素。

化合物3：C21H20O12，黃色粉末。1HNMR（400 MHz，C5D5N）δ：8.46（1H，d，J=2.1 Hz，H-2′），8.14（1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′），7.27（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.70（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.64（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.10（1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），4.83（1H，dd，J=9.2，7.8 Hz，H-2″），4.62（1H，d，J=3.1 Hz，H-4″），4.44（1H，dd，J=10.9，6.3 Hz，H-6″a），4.34（1H，dd，J=11.2，4.9 Hz，H-6″b），4.31（1H，dd，J=9.2，3.1 Hz，H-3″），4.19（1H，t，J=6.2 Hz，H-5″）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：157.3（C-2），135.3（C-3），178.6（C-4），162.5（C-5），99.5（C-6），165.7（C-7），94.3（C-8），157.6（C-9），105.2（C-10），122.1（C-1′），116.0（C-2′），146.5（C-3′），150.5（C-4′），117.6（C-5′），122.8（C-6′），104.9（C-1″），73.2（C-2″），75.2（C-3″），69.5（C-4″），77.5（C-5″），61.7（C-6″）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔8〕報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為異槲皮苷。

化合物4：C30H48O4，白色粉末。1H NMR（400 MHz，CDCl3+CD3OD）δ：5.25（1H，brs，H-12），3.64（1H，ddd，J=11.3，9.5，4.3 Hz，H-2），2.94（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），1.12，1.03，1.02，0.84，0.81（各3H，s，5×Me），0.96（3H，d，J=5.4 Hz，Me-30），0.88（3H，d，J=6.6 Hz，Me-29）；13C NMR（100 MHz，CDCl3+CD3OD）δ：47.7（C-1），69.2（C-2），84.2（C-3），40.4（C-4），56.3（C-5），19.2（C-6），33.9（C-7），40.2（C-8），48.5（C-9），38.9（C-10），24.2（C-11），126.3（C-12），139.3（C-13），43.0（C-14），28.8（C-15），25.0（C-16），48.7（C-17），53.9（C-18），40.0（C-19），40.0（C-20），31.5（C-21），37.7（C-22），29.2（C-23），17.6（C-24），17.2（C-25），17.5（C-26），24.1（C-27），181.4（C-28），17.3（C-29），21.5（C-30）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔9〕報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為2α-羥基烏索酸。

4 討論

文獻(xiàn)報(bào)道紅內(nèi)期抗瘧藥可通過與血紅素絡(luò)合而抑制β-羥高鐵血紅素（瘧色素）形成，使瘧原蟲溶解而起到抗瘧疾的效果〔10-11〕；提示血紅素為紅內(nèi)期抗瘧藥物的作用靶點(diǎn)，并可通過抑制β-羥高鐵血紅素形成的活性大小來評(píng)價(jià)和篩選抗瘧藥〔12〕。本研究結(jié)果表明頭狀四照花（D.capitata）具有一定的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，通過活性追蹤從中得到3個(gè)黃酮類活性成分。β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素的活性最強(qiáng)，兒茶素和異槲皮苷的活性相當(dāng)。因條件限制，本研究僅對(duì)該植物的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性以及其中的活性化學(xué)成分進(jìn)行了初步探索，更加細(xì)致的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性成分與構(gòu)效關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

本研究利用β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)為抗瘧體外篩選模型，對(duì)藥用植物頭狀四照花進(jìn)行了相關(guān)活性成分追蹤，為從滇西地區(qū)豐富的植物資源中尋找新型抗瘧藥提供了新模式，具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值。

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