羅丹丹，方海蘭，李 楊，段寶忠

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

防風(fēng)為常用中藥，來源于傘形科防風(fēng)屬植物防風(fēng) Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的根，具有祛風(fēng)解表，勝濕止痛，止痙功效〔1〕。各地常將川防風(fēng)Ligusticum brachylobum Franch.、竹葉防風(fēng)Seseli mairei H.Wolff、松葉防風(fēng)S.yunnanense Franch.以及同科多種植物如杏葉防風(fēng)Pimpinella candolleana Wight&Arn.、石 防 風(fēng) Peucedanum terebinthaceum（Fisch.ex Trevir.）Ledeb.、葛縷子 Carum carvi L.等作為防風(fēng)混偽品使用〔2-5〕，由于這些藥材均來源于傘形科，其根部特征與防風(fēng)較為相似，采用傳統(tǒng)的性狀和顯微鑒別等方法難以鑒別〔6-8〕，對(duì)臨床用藥安全造成極大威脅。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)是分子鑒定的最新發(fā)展，即通過比較一段通用DNA片段，對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識(shí)別和鑒定〔9〕。陳士林等對(duì)大量樣本的研究表明，ITS2序列是鑒定藥用植物及其混偽品的理想條形碼〔10〕。該技術(shù)已廣泛用于重樓〔11〕、臭牡丹〔12〕、艾葉〔13〕、何首烏〔14〕等多種中藥材的混偽品鑒別研究，并取得了良好的效果。目前已有學(xué)者采用ITS2條形碼對(duì)防風(fēng)及其偽品中華前胡和杏葉防風(fēng)等開展了鑒別研究，結(jié)果表明DNA條形碼技術(shù)可有效鑒別防風(fēng)及其混偽品〔15〕，但未見該技術(shù)用于竹葉防風(fēng)、松葉防風(fēng)等常見偽品的分子鑒別研究。鑒于此，本研究在建立防風(fēng)及其常見混偽品的參照DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，對(duì)來源于市場(chǎng)的28批標(biāo)簽為防風(fēng)的藥材進(jìn)行了研究，以期為DNA條形碼技術(shù)在藥品檢驗(yàn)和市場(chǎng)監(jiān)管領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器PCR儀（2720，Applied Biosystems，USA）；1-14K型高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；植物組織研磨儀（Retsch MM400）；NanoDrop 2000∕2000C分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific公司）；各種量程的微量移液器（Eppendorf）。

1.2 材料本研究采集包括防風(fēng)Saposhnikovia divaricata、竹葉防風(fēng)Seseli mairei、杏葉防風(fēng)Pimpinella candolleana及華山前胡Peucedanum ledebourielloides等4個(gè)物種8份植物樣本，經(jīng)大理大學(xué)段寶忠副教授鑒定，并從GenBank下載防風(fēng)常見偽品的ITS2序列16條，含上述8個(gè)物種共24條ITS2序列用于構(gòu)建防風(fēng)及其混偽品的標(biāo)準(zhǔn)條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。見表1。28批標(biāo)簽為防風(fēng)的藥材（HSM-01～28）收集于市場(chǎng)或委托藥商購(gòu)于市場(chǎng)，其基原不詳。見表2。

表1 防風(fēng)及其習(xí)用品ITS2序列信息表

表2 市場(chǎng)收集藥材樣品表

2 方法

2.1 DNA提取植物樣本葉片采用硅膠進(jìn)行干燥，取30 mg，市場(chǎng)購(gòu)買藥材切碎，取40 mg。用植物組織研磨儀（Retsch MM400，Germany）研磨2 min。總DNA提取在植物組織提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）的操作規(guī)程基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。研磨后，使用核分離緩沖液（100 mmol∕L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol∕L EDTA，pH 8.0；0.3 mmol∕L NaCl；2%PVP40；2%β-巰基乙醇）抽提2次；水浴溫度為54℃，水浴時(shí)間6 h；水浴后，使用氯仿-異戊醇（24∶1）抽提2次。其他操作均按試劑盒規(guī)程。

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序ITS2序列的反應(yīng)條件，擴(kuò)增引物，以及擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)進(jìn)行〔16〕。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，有條帶的PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理所得的測(cè)序峰圖利用CodonCode Aligner Version 5.1.5（CodonCode Co.，USA）進(jìn)行組裝拼接?；陔[馬爾夫模型的HMMer注釋方法將所得序列及GenBank序列，除去5.8S和28S區(qū)，獲得ITS2序列。采用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）構(gòu) 建 NJ（Neighbor-Joining）樹，Kimura 2-Parameter（K2P）法計(jì)算遺傳距離。

3 結(jié)果

3.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增效率PCR擴(kuò)增效率及測(cè)序成功率是評(píng)價(jià)DNA條形碼序列的兩個(gè)重要指標(biāo)。本研究中，所提取的36份樣品DNA（包括8份植物樣本和28份藥材樣本），經(jīng)NanoDrop 2000測(cè)定，A260∕A280值為1.8 ～ 2.0之間，樣品DNA濃度為100～300 ng∕μL。表明改進(jìn)后的提取方法所提取的DNA質(zhì)量較好。PCR擴(kuò)增效率及測(cè)序成功率均為100%。

3.2 參考樣本ITS2序列遺傳距離用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的24條ITS2序列（8條植物樣本序列，16條GenBank下載序列）長(zhǎng)度范圍為221～229 bp，GC含量為51.80%～59.26%。防風(fēng)種內(nèi)5個(gè)樣本間的K2P遺傳距離為0.000，防風(fēng)與其他物種間的K2P距離范圍為0.037～0.307。防風(fēng)種內(nèi)遺傳距離小于種間遺傳距離，表明ITS2序列可用于防風(fēng)及其混偽品的鑒別。

3.3 市場(chǎng)藥材鑒定分析將28批標(biāo)簽為防風(fēng)的藥材（編號(hào)HSM-01～28），分別在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）、中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（TCM-DBS，http：∕∕.tcmbarcode.cn∕china∕）進(jìn)行相似性搜索，DNA條形碼比對(duì)結(jié)果見表3。從表3可看出，28批藥材樣品分屬于5個(gè)物種，其中有10份藥材為防風(fēng)，占35.71%；8份與竹葉防風(fēng)具有高度相似性，占28.57%；6份與華山前胡相似，占21.43%；3份與杏葉防風(fēng)相似，占10.71%；1份為傘形科其他物種。

表3 市售標(biāo)簽為防風(fēng)的藥材BLAST及TCM-DBS鑒定結(jié)果

3.4 市場(chǎng)藥材NJ樹分析將市場(chǎng)28個(gè)藥材樣品的ITS2序列與24條參考DNA條形碼，構(gòu)建NJ樹。見圖1。從圖1可看出，樣品HSM-02～04、06～12與正品防風(fēng)S.divaricata聚為一支；樣品HSM-01、05、20～24、26與竹葉防風(fēng) S.mairei聚為一支；樣品HSM-13～18與華山前胡 P.ledebourielloides聚為一支；樣品HSM-19和HSM-27～28與杏葉防風(fēng)P.candolleana聚為一支。僅HSM-25未與參考序列庫(kù)內(nèi)的物種聚為一支，BLAST結(jié)果為白花前胡P.praeruptorum或紅前胡P.rubricaule。

4 討論與結(jié)論

藥材基原物種的準(zhǔn)確鑒定是避免混偽品混淆使用的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的性狀和顯微鑒定方法主要依靠形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，這類方法主觀性強(qiáng)，同時(shí)對(duì)鑒定者的專業(yè)水平要求高。隨著當(dāng)前傳統(tǒng)鑒定專業(yè)人才的匱乏，藥材外觀相似或同物異名對(duì)市場(chǎng)藥材監(jiān)管部門提出了挑戰(zhàn)。DNA條形碼是一種分子鑒定技術(shù)，其不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)和材料部位的限制，已成為中藥原植物和藥材鑒定的有效手段〔9〕，其操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)鑒定結(jié)果的客觀和自動(dòng)化，有效緩解了中藥材鑒定人才缺乏的現(xiàn)狀。

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的防風(fēng)市場(chǎng)藥材NJ樹

本研究采用ITS2條形碼鑒定防風(fēng)常見混偽品〔17-18〕，建立了防風(fēng)及其混偽品的參考DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，并利用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)市場(chǎng)收集的28批標(biāo)簽為“防風(fēng)”的藥材進(jìn)行了鑒定和驗(yàn)證。結(jié)果表明ITS2序列可有效鑒別已知混偽品。DNA鑒定結(jié)果表明，市售防風(fēng)藥材來源復(fù)雜，在調(diào)查的28批防風(fēng)藥材中，僅有10批為正品防風(fēng)S.divaricata，其余藥材植物基原可能有竹葉防風(fēng)S.mairei，華山前胡P.ledebourielloides，白花前胡P.praeruptorum、杏葉防風(fēng)P.candolleana等多種，這些藥材性味功效與防風(fēng)差異較大〔19〕，對(duì)防風(fēng)臨床用藥的安全和有效造成了極大威脅。上述DNA條形碼的鑒定結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致〔3〕，表明DNA條形碼可作為中草藥來源鑒定和市場(chǎng)混偽品檢測(cè)的有效工具。

［參考文獻(xiàn)］

〔1〕國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部〔M〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：149-150.

〔2〕竇忠健，楊勤福，李偉.中藥防風(fēng)及其混偽品的鑒別〔J〕.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，1999，14（4）：15-16.

〔3〕謝宗萬(wàn).中藥材品種論述：中冊(cè)〔M〕.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1984：68-81.

〔4〕李鵬.防風(fēng)正品與偽品的鑒定〔J〕.甘肅醫(yī)藥，2013，32（6）：467-468.

〔5〕李海濤，徐安順，張麗霞，等.防風(fēng)及其地方習(xí)用品種的性狀與顯微鑒別〔J〕.中藥材，2013，36（12）：1940-1942.

〔6〕王會(huì)如，張娜.防風(fēng)與亳州移栽防風(fēng)和一種偽品防風(fēng)的比較〔J〕.首都醫(yī)藥，2002，9（4）：56-57.

〔7〕郭朝民.防風(fēng)與竹葉防風(fēng)的鑒別〔J〕.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2002，17（5）：9-10.

〔8〕宋美錄，呂麗，李繼紅，等.藥用防風(fēng)及其近緣種的顯微性狀調(diào)查〔J〕.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，31（6）：96-99.

〔9〕陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：10.

〔10〕CHEN S L，YAO H，HAN J P，et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species〔J〕.PLoS ONE，2010，5（1）：e8613.

〔11〕方海蘭，夏從龍，段寶忠，等.基于DNA條形碼的中藥材種子種苗鑒定研究—以重樓為例〔J〕.中藥材，2016，39（5）：986-990.

〔12〕DUAN B Z，F(xiàn)ANG H L，LI X W，et al.Survey of tradition?al Dai medicine reveals species confusion and potential safety concerns：a case study on Radix Clerodendri Japoni?cum〔J〕.Chin J Nat Med，2017，15（6）：417-426.

〔13〕梅全喜，陳小露，向麗，等.艾葉的DNA條形碼鑒定研究〔J〕.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2017，13（7）：3-9.

〔14〕尚飛能，方海蘭，段寶忠.基于ITS2條形碼和化學(xué)指紋鑒別何首烏及其偽品〔J〕.大理大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，2（4）：12-15.

〔15〕林好，錢潔穎，李斯璐，等.基于DNA條形碼（ITS2）的中藥材防風(fēng)與其混偽品的鑒定〔J〕.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2016，23（15）：4-7.

〔16〕HEBERT P D N，CYWINSKA A，BALL S L，et al.Biologi?cal identifications through DNA barcodes〔J〕.Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.

〔17〕王建華，樓之岑.防風(fēng)類藥材的形態(tài)組織學(xué)研究（Ⅱ）〔J〕.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，23（1）：54-58.

〔18〕王建華，樓之岑.防風(fēng)類藥材的形態(tài)組織學(xué)研究（Ⅰ）〔J〕.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，22（4）：277-280.

〔19〕王建華，崔景榮，朱燕，等.防風(fēng)及其地區(qū)習(xí)用品解熱鎮(zhèn)痛作用的比較研究〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1989，4（1）：20-22.