劉千玉，張國(guó)志，田煒，詹琪琪，陳建立，陳俊卯，曹文斌

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山 063000；2華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心)

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(FoxM1)在很多惡性腫瘤中表達(dá)升高，如宮頸癌[1]、胰腺癌[2]、結(jié)腸癌[3]及胃癌[4]等，提示FoxM1在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中扮演重要角色，但目前FoxM1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)及其相關(guān)研究較少。2017年6～10月，我們通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染FoxM1的siRNA,觀察其對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株K1增殖、遷徙及侵襲的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料人甲狀腺癌細(xì)胞株K1購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，由華北理工大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室保存。FoxM1-siRNA靶向序列正向引物為5′-GCUGGGAUCAAGAUUAUUATT-3′，反向引物為3′-UAAUAAUCUUGAUCCCAGCTT-5′，由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成，LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司，RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、新鮮胚胎牛血清、PBS緩沖液及胰蛋白酶均購(gòu)自以色列BI公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Matrigel膠購(gòu)自BD公司，噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Amereco公司。

1.2人甲狀腺癌細(xì)胞株K1的培養(yǎng)及傳代人甲狀腺癌細(xì)胞株K1采用含青霉素、鏈霉素、10%牛胚胎血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，將其置于37 ℃恒溫且5%CO2培養(yǎng)箱中。用光學(xué)顯微鏡觀察K1細(xì)胞株的生長(zhǎng)狀況，并根據(jù)其生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)確定更換培養(yǎng)基的時(shí)間，24～48 h更換一次培養(yǎng)基。待K1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶壁70%面積時(shí)傳代，用PBS溶液輕輕沖掉脫落的細(xì)胞及細(xì)胞碎片，重復(fù)2～3次，然后加入0.25%胰酶1 mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)改變，大致變?yōu)閳A珠狀，并不再附著瓶壁時(shí)，加入完全培養(yǎng)基停止消化，吹打均勻后將瓶中帶有細(xì)胞的培養(yǎng)基分裝一半到另一培養(yǎng)瓶中，然后將其放回至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h內(nèi)換液。

1.3 FoxM1.siRNA至人甲狀腺癌細(xì)胞株K1的轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照上述消化細(xì)胞的步驟，用1×106/mL的細(xì)胞密度，將消化下來(lái)的細(xì)胞種植于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前為避免青鏈霉素對(duì)轉(zhuǎn)染造成影響，24 h前改換不含青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前用PBS溶液將6孔板中的細(xì)胞沖洗2次，之后每個(gè)孔加入1 mL空白R(shí)PMI1640培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱使其饑餓1 h，同時(shí)將5 μL的siRNA和5 μL的LipofectamineTM2000分別加入500 μL的空白R(shí)PMI1640培養(yǎng)基中孵育5 min，再將兩者混合后靜置20 min，之后將其加入先前制備饑餓細(xì)胞的6孔板兩個(gè)孔中，作為轉(zhuǎn)染組；重復(fù)上述操作將之前的siRNA替換為control siRNA，加入2個(gè)孔作為無(wú)意義序列組；剩余2個(gè)孔加入PBS作為空白對(duì)照組。輕輕晃動(dòng)6孔板，將液體鋪勻孔底，轉(zhuǎn)染6 h后，將孔內(nèi)液體移除，并加入含有血清的RPMI1640培養(yǎng)基，48 h后在200倍熒光顯微鏡下觀察孔內(nèi)帶有熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)，并記錄其占比，如果帶有熒光的細(xì)胞占比達(dá)80%以上，即為轉(zhuǎn)染成功。

1.4FoxM1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫印跡試驗(yàn)。①細(xì)胞總蛋白提?。河蒙鲜霾襟E消化狀態(tài)良好且密度達(dá)到1×106/mL的細(xì)胞,調(diào)制成單細(xì)胞懸液。用離心機(jī)離心5 min，離心速度1 000 r/min。將少許冰敷過(guò)的PBS溶液加入離心瓶中，并將細(xì)胞吹勻，再次離心，上述操作重復(fù)2次。將離心后的上清液去除，200 μL的RIPA裂解工作液加入到離心過(guò)的細(xì)胞中，之后將其轉(zhuǎn)入EP管進(jìn)行超聲波震碎，持續(xù)10 s，重復(fù)振蕩10次，吹打均勻，冰上冰敷30 min,再用離心機(jī)在4 ℃環(huán)境下以12 000 r/min離心15 min。取離心后的上清液放入-20 ℃冰柜中保存。②蛋白定量：采用BCA法。具體實(shí)驗(yàn)步驟按BCA蛋白定量試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。蛋白定量之后，加入相同體積的2×蛋白上樣緩沖液，之后100 ℃變性5 min，然后放入-80 ℃冰柜中封存?zhèn)溆?。③電泳及轉(zhuǎn)膜：按照定量結(jié)果，計(jì)算30 μg蛋白上樣的體積，得出結(jié)果后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。根據(jù)所測(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量不同，配置合適濃度的SDS-PAGE膠，按照10%分離膠和5%濃縮膠配置SDS-PAGE膠。將之前準(zhǔn)備好的蛋白樣品和標(biāo)記物按順序加入上樣孔中。在濃縮膠與分離膠中分別用80 V與120 V恒壓電泳，待不同相對(duì)分子質(zhì)量蛋白均勻分布于分離膠上后停止電泳。然后將目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量所在區(qū)域的膠體切下，將PVDF膜置入甲醇中浸泡約5 s，之后用轉(zhuǎn)膜液將其洗凈。將已用轉(zhuǎn)膜液泡透的濾紙按由下至上的順序(濾紙-PVDF膜-所切凝膠-濾紙)放進(jìn)濕轉(zhuǎn)膜儀器內(nèi)，90 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h。完成后用TBST沖刷掉膜表面的轉(zhuǎn)膜液，之后放入已配置好的含10%脫脂奶粉的封閉液中2 h。④免疫印跡雜交顯色。待封閉2 h后，用TBST沖刷膜表面，放入配置好的存有一抗的抗體孵育盒中，用脫色搖床在4 ℃環(huán)境下?lián)u動(dòng)12 h。用TBST將膜沖洗2～3次，每次10 min。放入之前調(diào)配好的存有HRP-IgG二抗的抗體孵育盒中，用脫色搖床在37 ℃環(huán)境下孵育2 h。按照BeyoECL Star(特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)使用說(shuō)明，上機(jī)熒光顯色。Image J軟件分析所測(cè)免疫熒光條帶灰度值。相關(guān)蛋白表達(dá)量計(jì)算=(所測(cè)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值)×100%。

1.5細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算采用MTT法。按上述將FoxM1的siRNA轉(zhuǎn)染至人甲狀腺癌細(xì)胞株K1的步驟，將細(xì)胞分為3組，并將細(xì)胞消化下去，并調(diào)制成單細(xì)胞懸液，以1×104/mL的細(xì)胞密度將細(xì)胞均勻種于96孔板中，四周的孔內(nèi)加入等體積PBS。將分組后的每組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)副孔，之后將其分為24、48、72 h組，并在每組時(shí)間點(diǎn)的前4 h加入20 μL的MTT藥劑進(jìn)行培育，使之形成甲贊藍(lán)，之后在每組各自的時(shí)間點(diǎn)，將孔內(nèi)液體移除，每個(gè)小孔中加入150 μL的DMSO，并振動(dòng)10 min，酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)選擇490 nm，以空白孔作為調(diào)0孔，用酶標(biāo)儀測(cè)各組每個(gè)孔的OD值；對(duì)測(cè)得的吸光度值刪除最大值及最小值，其余數(shù)據(jù)取平均值；重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。按照公式計(jì)算FoxM1-siRNA對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=(空白對(duì)照組OD490-轉(zhuǎn)染組OD490)/空白對(duì)照組OD490×100%。

1.6細(xì)胞遷徙能力檢測(cè)采用單層細(xì)胞劃痕損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。按上述步驟將細(xì)胞分組后，培養(yǎng)于6孔板中，每組取2個(gè)復(fù)孔，放入培育箱培育。等到細(xì)胞基本鋪滿孔底，形成細(xì)胞單層后，用200 μL的槍頭在每個(gè)孔內(nèi)做一條劃痕，寬度控制在0.6 mm左右，然后使用PBS溶液對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行沖刷2～3次，沖刷掉脫落的細(xì)胞及細(xì)胞殘片，棄培養(yǎng)基，加入空白的RPMI1640培養(yǎng)基，并進(jìn)行記錄，記為0 h，之后每24 h拍照記錄1次，直到72 h。觀察0、24、48、72 h照片中劃痕的面積變化。

1.7腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前將準(zhǔn)備好的Matrigel膠放入4 ℃冰箱中12 h，之后將Matrigel膠和空白R(shí)PMI1640按1∶9比例配液，取20 μL配好的Matrigel膠均勻鋪在Transwell小室上，滴加Matrigel膠時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡，之后將Transwell盒放入培育箱12 h使Matrigel膠凝固，按上述實(shí)驗(yàn)將分好組的細(xì)胞培育48 h后消化下來(lái)，以2×105/mL密度100 μL無(wú)血清無(wú)青鏈霉素培養(yǎng)基種到小室的上室，將僅含有10%濃度血清的1640培養(yǎng)基600 μL加入到下室；隨后移入培育箱中培育18 h；之后用PBS溶液沖刷小室3次，清除上室表層的細(xì)胞，用4%甲醛浸泡30 min；取出小室，再次用PBS溶液沖洗，并自然風(fēng)干；之后在小孔中添加結(jié)晶紫染色15～20 min，用蒸餾水沖洗干凈；將聚碳酸酯膜從小室上切下來(lái)并放到載玻片上，當(dāng)其風(fēng)干后，用中性樹(shù)膠滴在切片中央并用蓋玻片蓋上干燥；用200倍光學(xué)顯微鏡觀察穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞，隨機(jī)觀察15個(gè)視野，并記錄穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算其平均值，然后進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　 結(jié)果

2.1各組FoxM1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組、轉(zhuǎn)染組FoxM1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.96±0.01、0.95±0.01、0.27±0.03，轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組比較，P均<0.05；空白對(duì)照組與無(wú)意義序列組比較，P>0.05。

2.2各組細(xì)胞增殖率比較見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制，與無(wú)意義序列組、空白對(duì)照組比較，P均<0.05；無(wú)意義序列組與空白對(duì)照組比較，P>0.05。

表1　三組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖率比較

注：與轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05。

2.3各組細(xì)胞遷徙能力比較24 h后，空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組、轉(zhuǎn)染組劃痕面積相對(duì)比值分別為0.83±0.01、0.82±0.01、0.93±0.01，轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組比較，P均<0.05；空白對(duì)照組與無(wú)意義序列組比較，P>0.05。

2.4各組腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力比較空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組、轉(zhuǎn)染組穿過(guò)上小室背面的細(xì)胞數(shù)分別為(92.40±3.05)、(85.40±5.13)、(37.20±3.96)個(gè)/視野，轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組比較，P均<0.05;空白對(duì)照組與無(wú)意義序列組比較，P>0.05。

3　討論

甲狀腺癌在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率雖然不高，僅占所有惡性腫瘤的1%，但其在內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤中常見(jiàn)，目前甲狀腺癌在我國(guó)的發(fā)病率排在所有腫瘤疾病的第10位，其中甲狀腺乳頭狀癌最常見(jiàn)，占所有類(lèi)型甲狀腺癌的70%左右，且發(fā)病率日益增加[5]。甲狀腺乳頭狀癌惡性程度并不高且生長(zhǎng)相對(duì)較慢，易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。手術(shù)是治療甲狀腺癌的首要方式，但因其解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血供豐富，再加上其內(nèi)分泌的作用，致使術(shù)后并發(fā)癥多[6]。術(shù)后10年生存率較高[7]，但其復(fù)發(fā)率亦很高，后果是伴隨病死率的升高。因此尋求新的靶向治療藥物已成為研究和治療甲狀腺癌亟待解決的問(wèn)題。

正常人體細(xì)胞有增殖、凋亡生理過(guò)程，而腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡均出現(xiàn)異常狀態(tài)。研究[8]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1基因異常表達(dá)可能致腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡改變。FoxM1可調(diào)控部分相關(guān)代謝過(guò)程，使腫瘤細(xì)胞增殖、能量代謝保持平衡，不僅如此，F(xiàn)oxM1還參與腫瘤細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移等相關(guān)進(jìn)程的調(diào)控，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、血管形成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等關(guān)系密切[9，10]，F(xiàn)oxM1表達(dá)異常與腫瘤患者的臨床分型差、預(yù)后差有明顯相關(guān)性。國(guó)內(nèi)關(guān)于FoxM1在甲狀腺癌中表達(dá)意義的研究相對(duì)較少，且多通過(guò)組織水平實(shí)驗(yàn)[11]證明FoxM1過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺癌增殖等生物學(xué)行為有促進(jìn)作用。

FoxM1屬于Forkhead的轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞G1期的過(guò)渡，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，所以FoxM1只在具有絲分裂功能的細(xì)胞中表達(dá)，且FoxM1在細(xì)胞增殖周期中起重要作用[12,13]。FoxM1位于染色體12p13.3的末端著絲粒區(qū)域，其長(zhǎng)度約為25 kb，F(xiàn)oxM1主要功能是增強(qiáng)細(xì)胞和組織的增殖，在胎兒組織中表達(dá)更廣泛。如果FoxM1的一些功能缺失，導(dǎo)致其過(guò)度表達(dá)，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖等一系列生物學(xué)行為紊亂，阻礙細(xì)胞分化，導(dǎo)致細(xì)胞惡變。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組、轉(zhuǎn)染組FoxM1蛋白相對(duì)表達(dá)量、細(xì)胞增殖率、穿過(guò)上小室背面的細(xì)胞數(shù)低于空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組，劃痕面積相對(duì)比值高于空白對(duì)照組、無(wú)意義序列組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)沉默F(xiàn)oxM1可抑制人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株增殖，降低細(xì)胞侵襲及遷徙能力，F(xiàn)oxM1有望成為甲狀腺乳頭狀癌新的靶向治療基因。

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