張　立,王　煒,李孝斌,李　杰,王家中,孫學(xué)軍*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科,西安　710004;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科;*通訊作者,E-mail:sunxy@mail.xjtu.edu.cn)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其惡性程度及死亡率極高[1-3]。目前,HCC在臨床診斷和綜合治療方面都有很大程度的提升,但患者預(yù)后仍舊不容樂觀[4]。目前認(rèn)為,抑癌基因的功能缺失和致癌基因的激活與HCC的發(fā)生密切相關(guān),但其分子機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化、qPCR、小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾、MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ARID2在配對(duì)肝癌組織、不同肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞功能的影響。

1　材料與方法

1.1　臨床病理標(biāo)本

收集2015-01～2015-12西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院60例連續(xù)HCC患者的配對(duì)癌組織和癌旁組織(距癌組織2 cm),患者接受手術(shù)切除前,未接受任何抗腫瘤治療。所有標(biāo)本均在組織離體后30 min內(nèi)放置液氮內(nèi)保存。術(shù)前與所有患者或家屬簽署標(biāo)本收集知情同意書,經(jīng)西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并嚴(yán)格遵照《赫爾辛斯基宣言》醫(yī)學(xué)倫理道德準(zhǔn)則實(shí)施。

1.2　細(xì)胞株及試劑

三種HCC細(xì)胞株MHCC-97H,HepG2、SMMC-7721及人正常肝細(xì)胞株LO2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),Trizol試劑盒購(gòu)自Life Technologies,TaqMan RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems,Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen。

1.3　免疫組化檢測(cè)在HCC組織及癌旁組織中ARID2的表達(dá)

采用ABC法切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后,枸櫞酸鈉緩沖液加熱抗原修復(fù)高火10 min,中低火13 min;3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶;參考抗體說明書滴加稀釋后ARID2(1 ∶100,Abcom)抗體,4 ℃冰箱過夜;濕盒室溫復(fù)溫1 h后滴加生物素標(biāo)記二抗(購(gòu)自北京中杉金橋公司)，37 ℃孵育2 h，親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物染色(SABC)法行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木紫襯染,重新脫水透明,封片,顯微鏡下觀察。所有染色采用已知陽(yáng)性癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):ARID2主要表達(dá)在細(xì)胞核中,根據(jù)腫瘤細(xì)胞質(zhì)的染色程度和染色細(xì)胞百分率分析評(píng)分。以出現(xiàn)淡黃-棕褐色顆粒作為陽(yáng)性結(jié)果,由2名副高級(jí)職稱病理醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立雙盲評(píng)分。每張病理切片隨機(jī)選取10個(gè)10×40倍光學(xué)顯微鏡視野,將ARID2的染色范圍及染色強(qiáng)度依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)半定量化,結(jié)果取平均值。染色范圍:染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比率按≤5%為0分,6%-25%為1分,26%-50%為2分,51%-75%為3分,≥76%為4分;染色強(qiáng)度:未染色為0分,淡黃色為1分,棕色為2分,棕褐色為3分。將染色范圍與染色強(qiáng)度計(jì)分相乘得出結(jié)果:0-4分為低表達(dá),5-12分為高表達(dá)。

1.4　實(shí)時(shí)定量PCR分析HCC細(xì)胞中ARID2的表達(dá)

利用Trizol從HCC及LO2細(xì)胞提取總RNA。使用TaqMan RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)ARID2進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增,U6作為內(nèi)對(duì)照。采用CFX Manage軟件(美國(guó)Bio-Rad)分析進(jìn)行結(jié)果分析,采用2-ΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量并繪制圖表。

1.5　qPCR篩選siRNA

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件及細(xì)胞功能狀態(tài),選擇HepG2細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)siRNA干擾及功能學(xué)實(shí)驗(yàn),根據(jù)PubMed公布的ARID2基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA(見表1)。參照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染,篩選有效抑制ARID2的siRNA。

表1siRNA-ARID2引物序列

Table1siRNA-ARID2sequencesoftheprimers

siRNA引物序列 si-ARID2-101si-ARID2-102si-ARID2-103Sense5'-ATGGACCTCTAGCTTCAAGTTTTT-3'Antisense5'-AACTTGAAGCTAGAGGTCCATTTT-3'Sense5'-AGCTCCAATTCCTTGTGAAGTTTT-3'Antisense5'-ACTTCACAAGGAATTGGAGCTTTT-3'Sense5'-AGGTACATCAGGAGAATGGATTTT-3'Antisense5'-ATCCATTCTCCTGATGTACCTTTT-3'

1.6　MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞常規(guī)消化細(xì)胞離心收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)量并接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后先后加MTT、DMSO后測(cè)定OD值并繪制圖表,所有實(shí)驗(yàn)具體步驟參照第四軍醫(yī)大學(xué)出版的細(xì)胞與分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)。

1.7　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

將細(xì)胞接種于6孔板按照2×105/孔轉(zhuǎn)染48 h,將細(xì)胞固定于4 ℃ 70%乙醇24 h,50 μg/ml碘化丙啶染色(凱基生物,中國(guó))。采用流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選(FACS,美國(guó))和CellQuest軟件(Becton Dickinson,美國(guó))進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Pearson χ2檢驗(yàn)計(jì)算ARID2表達(dá)在組織中與病理特征的關(guān)系,t檢驗(yàn)分析ARID2的表達(dá)差異,可信區(qū)間為95%,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2　結(jié)果

2.1　ARID2在HCC組織中的表達(dá)水平

ARID2陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核中,呈棕色、棕黃色顆粒樣(見圖1),在HCC組織中,78.3%(47/60)高表達(dá),21.7%(13/60)低表達(dá),在癌旁組織中,25.0%(15/60)高表達(dá),75.0%(45/60)低表達(dá),兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2　ARID2在HCC細(xì)胞中的表達(dá)

利用qPCR方法檢測(cè)在三種HHCC-97H、HepG2、SMMC-7721細(xì)胞株中ARID2水平的表達(dá)均高于正常LO2肝細(xì)胞的表達(dá)(P<0.05,見圖2)。

A.ARID2在癌組織中高表達(dá)　　　　　B.ARID2在癌旁組織低表達(dá),陽(yáng)性染色位于細(xì)胞核圖1　ARID2在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)水平Figure 1　Expression of ARID2 in HCC tissue and adjacent tissue

與LO2細(xì)胞比較，*P<0.05圖2　ARID2在4種細(xì)胞株中的表達(dá)Figure 2　Expression of ARID2 in different HCC cell lines

2.3　qPCR篩選siRNA

si-RNA-101-3分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后48 h收集總RNA,行qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ARID2的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。si-RNA-101組的灰度比值為0.763 4±0.148 1,對(duì)ARID2的表達(dá)有明顯抑制作用(P<0.01,見圖3)。

與其他四組比較，*P<0.01圖3　siRNA干擾后HepG2中ARID2的表達(dá)Figure 3　Expression of ARID2 in HepG2 after siRNA interference

2.4　siRNA干擾后細(xì)胞增殖情況

MTT結(jié)果顯示,與對(duì)照組NC相比較,ARID2基因被沉默后HepG2細(xì)胞系增殖能力降低,轉(zhuǎn)染24 h、48 h無(wú)顯著差異,在72h時(shí)腫瘤細(xì)胞增殖能力顯著下降(0.686 9±0.124 5)與NC組比較具有明顯差異(P<0.05,見圖4)。結(jié)果顯示沉默ARID2基因后可抑制HepG2細(xì)胞系增殖。

與NC組比較，*P<0.05圖4　MTT檢測(cè)HepG2細(xì)胞株ARID2基因沉默后細(xì)胞增殖情況Figure 4　Cell proliferationof HepG2 cell line after ARID2 gene silencing by MTT

2.5　siRNA干擾后細(xì)胞周期情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見圖5。與陰性對(duì)照組比較,沉默了ARID2基因后HepG2細(xì)胞株G1期明顯增多[(82.33±3.11)%vs(68.22±2.71)%,P<0.01],S期細(xì)胞明顯減少[(26.42±2.10)%vs(12.33±2.21)%,P<0.01],說明大量細(xì)胞阻滯在G1期。結(jié)果表明下調(diào)ARID2的表達(dá)具有抑制肝癌細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)化的作用。

3　討論

ARID2屬于ARID家族,是從一種參與依賴配體的核受體轉(zhuǎn)錄激活的SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物PBAF中被分離鑒定出來(lái)的[5]。SWI/SNF復(fù)合物是一種進(jìn)化保守的多亞單位的染色質(zhì)重塑復(fù)合物,對(duì)染色質(zhì)重塑起著決定性作用,能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量動(dòng)員核小體,使染色質(zhì)重構(gòu),從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,控制多種生物學(xué)過程包括細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)抑制[6]。越來(lái)越多的研究證實(shí)了這種復(fù)合物在腫瘤發(fā)生中的作用,它的幾個(gè)亞單位具有內(nèi)在的腫瘤抑制因子活性,或者是腫瘤抑制基因激活所必需的。目前部分研究認(rèn)為ARID2基因是抑癌基因,在多種癌組織內(nèi)呈低表達(dá)[7-10],但肝癌組織內(nèi)仍存在不同[11],本實(shí)驗(yàn)中ARID2在HCC組織及細(xì)胞中高表達(dá),并且通過siRNA干擾HepG2細(xì)胞中的ARID2表達(dá),MTT結(jié)果顯示HepG2增殖能力顯著下降,流式細(xì)胞儀顯示HepG2細(xì)胞停滯于G1期,可能與以下機(jī)制相關(guān)。

圖5　流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ARID2基因沉默后HepG2細(xì)胞周期Figure 5　Cell cycle of HepG2 after ARID2 gene silencing by flow cytometry

ARID2為PBAF復(fù)合物組件之一,一種SWI/SNF染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物,作用于核受體引起的配體依賴型轉(zhuǎn)錄激活。功能分析顯示通過siRNA抑制ARID2轉(zhuǎn)錄,無(wú)論在肝癌細(xì)胞還是正常肝細(xì)胞中,導(dǎo)致干擾素α誘導(dǎo)性跨膜蛋白1(IFITM1)基因轉(zhuǎn)錄降低,而IFITM1對(duì)于干擾素誘導(dǎo)的抗增殖活性的發(fā)揮是必需的[12]。ARID2的突變導(dǎo)致在IFN信號(hào)傳導(dǎo)中相關(guān)基因表達(dá)的缺失,進(jìn)而使得肝炎病毒感染的宿主細(xì)胞逃過干擾素介導(dǎo)的抗增殖活性,那么ARID2突變的被感染宿主細(xì)胞就有可能喪失高表達(dá)MHC Ⅰ型抗原分子的能力,而無(wú)法應(yīng)答干擾素信號(hào),以至于效應(yīng)型T淋巴細(xì)胞無(wú)法識(shí)別。

Zhao等[12]的研究顯示,ARID2不是直接影響腫瘤細(xì)胞增殖的基因,其抑癌基因功能主要體現(xiàn)在提高了干擾素介導(dǎo)的抗腫瘤細(xì)胞增殖。一般和HCC相關(guān)的ARID2的研究是看突變率,將其作為腫瘤檢測(cè)的標(biāo)志基因,認(rèn)為肝癌細(xì)胞中ARID2突變率高(無(wú)意突變,缺失突變)導(dǎo)致失活。所以檢測(cè)ARID2在肝癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量,結(jié)果是高低不一(有高的,也有低的)[11]。據(jù)此,敲除ARID2來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖,因?yàn)闆]有外界壓力(干擾因素),所以ARID2的功能并不能在增殖結(jié)果中體現(xiàn),也就是抑制ARID2,HCC被抑制。細(xì)胞周期同樣如此。

本實(shí)驗(yàn)證明了HCC中ARID2的表達(dá)增加,降低ARID2的表達(dá)與HCC的增殖降低及細(xì)胞周期的停滯具有相關(guān)性,ARID2可作為重要的生物標(biāo)志物,靶向干預(yù)ARID2,可影響HCC的增殖與細(xì)胞周期。

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