陳 浩，劉曉薇 ，沈 怡，崔淑君，肖朝江，姜 北 *

（1.大理大學(xué)藥物研究所，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

瘧疾（Malaria）是當(dāng)今社會(huì)中對(duì)人體健康危害最為嚴(yán)重的主要寄生蟲(chóng)病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織相關(guān)的報(bào)道，全球每年患病的人數(shù)高達(dá)1.49～3.03億，其中死亡人數(shù)近百萬(wàn)。2015年全球95個(gè)瘧疾傳播的國(guó)家和地區(qū)共有2.14億臨床病例，其中88%的瘧疾病例和90%的死亡病例發(fā)生于非洲地區(qū)，少數(shù)發(fā)生于東南亞地區(qū)〔1〕。瘧原蟲(chóng)作為瘧疾的病原體，目前已知有200余種，寄生于人體內(nèi)的共有5種，即間日瘧原蟲(chóng)（Plasmodium vivax）、三日瘧原蟲(chóng)（P.malariae）、惡性瘧原蟲(chóng)（P.falciparum）、卵形瘧原蟲(chóng)（P.ovale）、諾氏瘧原蟲(chóng)（P.knowlesi），分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧、卵形瘧和諾氏瘧。在我國(guó)主要以間日瘧原蟲(chóng)和惡性瘧原蟲(chóng)為主〔2〕。但隨著近幾年我國(guó)前往非洲務(wù)工人員的增加，其余3種感染病例也在逐年上升〔3〕。與此同時(shí)，由于抗瘧藥的不斷使用，瘧原蟲(chóng)已對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性，甚至出現(xiàn)了多重耐藥性〔4-5〕。因此，研發(fā)新一代的抗瘧藥物刻不容緩。云南植物資源豐富，利用該地區(qū)植物資源多樣性進(jìn)行新型抗瘧先導(dǎo)成分研究具有極大的可行性。為此本課題組前期采用β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)〔6-9〕，對(duì)采自云南西部地區(qū)64種植物的128個(gè)供試樣品進(jìn)行了抗瘧活性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大紅袍粗提物具有較好的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性。大紅袍系豆科（Leguminosae）杭子梢屬（Campy?lotropis）植物毛杭子梢［Campylotropis hirtellae（Franch.）Schindl.］的干燥根，主要分布于我國(guó)四川、貴州、西藏、云南等地〔10〕，具有止痛活血、調(diào)經(jīng)、收斂的功效〔11〕。為追蹤其抗瘧活性成分，本實(shí)驗(yàn)采用柱色譜和波譜學(xué)技術(shù)對(duì)活性部位進(jìn)行成分分離和結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果從活性較好的乙酸乙酯部位分離鑒定了3個(gè)主要成分，分別是兒茶素（1）、胡蘿卜苷（2）、大豆腦苷I（3）。見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1～3的結(jié)構(gòu)

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所用大紅袍（Radix Campy?lotropidis Hirtellae）植物樣品于2016年7月采自云南省大理市洱源縣煉鐵鄉(xiāng)，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥學(xué)教研室張德全博士鑒定，植物標(biāo)本現(xiàn)保存于大理大學(xué)藥物研究所姜北教授課題組，標(biāo)本編號(hào)為20160710-3b。

1.2 儀器與試劑BioTek Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（BioTek Instruments Inc.）；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Bruker Avance III-400核磁共振波譜儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）；CoolSafe 95-15冷凍干燥機(jī)（丹麥LaboGene公司）；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）、氯喹二磷酸鹽、氯高鐵血紅素（美國(guó)Sigma公司）；乙酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸、吡啶（上海申博化工有限公司）；氫氧化鈉（重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；二甲基亞砜（天津化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（西隴化工股份有限公司），甲醇、丙酮、氯仿等試劑均為工業(yè)級(jí)有機(jī)溶劑均重蒸后使用；其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取分離大紅袍（24.1 kg）粉碎后以95%乙醇共冷浸提取6次，減壓濃縮所得總浸膏用適量水充分混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行分配，即得相應(yīng)萃取物。其乙酸乙酯萃取物浸膏（470.0 g）用適量粗硅膠（80～100目）混合拌樣后經(jīng)200～300目硅膠柱層析，采用氯仿-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫（1：0至0：1），經(jīng)TLC檢測(cè)后合并相同的流分共得19個(gè)組分（A～S）。其中，組分O經(jīng)硅膠柱層析（氯仿-丙酮）得到化合物1（4.30 g）。組分M經(jīng)大孔樹(shù)脂（甲醇-水）和Sephadex LH-20（氯仿：甲醇=1：1）柱色譜得到化合物2（1.02g）和化合物3（1.41g）。2.2 β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)試方法 β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)試方法參照文獻(xiàn)〔6-9〕，并將其進(jìn)行適當(dāng)改良后按照如下操作進(jìn)行，即將50 μL不同濃度的供試樣品和50 μL氯高鐵血紅素儲(chǔ)備液（1.0 mmol∕L）分別加于96孔板中，平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；同時(shí)設(shè)置蒸餾水溶媒對(duì)照組和氯喹陽(yáng)性對(duì)照組。然后每孔加入80 μL醋酸鹽緩沖液（pH 5.0，4 mol∕L），置于50 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，取出96孔板，待其恢復(fù)至室溫后向每孔加入100 μL 30%（v/v）的吡啶-HEPES（pH 7.5，20 mmol∕L）溶液使96孔板中的固體充分混懸，室溫放置待未反應(yīng)的羥高鐵血紅素溶解完全后；于每孔中移取50 μL上清液至另一96孔板中，之后向每孔中加入200 μL吡啶-HEPES溶液進(jìn)行稀釋，并將其置于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。由羥高鐵血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線得出未反應(yīng)的羥高鐵血紅素的濃度，計(jì)算出供試品對(duì)β-羥高鐵血紅素形成的抑制濃度（以IC50表示）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 受試樣品的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)定結(jié)果參照“2.2”的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)大紅袍粗提物以及其各溶劑相應(yīng)萃取物進(jìn)行了β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)定。見(jiàn)表1。從表1中可以看出，大紅袍的粗提物及各溶劑相應(yīng)萃取部位都具有較好的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，其中活性最佳脂溶性部位為乙酸乙酯部位，IC50值為（232.7±12.4）μg∕mL。因此，該研究利用硅膠和大孔樹(shù)脂等柱層析技術(shù)方法對(duì)活性最好的乙酸乙酯部位進(jìn)行活性追蹤。結(jié)果從中分離得到3個(gè)化合物，其中化合物1具有一定的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性。見(jiàn)表2。

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定化合物1：淡黃色粉末。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.83（1H，d，J=1.9Hz，H-2′），6.76（1H，d，J=8.1Hz，H-5′），6.71（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），5.92（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），5.84（1H，d，J=2.3 Hz，H-6），4.55（1H，d，J=7.5 Hz，H-2），3.97（1H，dt，J=7.9，5.4 Hz，H-3），2.84（1H，dd，J=16.1，5.4 Hz，H-4a），2.50（1H，dd，J=16.1，8.2 Hz，H-4b）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：82.9（C-2），68.8（C-3），28.6（C-4），157.8（C-5），96.2（C-6），157.6（C-7），95.4（C-8），156.9（C-9），100.8（C-10），132.2（C-1′），115.2（C-2′），146.3（C-3′），146.2（C-4′），116.0（C-5′），120.0（C-6′）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔12〕報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物1為兒茶素。

表1 大紅袍粗提物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)定結(jié)果（±s，n=3）

表1 大紅袍粗提物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)定結(jié)果（±s，n=3）

不同濃度（μg∕mL）植物提取物的β-羥高鐵血紅素形成抑制率∕%樣品名IC50∕(μg∕mL)氯喹二磷酸鹽粗提物石油醚萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物萃余水相1 388.9 81.7±3.6 51.6±9.8-8.5±1.3 10.7±3.3 49.1±4.4 84.0±1.2 277.8 82.2±3.1 65.6±2.3 54.4±2.3 57.8±5.1 51.4±0.9 68.0±1.6 55.6 82.4±5.3 8.3±0.3 0.5±3.5 21.8±11.5-4.9±2.8-1.2±2.8 11.1 1.0±3.2 2.5±1.7 0.2±0.4-1.6±3.0-0.5±1.8-1.1±0.5 2.2-1.1±1.5 5.3±3.7-1.8±2.1 1.9±2.4-0.9±6.4 1.3±1.4 36.6±1.8 214.4±8.7 262.0±9.6 232.7±12.4 279.6±3.2 215.2±3.3

表2 大紅袍中單體化合物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)定結(jié)果（±s，n=3）

表2 大紅袍中單體化合物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)定結(jié)果（±s，n=3）

不同濃度（μg∕mL）化合物的β-羥高鐵血紅素形成抑制率∕%化合物IC50∕(μg∕mL)1 2 3 277.8 14.2±2.1 0.1±0.1-5.2±1.9 55.6 12.6±1.5 1.5±0.8-8.6±0.3 11.1 4.1±1.5 0.5±1.0-5.5±1.5 2.2 6.8±2.0 0.6±0.9-6.2±1.0 0.4 5.1±1.4 0.6±0.5-2.7±0.5＞277.8無(wú)活性無(wú)活性

化合物2：白色無(wú)定型粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.36（1H，brs，H-6），5.09（1H，d，J=7.7Hz，H-1′），4.60（1H，dd，J=11.8，2.4 Hz，H-6′a），4.45（1H，dd，J=11.8，5.2 Hz，H-6′b），4.35（1H，overlap，H-4′），4.33（1H，overlap，H-5′），4.10（1H，m，H-3），4.02（1H，overlap，H-2′），3.96（1H，overlap，H-3′），0.99（3H，d，J=6.4Hz，Me-21），0.93（3H，s，Me-19），0.92～0.85（12H，overlap，4×Me），0.65（3H，s，Me-18）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：37.6（C-1），30.4（C-2），78.8（C-3），39.5（C-4），141.0（C-5），122.1（C-6），32.3（C-7），32.2（C-8），50.5（C-9），37.1（C-10），21.4（C-11），40.1（C-12），42.6（C-13），56.3（C-14），24.7（C-15），28.7（C-16），56.9（C-17），12.1（C-18），19.3（C-19），36.5（C-20），19.2（C-21），34.3（C-22），26.5（C-23），46.1（C-24），29.6（C-25），19.6（C-26），20.1（C-27），23.5（C-28），12.3（C-29），102.7（C-1′），75.5（C-2′），78.7（C-3′），71.8（C-4′），78.2（C-5′），62.9（C-6′）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔13〕報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物2為胡蘿卜苷。

化合物3：白色無(wú)定型粉末。ESI-MS m/z：712［M–H］–。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：5.73（1H，dt，J=15.3，6.1 Hz，H-5），5.48（1H，dd，J=15.3，7.4 Hz，H-8），5.37（2H，t，J=4.7，H-4，9），4.26（1H，d，J=7.7Hz，H-1′′），4.14（1H，overlap，H-3），4.12（1H，overlap，H-1a），4.00（1H，overlap，H-2′），3.99（1H，overlap，H-2），3.86（1H，d，J=11.8 Hz，H-6′′a），3.70（1H，dd，J=10.3，3.3 Hz，H-1b），3.66（1H，dd，J=11.8，3.7 Hz，H-6′′b），3.34（1H，s，H-3′′），3.28（1H，overlap，H-4′′），3.27（1H，overlap，H-5′′），3.19（1H，t，J=8.4 Hz，H-2′′），2.19～2.01（6H，overlap，H2-6，7，10），1.70（1H，m，H-3′a），1.55（1H，m，H-3′b），1.44～1.28（38H，overlap，H2-11～17，4′～15′），0.90（6H，t，J=6.6Hz，Me-18，16′）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：70.0（C-1），54.9（C-2），73.0（C-3），130.2（C-4），134.6（C-5），33.9（C-6），28.1（C-7），131.5（C-8），131.6（C-9），28.5（C-10），30.8（C-11），30.7～33.3（C-12～16），24.0（C-17），14.7（C-18），177.5（C-1′），73.2（C-2′），36.1（C-3′），26.5（C-4′），30.7～33.3（C-5′～14′），24.0（C-15′），14.7（C-16′），104.9（C-1′′），75.2（C-2′′），78.1（C-3′′），71.7（C-4′′），78.2（C-5′′），62.8（C-6′′）。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔14〕報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物3為大豆腦苷I。

4 討論

β-羥高鐵血紅素形成抑制實(shí)驗(yàn)作為一種體外抗瘧活性間接測(cè)定的研究方法，具有操作簡(jiǎn)單、快捷、樣品用量少等高通量篩選實(shí)驗(yàn)所具備的特性〔6-9，15-16〕。然而，本實(shí)驗(yàn)利用硅膠和大孔樹(shù)脂等柱層析技術(shù)方法對(duì)活性部位追蹤分離得到的3個(gè)主要成分，僅化合物1顯示出微弱的活性，分析其原因可能有兩個(gè)：一方面可能是大紅袍的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性源自未分離到的某些微量成分或是源自多成分協(xié)同作用的結(jié)果；另一方面，也有可能是色素干擾實(shí)驗(yàn)所致，由于大紅袍提取物、萃取部位具有較深的顏色，其對(duì)本研究于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值可能產(chǎn)生干擾，造成假陽(yáng)性結(jié)果。因此，該植物的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性成因與物質(zhì)基礎(chǔ)仍有待進(jìn)一步研究。

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