李夢琪，羅胤珠，盧 燕，藍(lán) 海

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

齲病是危害人類口腔健康的一大疾病，是口腔的常見病。在我國人群患齲率為40%，其中兒童高達(dá)80%〔1-2〕。它不僅影響美觀，還給人們的日常生活造成極大的困擾，WHO將其列為重點(diǎn)防治的非傳染性的三大疾病之一。現(xiàn)代研究表明，人類齲病最重要的致病因子主要分為鏈球菌屬（Mutans streptococci）、乳桿菌屬（Lactobacillus Beijerinck）和放線菌屬（actinomyces）〔3-6〕?，F(xiàn)選取鏈球菌屬中的變形鏈球菌、放線菌屬中的黏性放線菌、乳桿菌屬中的嗜酸乳桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

紫地榆（Geranium strictipes）是牦牛兒苗科老鸛草屬植物，藥用部位為根。前期實(shí)驗(yàn)證明，紫地榆的乙酸乙酯、正丁醇等提取部位對致齲菌具有抑制作用〔7-9〕。從紫地榆中分離的物質(zhì)包括沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素等12種成分〔10-11〕。現(xiàn)選取含量較高的沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素4種單體對3種致齲菌變形鏈球菌、黏性放線菌、嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值進(jìn)行測定，為更進(jìn)一步研究紫地榆對致齲菌的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料和儀器

1.1 材料供試菌種為變形鏈球菌（Streptococcus mu?tans）ATCC 25175，黏性放線菌（Actinomyces viscosus）ATCC 277044，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ASI.1854，以上菌株均購于廣東省微生物菌種保藏中心。沒食子酸、沒食子酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品購于山東西亞化學(xué)股份有限公司，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購于上海源葉生物科技有限公司，鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品購于上海麥克林生化科技有限公司，胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物（Trypticase-phytone-yeast extractm edium，TPY）固體及液體培養(yǎng)基、MRS固體及液體培養(yǎng)基均購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），TGL-16A高速離心機(jī)（常州邁科諾儀器有限公司），超凈臺（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司），2.5 L圓底立式厭氧培養(yǎng)袋（青島海博生物技術(shù)有限公司），紫外分光光度計（北京普析通用儀器公司）。

2 方法

2.1 菌液的制備在37℃、80%N2、20%CO2、厭氧條件下用TPY液體培養(yǎng)基（嗜酸乳桿菌用MRS液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)復(fù)蘇48 h后的菌種培養(yǎng)18 h。通過生化鑒定及涂片檢查為純培養(yǎng)后，分別挑取單個菌落于TPY液體培養(yǎng)基（嗜酸乳桿菌用MRS液體培養(yǎng)基）在相同條件下培養(yǎng)18 h增菌，使用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌懸液濃度至0.5 McFarland（108CFU∕mL）備用〔12〕。

2.2 紫地榆中4種單體對3種致齲菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值的影響根據(jù)沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素對3種細(xì)菌的MIC（最小抑菌濃度）和MBC（最小殺菌濃度）的測定結(jié)果，選取MIC值以下的4個濃度梯度配制成TPY液體培養(yǎng)基（嗜酸乳桿菌用MRS液體培養(yǎng)基）。按菌懸液與TPY液體培養(yǎng)基（嗜酸乳桿菌用MRS液體培養(yǎng)基）比例為1：10（v/v）比例接種此菌后，置37 ℃、80%N2，20%CO2、厭氧條件下?lián)u動培養(yǎng)。分別在0、2、4、6、8、10 h時取樣液5 mL，3 000 r∕min離心15 min，取上清液備用。用紫外分光光度計在260 nm處測定上清液中DNA、RNA等大分子物質(zhì)的吸光度。陰性對照組為不含藥物的培養(yǎng)基中細(xì)菌的吸光度，陽性對照組為含0.05%洗必泰的培養(yǎng)基中的細(xì)菌吸光度〔13〕。每組有3個平行管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果和分析

本實(shí)驗(yàn)測定的是紫地榆中4種單體對3種致齲菌作用后細(xì)菌的培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的外漏量。因?yàn)榇蠓肿游镔|(zhì)如DNA、RNA等在260 nm波長處有較強(qiáng)的吸收，所以用大分子物質(zhì)在260 nm波長處的吸收值的變化推測細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。在0～8 h內(nèi)，沒食子酸0.5～2.0 mg∕mL、沒食子酸甲酯1～2 mg∕mL、兒茶素0.125～0.500mg∕mL、鞣花酸0.25～0.50 mg∕mL對變形鏈球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的作用效果優(yōu)于陽性藥物。見圖1。

在0～10h內(nèi)，沒食子酸0.5～2.0mg∕mL、沒食子酸甲酯0.125～1.000mg∕mL、兒茶素0.0625～0.2500mg∕mL、鞣花酸0.031 25～0.250 00 mg∕mL對黏性放線菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的作用效果優(yōu)于陽性藥物。見圖2。

在0～8 h內(nèi)，沒食子酸0.25～2.00 mg∕mL、沒食子酸甲酯0.25～1.00 mg∕mL、兒茶素0.25～1.00 mg∕mL、鞣花酸0.125～0.500 mg∕mL對嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的作用效果優(yōu)于陽性藥物。見圖3。

圖1 紫地榆中4種單體對變形鏈球菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值的影響

圖2 紫地榆中4種單體對黏性放線菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值的影響

圖3 紫地榆中4種單體對嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值的影響

由圖1～3可以看出沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸4種單體對變形鏈球菌、黏性放線菌、嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的外漏有增強(qiáng)作用。并且隨時間和藥物濃度的增加，大分子物質(zhì)的吸光值逐漸增大。由實(shí)驗(yàn)可以看出與空白組相比，4種單體可明顯增加大分子物質(zhì)在260 nm的吸光值，表明細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)外漏，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對紫地榆中的4種單體對3種致齲菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示不同濃度的沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸均能增加變形鏈球菌、黏性放線菌、嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)的吸光值，且隨時間和藥物濃度的增加而增大。

在0～2 h內(nèi)吸光值變化較小，主要原因?yàn)榧?xì)菌數(shù)量較少，培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)較少。在2～8 h內(nèi)細(xì)菌成對數(shù)級增長，此時藥物對細(xì)菌作用明顯，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)菌內(nèi)大分子物質(zhì)外漏，培養(yǎng)液的吸光值增加。8 h以后，細(xì)菌生長緩慢，細(xì)菌內(nèi)大分子外漏減少，培養(yǎng)液的吸光值增長變緩。實(shí)驗(yàn)中隨濃度增加，培養(yǎng)液的吸光值越大，是因?yàn)樗幬餄舛仍酱?，對?xì)菌的細(xì)胞膜破壞越大，細(xì)菌內(nèi)大分子外漏越多，培養(yǎng)液吸光值越大。與陽性對照組相比，大多數(shù)組的效果優(yōu)于陽性對照組，說明紫地榆中4種單體對3種致齲菌的細(xì)胞膜有破壞作用。推測其原因可能是沒食子酸等4種單體誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生了某些酶，降解了細(xì)胞膜，或者是藥物與菌體細(xì)胞膜結(jié)合，破壞了細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏。

綜上所述，不同濃度的沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸能增加變形鏈球菌、黏性放線菌、嗜酸乳桿菌細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞膜的完整性遭到破壞。為研究紫地榆在防齲方面的作用提供了理論依據(jù)，對齲病的進(jìn)一步研究和開發(fā)新型防齲藥物提供幫助。

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