杜小珊，楊錫彤，徐弘揚(yáng)，程建杰，王光明

(大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理671000)

非諾貝特對(duì)人BMEC與小鼠腦微血管組織SOD3表達(dá)的影響及機(jī)制

杜小珊，楊錫彤，徐弘揚(yáng)，程建杰，王光明

(大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理671000)

目的 探討過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α亞型(PPARα)激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)與小鼠腦微血管組織細(xì)胞外銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD3)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。方法 將培養(yǎng)好的BMEC隨機(jī)分為兩部分，分別加入終濃度為10 μg/mL非諾貝特、同等體積的DMSO處理12 h；將15只小鼠隨機(jī)分為兩部分，分別給予30 mg/kg非諾貝特、10%的羧甲基纖維素混懸液10 mL/kg連續(xù)灌胃7 d，處死小鼠取腦組織，提取腦微血管；用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BMEC與腦微血管組織內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α亞型(PPARα)、SOD3的mRNA表達(dá)。構(gòu)建含SOD3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4 mSOD3，用突變?cè)噭┖卸c(diǎn)獲得過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(PPRE)序列突變的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4 mu mSOD3，將pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3轉(zhuǎn)染BMEC 24 h，取部分細(xì)胞用終濃度10 μg/mL的非諾貝特處理12 h，檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。結(jié)果 經(jīng)非諾貝特處理后，BMEC及小鼠腦微血管組織中PPARα、SOD3 mRNA表達(dá)均升高(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染pGL4 mSOD3 24 h，經(jīng)非諾貝特處理后BMEC內(nèi)pGL4 mSOD3的熒光素酶活性增強(qiáng)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染pGL4 mu mSOD3 24 h，經(jīng)非諾貝特處理的BMEC熒光素酶活性變化不明顯(P>0.05)。結(jié)論 非諾貝特通過(guò)激活PPARα從而調(diào)節(jié)人BMEC與腦微血管組織中SOD3的表達(dá)。

非諾貝特；細(xì)胞外銅/鋅超氧化物歧化酶；腦微血管；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

超氧化物歧化酶(SOD)在機(jī)體中能消除新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其有三種亞型：胞質(zhì)內(nèi)的SOD1、線(xiàn)粒體內(nèi)SOD2及細(xì)胞外銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD3)[1]。SOD的耗竭或內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的破壞是缺氧導(dǎo)致組織損傷的機(jī)制[2，3]。缺血會(huì)導(dǎo)致腦組織中SOD表達(dá)下降。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α亞型(PPARα)激動(dòng)劑非諾貝特可誘導(dǎo)腦組織微血管及腎小管中SOD表達(dá)升高，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用及腎臟保護(hù)作用[4，5]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。2013年2月～2016年4月，本研究在細(xì)胞水平與動(dòng)物水平探討非諾貝特對(duì)SOD3表達(dá)的影響；利用含基因SOD3啟動(dòng)子序列或過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(PPRE)序列突變啟動(dòng)子構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分析非諾貝特調(diào)節(jié)SOD3表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 C57BL/6小鼠15只，6～8周齡，體質(zhì)量22～25 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。非諾貝特、二甲基亞砜(DMSO)、羧甲基纖維素(CMC，Sigma公司)，Lipofectamine2000、TRIzol、cDNA合成試劑盒、定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(Bio-Rad公司)；熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4.10、pGL4.74(Promega公司)；人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)、引物(北京鈞堯偉業(yè)生物科技有限公司)。

1.2 BMEC培養(yǎng)及處理 BMEC用含10% FBS、100 U/mL的青霉素和鏈霉素的F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿底部的90%左右用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，傳5～6代用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞傳代并長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿底部的70%～80%，換新鮮的F12培養(yǎng)基過(guò)夜，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為兩部分，分別加入終濃度為10 μg/mL的非諾貝特、同等體積的DMSO處理12 h，收集細(xì)胞。

1.3 小鼠腦微血管分離 15只小鼠在大理大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)1周，隨機(jī)取8只給予30 mg/kg非諾貝特、另外7只給予10%的CMC混懸液10 mL/kg灌胃，均連續(xù)灌胃7 d。末次給藥30 min后斷頸處死小鼠，取腦組織，分離小鼠腦微血管，取新鮮腦組織去除腦膜，放入PBS 3 mL，于離心管中勻漿，4 ℃、2 000 g離心5 min，棄上清液，沉淀物用PBS混懸3 mL，在混懸液上方加入15%右旋糖苷(用pH值為7.4的PBS配制)5 mL，4 ℃、3 500 g離心35 min，沉淀物用冷PBS混懸，用孔徑為40 μm的尼龍膜過(guò)濾，收集尼龍膜上方的成分，即為腦微血管。

1.4 BMEC與小鼠腦微血管組織內(nèi)PPARα、SOD3的mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)。取收集的BMEC和小鼠腦微血管，按照RNA提取試劑盒和cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)提取tRNA、合成cDNA，用iQ SYBR Green試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系50 μL，其中cDNA 2 μL、SYBR Green混合物25 μL、引物各0.5 μL、DEPC處理的水22 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，之后95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)。PPARα基因上游引物為5′-gcagctcgtacaggtcatca-3′、下游引物為5′-ctcttcatccccaagcgtag-3′，產(chǎn)物202 bp；SOD3基因上游引物5′-ctgggtgcagctctcttttc-3′、下游引物5′-acatgtctcggatccactcc-3′，產(chǎn)物184 bp；GAPDH基因上游引物5′-aactttggcattgtggaagg-3′、下游引物5′-acacattgggggtaggaaca-3′，產(chǎn)物223 bp；目的基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算用2-ΔΔCt法。

1.5 含SOD3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建 調(diào)取網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/index.html)小鼠SOD3基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物如下，SOD3啟動(dòng)子克隆上游引物5′-caccagcttttcatctagga-3′，下游引物5′-taatgtccttatgaaaaccag-3′，產(chǎn)物1 419 bp；用小鼠的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物插入pGL4.10 Luciferase Reporter Vectors中，得到含SOD3啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4 mSOD3。

1.6 含SOD3啟動(dòng)子PPRE結(jié)合序列的定點(diǎn)突變 在SOD3基因啟動(dòng)子序列的-511～-488堿基序列中，有PPAR的結(jié)合位點(diǎn)；序列為：5′-ggtgtggtagggggcAGGTaccca-3′，根據(jù)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)，設(shè)計(jì)引物SOD3啟動(dòng)子突變上游引物5′-ggtgtggtagggggcCTTAaccca-3′，下游引物5′-gtggtgtggtagggggcGAATacccaataaccat-3′，利用突變?cè)噭┖?，把AGGT突變?yōu)镃TTA，插入pGL4 Luciferase Reporter Vectors中，得到PPRE序列突變的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4 mu mSOD3。

1.7 BMEC中熒光素酶活性檢測(cè) 采用熒光素酶活性檢測(cè)法。將培養(yǎng)好的BMEC隨機(jī)分為兩部分，將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3分別與pGL4.74共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，嚴(yán)格按照Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24 h，各取pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3轉(zhuǎn)染的部分細(xì)胞用終濃度10 μg/mL的非諾貝特處理12 h，收集細(xì)胞檢測(cè)熒光素酶活性，獲得相應(yīng)光密度值(OD值)。用pGL4 mSOD3或pGL4 mu mSOD3的OD值/pGL4.74的OD值作為啟動(dòng)子熒光素酶活性相對(duì)值。

2 結(jié)果

2.1 非諾貝特對(duì)BMEC、小鼠腦微血管組織PPARα mRNA表達(dá)的影響 經(jīng)非諾貝特、DMSO處理的BMEC，其PPARα mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.36±0.45、1.00±0.09；經(jīng)非諾貝特、CMC處理的小鼠，其腦微血管組織PPARα mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.10±0.67、1.00±0.10。非諾貝特處理后，BMEC細(xì)胞及小鼠腦微血管組織中PPARα mRNA表達(dá)均升高(P均<0.05)。

2.2 非諾貝特對(duì)BMEC、小鼠腦微血管組織SOD3 mRNA表達(dá)的影響 經(jīng)非諾貝特、DMSO處理的BMEC，其SOD3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為5.37±0.44、1.00±0.08；經(jīng)非諾貝特、CMC處理的小鼠，其腦微血管組織SOD3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為6.89±0.21、1.00±0.03。非諾貝特處理后，BMEC及小鼠腦微血管組織中SOD3 mRNA表達(dá)均升高(P均<0.05)。

2.3 非諾貝特對(duì)BMEC中熒光素酶活性的影響 轉(zhuǎn)染pGL4 mSOD3 24 h，經(jīng)非諾貝特處理、未經(jīng)處理的BMEC熒光素酶活性相對(duì)值分別為4.58±0.13、1.00±0.03，經(jīng)非諾貝特處理后細(xì)胞內(nèi)pGL4 mSOD3的熒光素酶活性增強(qiáng)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染pGL4 mu mSOD3 24 h，經(jīng)非諾貝特處理、未經(jīng)處理的BMEC熒光素酶活性相對(duì)值分別為1.38±0.57、1.00±0.10，經(jīng)非諾貝特處理后細(xì)胞內(nèi)pGL4 mu mSOD3的熒光素酶活性變化不明顯(P>0.05)。

3 討論

貝特類(lèi)藥物包括非諾貝特、Clofibrate、Gemfibrozil和人工合成的Wy14634等，是PPARα的配體。研究發(fā)現(xiàn)，PPARα的配體非諾貝特、Clofibrate等除臨床降脂作用外，在各種缺氧刺激的動(dòng)物模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與貝特類(lèi)藥物促進(jìn)SOD的表達(dá)等抗氧化作用有關(guān)[6～8]。在體內(nèi)，活性氧(ROS)主要來(lái)源于還原型輔酶Ⅱ，而ROS的清除主要依賴(lài)于SOD的降解作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病、寄生蟲(chóng)感染、細(xì)菌感染、心血管疾病、吸煙等病理生理狀態(tài)下，ROS水平升高[10～14]。Nozik-Grayck等[15]敲除小鼠平滑肌細(xì)胞的SOD3后，會(huì)加重慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓；用非諾貝特預(yù)處理小鼠，缺血再灌注后，小鼠腦組織中的ROS水平降低，其部分機(jī)制是SOD3的表達(dá)及SOD活性升高，因此非諾貝特可能具有調(diào)節(jié)SOD表達(dá)的功能[4,5]；而在不同原因引起的腎臟損傷中，非諾貝特通過(guò)激活PPARα影響SOD的表達(dá)和活性以保護(hù)受損的腎臟組織[16～18]。在大鼠帕金森綜合征動(dòng)物模型中，非諾貝特可通過(guò)影響SOD、谷胱甘肽等的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用[19]。以上研究均說(shuō)明非諾貝特通過(guò)影響SOD的表達(dá)以維持體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡，從而起保護(hù)作用，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍然不清。

本研究用SOD3基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMEC，之后用非諾貝特刺激被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可導(dǎo)致其熒光素酶活性升高，表明非諾貝特以某種方式調(diào)節(jié)BMEC內(nèi)SOD3的表達(dá)；而在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平研究發(fā)現(xiàn)，非諾貝特處理后，SOD3的表達(dá)升高，說(shuō)明非諾貝特具有調(diào)控SOD3表達(dá)的能力；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，非諾貝特處理后，BMEC、小鼠腦微血管組織PPARα表達(dá)升高，說(shuō)明非諾貝特調(diào)控SOD3的表達(dá)有可能通過(guò)激活PPARα實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步明確非諾貝特調(diào)控SOD3的表達(dá)是否依賴(lài)于非諾貝特激活PPARα的表達(dá)，本研究將SOD3基因啟動(dòng)子上PPRE結(jié)合序列進(jìn)行突變后構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BMEC，檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非諾貝特激活SOD3基因啟動(dòng)子活性的作用消失，進(jìn)一步說(shuō)明非諾貝特的調(diào)控作用依賴(lài)于激活的PPARα結(jié)合到SOD3基因啟動(dòng)子的PPRE區(qū)域以調(diào)節(jié)SOD3基因表達(dá)。SOD3基因表達(dá)升高可以促進(jìn)ROS的降解以保護(hù)由于各種原因?qū)е碌腞OS升高引起的損傷，從而解釋了非諾貝特在研究中對(duì)諸如糖尿病引起的腎臟疾病[10,18]、慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓[15]、腦缺血再灌注[4]等各種原因引起損傷的作用機(jī)制。

總之，本研究從基因表達(dá)調(diào)控水平闡明了非諾貝特的保護(hù)作用是通過(guò)激活PPARα的表達(dá)，激活的PPARα與SOD3基因起始密碼子上游的基因啟動(dòng)子序列上的PPRE結(jié)合，以調(diào)節(jié)SOD3的表達(dá)。

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Effect of fenofibrate on SOD3 expression in human BMECs and mouse brain microvascular tissues

DUXiaoshan,YANGXitong,XUHongyang,CHENJianjie,WANGGuangming

(TheFirstAffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali671000,China)

Objective To investigate the regulating effect of fenofibrate, the agonist of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), on the superoxide dismutase 3 (SOD3) expression in human brain microvascular endothelial cells (BMECs) and mouse brain microvascular tissues as well as the possible mechanism. Methods The cultured BMECs were randomly divided into two groups, which were seperately treated with 10 μg/ml of fenofibrate and the same volume of DMSO for 12 h. Fifteen mice were divided into two groups, which were treated with 30 mg/kg fenofibrate and 10 mL/kg of 10% CMC by gavage for 7 days. The tRNA was extracted and the brain microvessel was isolated. The mRNA expression levels of PPARα and SOD3 were detected by RT-PCR. We constructed a luciferase reporter plasmid pGL4 mSOD3 containing SOD3 promoter. The luciferase reporter plasmid pGL4 mu mSOD3 mutated from PPRE sequence were obtained by using the mutagenesis kit. The BMECs were transfected with pGL4 mSOD3 and pGL4 mu mSOD3 for 24 h. The cells were treated with fenofibrate at a final concentration of 10 μg/mL for 12 h in order to measure the luciferase activity.Results The mRNA expression of PPARα and SOD3 was increased in the BMECs and brain microvessel after the treatment of fenofibrate (allP<0.05). The luciferase activity of pGL4 mSOD3 in BMECs treated with fenofibrate was enhanced after transfection of pGL4 mSOD3 for 24 h (P<0.05).The luciferase activity of BMECs treated with fenofibrate did not significantly change after transfection of pGL4 mu mSOD3 for 24 h (P>0.05).Conclusion The SOD3 expression in the human BMECs and mouse brain microvascular tissues is regulated by fenofibrate through activating PPARα.

fenofibrate; extracellular Cu/Zn superoxide dismutase; brain microvascular; brain microvascular endothelial cells

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360206)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才基金項(xiàng)目(2014HB025)。

杜小珊(1990-)，女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)槟X卒中的發(fā)病機(jī)制。E-mail：912096630@qq.com

王光明(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)槟X卒中的發(fā)病機(jī)制。E-mail：gmwang1991@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.002

R743

A

1002-266X(2017)05-0004-04

2016-11-04)