周喆，魯燕華，孟琴

(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州310027)

非諾貝特對(duì)凝膠包埋培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞的毒性

周喆，魯燕華，孟琴

(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州310027)

目的研究非諾貝特對(duì)凝膠包埋培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞內(nèi)氧化壓力和脂質(zhì)含量的影響。方法將收獲得到的新鮮原代大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行膠原凝膠包埋，構(gòu)建肝細(xì)胞體外凝膠包埋培養(yǎng)模型，同時(shí)構(gòu)建傳統(tǒng)平板模型作為對(duì)照。在肝細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入非諾貝特25和100 μmol·L－1，分別于培養(yǎng)3和7 d后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧類(ROS)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)含量，并用尼羅紅和油紅O對(duì)細(xì)胞內(nèi)中性脂滴進(jìn)行定量分析和染色觀察。結(jié)果平板模型非諾貝特各組之間沒(méi)有顯著性差異，而凝膠包埋模型非諾貝特各組之間差異明顯。對(duì)于凝膠包埋模型，非諾貝特25和100 μmol·L－1均導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS增加，其中非諾貝特處理3 d組細(xì)胞內(nèi)ROS分別為對(duì)照組的(131±19)%和(149±10)%，非諾貝特處理7 d組細(xì)胞內(nèi)ROS分別為正常對(duì)照組的(121±8)%和(117±5)%(P＜0.01);非諾貝特還導(dǎo)致了胞內(nèi)MDA含量、TG和中性脂含量的顯著增加(P＜0.05)。結(jié)論凝膠包埋培養(yǎng)原代大鼠肝細(xì)胞作為體外培養(yǎng)模型相對(duì)于平板模型能更好地反映非諾貝特的肝毒性作用。

非諾貝特;共同培養(yǎng)技術(shù);肝;毒性作用

非諾貝特(fenofibrate)作為第二代貝特類降血脂藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。具有降低血液中甘油三酯(triglycerides，TG)、升高血液中高密度脂蛋白膽固醇等作用。在體內(nèi)，非諾貝特能調(diào)控脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶、乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合成酶等基因的表達(dá)，從而影響胞內(nèi)脂肪代謝［1－2］。雖然非諾貝特在臨床上被認(rèn)為是安全的，但是在嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)非諾貝特會(huì)引發(fā)肝毒性［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道服用非諾貝特后的小鼠體內(nèi)肝TG含量上升［4］。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是非諾貝特雖然促進(jìn)了肝中脂肪酸的代謝(氧化、轉(zhuǎn)運(yùn)和合成)，但脂肪酸的氧化速率仍低于轉(zhuǎn)運(yùn)和合成速率，最終導(dǎo)致肝中脂質(zhì)的堆積。此外，體內(nèi)報(bào)道非諾貝特可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而引起胞內(nèi)過(guò)氧化壓力并進(jìn)一步造成DNA損傷［5－7］。

然而，目前尚未見(jiàn)體外肝細(xì)胞培養(yǎng)反映非諾貝特在嚙齒類動(dòng)物中造成的肝毒性，可能與體外二維單層貼壁培養(yǎng)模型不能較好地反映肝的脂質(zhì)代謝情況有關(guān)。單層貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞很快喪失肝分化功能，其代謝情況與體內(nèi)差別較大，且在毒性評(píng)價(jià)過(guò)程中易產(chǎn)生假陰性結(jié)果［8］。本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的凝膠包埋肝細(xì)胞模型，能夠較好地模擬體內(nèi)細(xì)胞間微環(huán)境保證代謝功能的長(zhǎng)期維持，且可以成功反映利福平、四環(huán)素和硫唑嘌呤等20種藥物的體內(nèi)肝毒性［9－11］。

本實(shí)驗(yàn)采用凝膠包埋培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞作為體外肝細(xì)胞模型考察非諾貝特的毒性影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量200～250 g，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK浙2008-0033，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥品與試劑

非諾貝特，尼羅紅，胰島素，地塞米松，表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor，EGF)和高血糖素Ⅳ型膠原酶由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，William E培養(yǎng)基由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)，胎牛血清由杭州四季青牧場(chǎng)生產(chǎn)，L-谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素由美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)。Ⅰ型膠原參考文獻(xiàn)中的方法［8］由實(shí)驗(yàn)室自行制備。雙氫羅丹明購(gòu)自德國(guó)Invitrogen公司。甘油三酯檢測(cè)試劑盒由寧波塞克生物技術(shù)有限公司提供。其余藥品與試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純?cè)噭?/p>

1.3 肝細(xì)胞的收獲與培養(yǎng)

肝細(xì)胞的收獲和膠原凝膠培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)［14］。大鼠ip麻醉后，門靜脈插針固定，用37℃灌流液Ⅰ(g·L－1:NaCl 8.3，KCl 0.5，EGTA 0.95)灌流10 min后改用含0.05 g·L－1膠原酶的灌流液Ⅱ(g·L－1:NaCl 3.9，KCl 0.5，CaCl20.7)灌流10 min。將分離得到的的肝細(xì)胞純化處理后，進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞活率高于85%時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞收獲下來(lái)之后，首先在4℃下將4×William E濃縮培養(yǎng)基與鼠尾Ⅰ型膠原按1∶3的體積比混合后，調(diào)節(jié)pH至7.4。原代大鼠肝細(xì)胞1×109L－1加入膠原與培養(yǎng)基的混合溶液中并混合均勻。將細(xì)胞培養(yǎng)于中空纖維絲內(nèi)并置入6孔板底部。在孔板中加入培養(yǎng)基并放入5%CO2培養(yǎng)相中于37℃培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞分組

細(xì)胞包埋完成后，加入William E培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基添加成分有L-谷氨酰胺2 mmol·L－1、青霉素100 kU·L－1、鏈霉素100 mg·L－1、地塞米松1 μmol·L－1、胰島素0.2 kU·L－1、高血糖素4 μg·L－1、表皮生長(zhǎng)因子5 μg·L－1以及5%胎牛血清。在非諾貝特組培養(yǎng)基中添加非諾貝特母液使其終濃度分別為25和100 μmol·L－1。每2 d更換1次培養(yǎng)基，并重新加藥。在培養(yǎng)的第3天和第7天取樣并進(jìn)行分析。在考察非諾貝特對(duì)細(xì)胞利用游離脂肪酸的實(shí)驗(yàn)中，添加了非諾貝特25 μmol·L－1及棕櫚酸200 μmol·L－1，2 d后檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)TG含量。

1.5 熒光染色檢測(cè)ROS

采用雙氫羅丹明123染料檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)ROS。細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的熒光強(qiáng)度，反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將凝膠包埋的細(xì)胞從中空絲中打出，迅速置于雙氫羅丹明10 μmol·L－1的PBS中，37℃溫育30 min。用熒光酶標(biāo)儀(Tecan公司，德國(guó))讀取熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm［13］。ROS(%)=加藥組熒光值/正常組熒光值×100%。

1.6 硫代巴比妥酸(TBA)檢測(cè)丙二醛(MDA)含量

MDA用反應(yīng)檢測(cè)［14］。在冰浴環(huán)境下將凝膠包埋的細(xì)胞收集至1.5 ml離心管中，加入0.3 ml磷酸0.88 mmol·L－1和0.1 ml TBA溶液42 mmol·L－1，然后將離心管封口并置于沸水中，1 h后取出離心管并離心5 min(8000×g)除去細(xì)胞碎片。對(duì)反應(yīng)后的樣品用1100型高效液相色譜進(jìn)行分析(美國(guó)安捷倫公司)，分離柱為ChromSpher C18栓(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為甲醇-磷酸緩沖液0.01 mmol·L－1(pH 7.0)=65∶35，流速為1 ml·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為532 nm。

1.7 甘油三酯含量的測(cè)定

4℃下將凝膠包埋的細(xì)胞放入PBS中并超聲破胞。向破胞后的混合液中加入氯仿/甲醇(2∶1)萃取其中的脂肪［15］。室溫下使氯仿?lián)]發(fā)干凈并用6 μl正丁醇溶解剩余的脂肪。最后用甘油三酯測(cè)定試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)TG含量。

1.8 尼羅紅熒光檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)中性脂

將凝膠包埋的細(xì)胞從中空絲中打出，迅速置于含尼羅紅3 μmol·L－1的PBS中，37℃溫育30 min。用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為580 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為630 nm［10］。尼羅紅(%)=加藥組熒光值/正常組熒光值×100%。

1.9 油紅O染色檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)中性脂

稱取1 g油紅O固體，加入100 ml異丙醇，并置于80℃水浴加熱1 h，使其充分溶解，冷卻后用濾紙過(guò)濾。按1∶1的比例，加入去離子水，混勻后靜置1 h以上，用濾紙過(guò)濾。

將細(xì)胞培養(yǎng)樣品用10%甲醛(V/V)固定2 h以上，除去甲醛，加入20%異丙醇水溶液。清洗數(shù)秒鐘后，加入過(guò)濾好的油紅O染液，染色10 min，除去油紅O染液。加入50%異丙醇溶液，洗滌10 s，重復(fù)2遍后在顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.10 實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS10.0軟件，各組均數(shù)先行方差齊性檢驗(yàn)，樣本均數(shù)的比較采用方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 非諾貝特對(duì)凝膠包埋培養(yǎng)的肝細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

凝膠包埋的肝細(xì)胞內(nèi)ROS分析結(jié)果如圖1A所示。藥物處理3 d后，非諾貝特25和100 μmol·L－1均顯著增加肝細(xì)胞內(nèi)ROS的積累量，分別從正常對(duì)照組的(100±9)%增加到(131±19)%和(149±10)%。加藥7 d后，非諾貝特25和100 μmol·L－1處理又分別使得肝細(xì)胞內(nèi)ROS積累量增加至對(duì)照組的(121±8)%和(117±5)%。但是，對(duì)兩個(gè)濃度處理組進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)，3 d時(shí)ROS的積累量隨非諾貝特濃度增加而增加，即非諾貝特100 μmol·L－1組ROS積累量顯著大于非諾貝特25 μmol·L－1組，但這種濃度依賴性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)(7 d)而消失。圖1B顯示的是非諾貝特對(duì)傳統(tǒng)平板培養(yǎng)模型中肝細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。由于該平板培養(yǎng)肝細(xì)胞在7 d時(shí)很難存活，對(duì)各項(xiàng)細(xì)胞指標(biāo)的檢測(cè)毫無(wú)意義，因此只在3 d取樣進(jìn)行分析。由圖可以看出在平板模型中，兩個(gè)濃度的非諾貝特均沒(méi)有導(dǎo)致ROS上升，各組之間沒(méi)有顯著性差異，這與體內(nèi)報(bào)道的趨勢(shì)不符。

圖1 非諾貝特對(duì)凝膠包埋(A)和平板(B)模型中肝細(xì)胞活性氧類(ROS)的影響.平板培養(yǎng)的細(xì)胞3 d取樣.采用雙氫羅丹明熒光染色法檢測(cè)ROS.ROS(%)=加藥組熒光值/正常培養(yǎng)組熒光值×100%.xˉ±s，n=3.＊＊P＜0.01，與正常對(duì)照組比較.Fig.1 Effect of fenofibrate on reactive oxygen species(ROS)of hepatocytes in gel entrapped(A)and monolayer(B)culture models.

2.2 非諾貝特對(duì)凝膠包埋培養(yǎng)的肝細(xì)胞MDA含量的影響

由圖2A分析結(jié)果可知，在凝膠包埋模型中，非諾貝特25和100 μmol·L－1在3 d時(shí)MDA已經(jīng)出現(xiàn)了增多，分別為正常對(duì)照組的(113±8)%和(110±6)%。7 d時(shí)非諾貝特組胞內(nèi)MDA繼續(xù)上升，分別為正常對(duì)照組的(127±16)%和(125±21)%。這一結(jié)果與圖1A中ROS的變化情況是一致的，說(shuō)明非諾貝特增加了肝細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，并進(jìn)一步導(dǎo)致了胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化。而在平板培養(yǎng)模型中，非諾貝特均能使胞內(nèi)MDA出現(xiàn)顯著上升，但非諾貝特25和100 μmol·L－1之間無(wú)顯著性差異(圖2B)。

2.3 非諾貝特對(duì)凝膠包埋培養(yǎng)的肝細(xì)胞甘油三酯的含量影響

圖2 非諾貝特對(duì)凝膠包埋(A)和平板(B)模型中肝細(xì)胞丙二醛含量(MDA)的影響.分組處理同圖1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，與正常對(duì)照組比較.Fig.2 Effect of fenofibrate on malonaldehyde(MDA)content of hepatocytes in gel entrapped(A)and monolayer(B)culture models.

凝膠包埋(圖3A)和平板培養(yǎng)(圖3B)3 d的肝細(xì)胞內(nèi)TG含量分別為18.5±2.8和(58.1±20.4)μmol·g－1蛋白。而文獻(xiàn)報(bào)道的體內(nèi)值為(15.6±2.6)μmol·g－1蛋白。很顯然，凝膠包埋的肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量更接近體內(nèi)值。培養(yǎng)3 d后，與凝膠包埋的正常對(duì)照組相比，非諾貝特25和100 μmol·L－1組胞內(nèi)TG的含量分別為24.7±5.0和(25.2±5.0)μmol·g－1蛋白。培養(yǎng)7 d后，凝膠包埋正常對(duì)照組肝細(xì)胞TG含量為(23.3±5.9)μmol·g－1蛋白，非諾貝特25和100 μmol·L－1組肝細(xì)胞內(nèi)TG含量則分別增加到30.2±4.2和(28.0±4.7)μmol·g－1蛋白。提示非諾貝特使肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了脂肪積累的現(xiàn)象。而在平板培養(yǎng)模型(圖3B)中，非諾貝特都沒(méi)有造成胞內(nèi)TG含量的顯著變化。

2.4 非諾貝特對(duì)凝膠包埋的肝細(xì)胞中性脂的影響

圖3 非諾貝特對(duì)凝膠包埋(A)和平板模型(B)中肝細(xì)胞甘油三酯含量的影響.細(xì)胞處理同圖1.甘油三酯含量用酶法劑盒檢測(cè).xˉ±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與正常對(duì)照組比較.Fig.3 Effect of fenofibrate on intracellular TG content of hepatocytes in gel entrapped(A)and monolayer(B)culture models.

圖4 非諾貝特對(duì)凝膠包埋(A)和平板(B)模型中肝細(xì)胞中性脂含量的影響.細(xì)胞處理同圖1.用尼羅紅熒光染色法檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)中性脂.xˉ±s，n=3.＊＊P＜0.01，與正常對(duì)照組比較.Fig.4 Effect of fenofibrate on intracellular natural lipid level of hepatocytes in gel entrapped(A)and monolayer(B)culture models.

細(xì)胞尼羅紅熒光染色分析，結(jié)果如圖4所示。對(duì)于凝膠包埋模型培養(yǎng)的細(xì)胞，加藥3 d后，非諾貝特25和100 μmol·L－1分別使尼羅紅熒光值提高為正常對(duì)照組的(146±15)%和(139±19)%。加藥7 d后，非諾貝特組的胞內(nèi)熒光值雖略有下降但仍比正常對(duì)照組高，分別是正常對(duì)照組的(118±7)%和(130±14)%。尼羅紅熒光分析結(jié)果顯示，非諾貝特能導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累。而平板模型培養(yǎng)的細(xì)胞各加藥組之間卻并沒(méi)有顯著的區(qū)別(圖4B)。凝膠包埋模型加藥3 d和7 d后各組肝細(xì)胞油紅O染色。結(jié)果如圖5所示。藥物作用3 d后，細(xì)胞內(nèi)中性脂滴明顯多于正常對(duì)照組，且非諾貝特25 μmol·L－1組脂滴最多。培養(yǎng)7 d后，非諾貝特組胞內(nèi)脂滴積累情況更嚴(yán)重，脂滴有增多、變大的趨勢(shì)。油紅O染色分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證非諾貝特作用會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累。

圖5 光學(xué)顯微鏡下凝膠包埋的肝細(xì)胞中性脂的影響油紅O染色(×400).細(xì)胞處理同圖1.A:培養(yǎng)3 d;B:培養(yǎng)7 d.1－3分別為正常對(duì)照、非諾貝特25和100 μmol·L－1組.Fig.5 Light microscopic morphology of intracellular neutral lipid drops in gel entrapped hepatocytes stained with Oil red O(×400).

2.5 非諾貝特對(duì)凝膠包埋肝細(xì)胞利用游離脂肪酸的影響

為了進(jìn)一步闡述非諾貝特對(duì)凝膠細(xì)胞脂肪代謝能力的影響，選用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)該肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并添加棕櫚酸200 μmol·L－1，考察脂肪酸單獨(dú)使用及其與非諾貝特25 μmol·L－1合用兩種情況對(duì)肝細(xì)胞胞內(nèi)脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用。由圖6可以看出，經(jīng)過(guò)2 d的作用，非諾貝特組細(xì)胞內(nèi)TG含量與正常對(duì)照組基本持平，而外加棕櫚酸的細(xì)胞組胞內(nèi)TG含量是正常對(duì)照組的1.44倍。棕櫚酸和非諾貝特的共同作用尤其顯著，可使細(xì)胞內(nèi)TG含量升高至正常對(duì)照組的1.93倍。

圖6 非諾貝特對(duì)凝膠包埋的大鼠肝細(xì)胞利用脂肪酸能力的影響.培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基中.在培養(yǎng)過(guò)程中加入棕櫚酸200 μmol·L－1或非諾貝特25μmol·L－1，或添加兩者的混合物.2 d后檢測(cè)胞內(nèi)TG含量.xˉ±s，n=3.＊＊P＜0.01，與正常對(duì)照組比較.Fig.7 Effect of utility of fenofibrate on free fatty acid in gel entrapped hepatocytes.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平板培養(yǎng)肝細(xì)胞對(duì)非諾貝特的處理沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的脂肪堆積和氧化壓力，而凝膠培養(yǎng)肝細(xì)胞卻表現(xiàn)出與體內(nèi)相符的毒性反應(yīng)。凝膠培養(yǎng)肝細(xì)胞經(jīng)過(guò)非諾貝特的處理，出現(xiàn)ROS和MDA等氧化應(yīng)激標(biāo)志物的上升、過(guò)量脂質(zhì)的堆積現(xiàn)象，而油紅O染色分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了非諾貝特作用促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脂肪積累的現(xiàn)象。由上面的結(jié)果可知，凝膠包埋模型對(duì)于非諾貝特的短期作用比較敏感，更接近體內(nèi)情況。肝細(xì)胞的不同培養(yǎng)模式對(duì)非諾貝特的不同毒性反應(yīng)可能與其細(xì)胞本身的差異性表現(xiàn)有關(guān)。在無(wú)任何藥物處理的正常培養(yǎng)情況下，平板和凝膠包埋培養(yǎng)的肝細(xì)胞胞內(nèi)TG含量分別為58.1±20.4和(18.5±2.8)μmol·g－1蛋白，而文獻(xiàn)報(bào)道的體內(nèi)值為(15.6±2.6)μmol·g－1蛋白，可見(jiàn)凝膠包埋的肝細(xì)胞內(nèi)TG含量更接近體內(nèi)值。以往文獻(xiàn)也曾報(bào)道過(guò)平板培養(yǎng)情況下脂質(zhì)嚴(yán)重堆積的情況［16］。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常平板培養(yǎng)下的氧化應(yīng)激的絕對(duì)值比凝膠包埋的要高出很多，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差距更大(實(shí)驗(yàn)室前期數(shù)據(jù))。此外，采用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代大鼠肝細(xì)胞有無(wú)添加非諾貝特的培養(yǎng)，進(jìn)一步闡述凝膠培養(yǎng)肝細(xì)胞可反映非諾貝特促進(jìn)游離脂肪酸的代謝能力。

綜上所述，相對(duì)于平板培養(yǎng)，凝膠包埋作為一種三維擬組織化的體外肝細(xì)胞培養(yǎng)方式，能較為準(zhǔn)確地模擬藥物作用后的體內(nèi)情況，較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)非諾貝特的肝毒性并能對(duì)其致毒機(jī)制作出一定的闡釋，為體外藥物的藥效、藥理，以及藥物毒性研究提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。

［1］Chen X，Matthews J，Zhou L，Pelton P，Liang Y，Xu J，et al.Improvement of dyslipidemia，insulin sensitivity，and energy balance by a peroxisome proliferator-activated receptor alpha agonist［J］.Metabolism，2008，57(11):1516-1525.

［2］Guo Y，Jolly RA，Halstead BW，Baker TK，Stutz JP，Huffman M，et al.Underlying mechanisms of pharmacology and toxicity of a novel PPAR agonist revealed using rodent and canine hepatocytes［J］.Toxicol Sci，2007，96(2):294-309.

［3］Nishimura J，Dewa Y，Okamura T，Muguruma M，Jin M，Saegusa Y，et al.Possible involvement of oxidative stress in fenofibrate-induced hepatocarcinogenesis in rats［J］.Arch Toxicol，2008，82(9):641-654.

［4］Oosterveer MH，Grefhorst A，van Dijk TH，Havinga R，Staels B，Kuipers F，et al.Fenofibrate simultaneously induces hepatic fatty acid oxidation，synthesis，and elongation in mice［J］.J Biol Chem，2009，284(49):34036-34044.

［5］Arnaiz SL，Travacio M，Llesuy S，Boveris A.Hydrogen peroxide metabolism during peroxisome proliferation by fenofibrate［J］.Biochim Biophys Acta，1995，1272(3):175-180.

［6］Nishimura J，Dewa Y，Muguruma M，Kuroiwa Y，Yasuno H，Shima T，et al.Effect of fenofibrate on oxidative DNA damage and on gene expression related to cell proliferation and apoptosis in rats［J］.Toxicol Sci，2007，97(1):44-54.

［7］Nishimura J，Dewa Y，Okamura T，Jin M，Saegusa Y，Kawai M，et al.Role of Nrf2 and oxidative stress on fenofibrate-induced hepatocarcinogenesis in rats［J］.Toxicol Sci，2008，106(2):339-349.

［8］Zhang L，Mu X，F(xiàn)u J，Zhou Z.In vitro cytotoxicity assay with selected chemicals using human cells to predict target-organ toxicity of liver and kidney［J］.Toxicol In Vitro，2007，21(4):734-740.

［9］Shen C，Cheng X，Li D，Meng Q.Investigation of rifampicin-induced hepatotoxicity in rat hepatocytes maintained in gel entrapment culture［J］.Cell Biol Toxicol，2009，25(3):265-274.

［10］Meng Q.Three-dimensional culture of hepatocytes for prediction of drug-induced hepatotoxicity［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2010，6(6):733-746.

［11］Rajan N，Habermehl J，Coté MF，Doillon CJ，Mantovani D.Preparation of ready-to-use，storable and reconstituted typeⅠcollagen from rat tail tendon for tissue engineering applications［J］.Nat Protoc，2006，1(6):2753-2758.

［12］Wu DQ，Zhang GL，Shen C，Zhao Q，Li H，Meng Q.Evaluation of diffusion in gel entrapment cell culture within hollow fibers［J］.World J Gastroenterol，2005，11(11):1599-1604.

［13］Qu B，Li QT，Wong KP，Tan TM，Halliwell B.Mechanism of clofibrate hepatotoxicity:mitochondrial damage and oxidative stress in hepatocytes［J］.Free Radic Biol Med，2001，31(5):659-669.

［14］Wong SH，Knight JA，Hopfer SM，Zaharia O，Leach CN Jr，Sunderman FW Jr.Lipoperoxides in plasma as measured by liquid-chromatographic separation of malondialdehyde-thiobarbituric acid adduct［J］.Clin Chem，1987，33(2 Pt 1):214-220.

［15］El-Assal O，Hong F，Kim WH，Radaeva S，Gao B.IL-6-deficient mice are susceptible to ethanol-induced hepatic steatosis:IL-6 protects against ethanol－induced oxidative stress and mitochondrial permeability transition in the liver［J］.Cell Mol Immunol，2004，1(3):205-211.

［16］Shen C，Meng Q，Schmelzer E，Bader A.Gel entrapment culture of rat hepatocytes for investigation of tetracycline-induced toxicity［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，238(2):178-187.

Toxic effect of fenofibrate on gel entrapped primary rat hepatocytes

ZHOU Zhe，LU Yan-hua，MENG Qin
(Department of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou310027，China)

OBJECTIVETo explore effect of fenofibrate on oxidative stress and intracellular lipid content of collagen gel-entrapped primary rat hepatocytes.METHODSPrimary rat hepatocytes were gel-entrapped in hollow fiber or on monolayer as contrast after harvest.During the culture，fenofibrate 25 μmol·L－1and 100 μmol·L－1were added.After 3 and 7 d treatment，intracellular reactive oxygen species(ROS)，malondialdehyde(MDA)and triglycerides(TG)contents were determined.The intracellular neutral lipid drops stained with both oil red O and Nile red were quantified and observed by light microscope，respectively.RESULTThere were no significant difference between these groups in monolayer model.However，in the gel-entrapped model，distinct differences among groups was discovered.After 3 and 7 d treatment，both fenofibrate 25 and 100 μmol·L－1induced the accumulation of intracellular ROS.Compared with normal control group，fenofibrate 25 and 100 μmol·L－1increased the intracellular ROS up to(131±19)%and(149±10)%on the third day，but on the seventh day，ROS level was(121±8)%and(117±5)%，respectively.Fenofibrate also induced the increasing in intracellular MDA content and the accumulation of intracellular TG and neutral lipid drops(P＜0.05).CONCLUSIONGel entrapment culture of primary rat hepatocytes better reflects the toxic effect of fenofibrate demonstrated by the increasing in the intracellular oxidative stress and intracellular lipid accumulation.

fenofibrate;co-culture techniques;liver;toxic actions

The project supported by National Natural Science Foundation of China(21076186)

MENG Qin，E-mail:mengq@zju.edu.cn，Tel:(0571)87953193

R972.6，R965.2

A

1000-3002(2011)05-0463-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.009

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21076186)

周喆(1987－)，男，碩士研究生，主要從事組織工程學(xué)研究。孟琴(1966－)，女，教授，博士，主要從事細(xì)胞組織工程學(xué)研究。

孟琴，E-mail:mengq@zju.edu.cn，Tel:(0571)87953193

2011-01-26接受日期:2011-05-24)

(本文編輯:付良青)