孫　麗,張有為,曹蘇生,張培影,孫三元

(徐州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,徐州　221009;*通訊作者,E-mail:ss05181@189.cn)

乳腺癌(breast cancer,BC)和卵巢癌(ovarian cancer,OC)是表現(xiàn)為家族聚集傾向的常見女性惡性腫瘤,罹患相應(yīng)腫瘤家族史是二者最重要的危險(xiǎn)因素,表明遺傳因素在BC和OC發(fā)病中的重要意義[1,2]。遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征(hereditary breast and ovarian cancer syndrome,HBOC),指1個(gè)家族中有2個(gè)一級(jí)親屬或1個(gè)一級(jí)親屬和1個(gè)二級(jí)親屬患乳腺癌或卵巢癌,并具有遺傳傾向[3]。HBOC對(duì)于研究BC和OC的分子遺傳機(jī)制具有重要價(jià)值。我科于2013年7月收治BC和OC雙源腫瘤患者1例,經(jīng)詳細(xì)詢問(wèn)家族史,繪制出家系圖譜(見圖1),該家系4代中共有7例癌癥患者,其中4例為BC和OC雙源腫瘤,1例為雙側(cè)卵巢癌,且發(fā)病年齡均小于60歲,符合HBOC診斷。為鑒定該家族HBOC易感基因,我們對(duì)核心成員的靜脈血樣進(jìn)行全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing,WES),初步結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

項(xiàng)目組于徐州、南京、天津三地收集齊全46名家族成員的靜脈血樣,同時(shí)調(diào)查其臨床信息,采血和調(diào)查之前均獲得家族成員的知情同意。如圖1所示,101、205、207、217為HBOC患者,219僅為雙側(cè)卵巢癌患者,305和313為縱隔腫瘤患者。首先選擇101、203和207三個(gè)樣本進(jìn)行WES。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

205為先證者,219僅為雙側(cè)卵巢發(fā)病,101和102為姐弟關(guān)系,101有兩次婚姻史圖1　HBOC家系圖Figure 1　Family tree of hereditary breast and ovarian cancer syndrome

1.2　主要試劑及儀器

血液DNA提取(QIAamp DNA Blood Maxi Kit,德國(guó)Qiagen公司),捕獲磁珠(AmpureBeads,美國(guó)Beckman公司),DNA定量(Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Assay Kit,美國(guó)life公司),DNA建庫(kù)(TruSeq?DNA LT Sample Prep Kit v2,美國(guó)illumina公司),Exon捕獲(Nimblegen Exome Kit V4,Roche公司),測(cè)序試劑1(TruSeq PE Cluster Kit-cBot-HS3000,美國(guó)Illumina公司),Hisq3000高通量測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司),循環(huán)測(cè)序試劑盒(BigDye,美國(guó)ABI公司),ABI-3730XL測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3　方法

1.3.1DNA提取及純化根據(jù)Qiagen公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行血液樣本DNA的抽提及純化,DNA經(jīng)Qubit熒光定量?jī)x(美國(guó)Thermo公司)和1%瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢合格后備用。

1.3.2外顯子組測(cè)序gDNA用Biorupter超聲破碎儀打斷,DNA片段的大小為200-300 bp,修復(fù)末端A加至3′的末端、接頭相連接,以AmpureBeads磁珠純化連上接頭的模板片段,經(jīng)接頭介導(dǎo)的PCR(ligation-mediated PCR,LM-PCR)擴(kuò)增、純化后與NimbleGen 2.1M(外顯子靶向序列捕獲芯片)進(jìn)行雜交,洗脫未雜交的片段。捕獲與未捕獲的LM-PCR產(chǎn)物均進(jìn)行定量PCR,用來(lái)評(píng)估富集的程度。每個(gè)完成捕獲的外顯子組文庫(kù)均被加載到Illumina Hiseq3000測(cè)序平臺(tái),進(jìn)行雙末端測(cè)序,測(cè)序長(zhǎng)度達(dá)到75 bp,測(cè)序深度達(dá)到50X。WESBWA序列比對(duì),采用GATK和VarScan軟件對(duì)突變及變異進(jìn)行識(shí)別,包括對(duì)單核苷酸變異(single nucleotide variants,SNVs)、小片段的插入和缺失(insertion and deletion,InDel)等進(jìn)行檢測(cè)、注釋,過(guò)濾掉dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)和千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的SNP。

1.3.3基因重測(cè)序提取201,205,209,217,219,305和313樣本的DNA,通過(guò)primer 5.0設(shè)計(jì)目的基因引物(見表1),由華大基因合成引物,采用KAPA2G Fast Multiplex Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物電泳,按AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。將待測(cè)模板加入ABI BigDye Mix及引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)、醋酸鈉/乙醇法純化、按照ABI3730XL測(cè)序儀操作說(shuō)明上機(jī)。

1.3.4基因表達(dá)驗(yàn)證利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從TCGA(the Cancer Genome Atlas Project)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載并預(yù)處理乳腺癌(BRCA)數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)RNASEqV2數(shù)據(jù)。從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載卵巢癌樣本GSE12470的series matrix數(shù)據(jù)，使用Robust Multi-array Average(RMA)算法處理原始數(shù)據(jù)(.CEL文件)。從表達(dá)譜數(shù)據(jù)中提取FAM83E基因表達(dá)值，再比較其在癌組織與臨近正常組織表達(dá)中的差異。

表1目的基因的引物序列

Table1Primersequencesoftargetgenes

基因 上游序列 下游序列 PPIECACGTAGACTCGCACCCAAGGCTCAGAGCAGCTTTTGGDOCK3TCCTCCACTACCCATCGCAAACCAGTGCTGACAATGCTGADAMTS9TTCCCATAGAGGGCATGGAGTCCCATCTCTCTTCATTTGCAGCTOMM70AGATTCGGGACCAACCAGGGTAGTGGCCATGGAGTCCTAGTPIGZCTGTGGTCCCCCTCTACCTCGGAGGGGAATCAGGAACCGATTLL5CAGTGACTGACACAAATGCCCAGAGTGACATGTGGGTGCTATCYB5D2TTGAATACCCAGCGTGTGCTGCGGGAATGTCTGCTTCTCTMAP3K14GTCGCAATCTCCCAACAACCCTTGTGGTAGACCCCAGCACITGA3CCTTCCTGGTGGCTCAAACTGCCCCCGTAGACAACCTTAGLGALS3BPAGATGCCCCTGGACCTGTATCTGGATGGTGGGGAGGTAGATPRX1TGCCAGACACCCAGTTATTCCCAAAATGCAAATAGGAAAGGT-GTCTFAM83EGACTCTGACCCCCTACTCCCAGGCGTGCAGGAAATGAACALOC100507003TCTAGGACCCCTCGCTGAAATGGGGTCTCAGTGGAGTTGAZNF616CCAGTGCCCCATGAAAACAACCAGTGTGACTCCTTTGGTGTPRR14LAGGTCAGTCAGCCAAGGAGACAGCATCCAGTTCTCTCCGAATP5L2GGCCATTCGGGATGATGGACTTATAAAACCACGTCGACACCTCA

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,兩樣本均值比較采用Student’sttest,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析由上海晶能生物公司協(xié)助完成。

2　結(jié)果

2.1　外顯子測(cè)序

本研究采用Nimblegen/Roche公司的外顯子捕獲平臺(tái),對(duì)101,203,207樣本進(jìn)行外顯子組捕獲,IllumineHiseq 3000高通量測(cè)序儀進(jìn)行雙末端測(cè)序。對(duì)三個(gè)樣品的突變進(jìn)行注釋,數(shù)據(jù)分析。取101和207共有的、而203沒(méi)有的突變位點(diǎn),對(duì)這部分位點(diǎn)進(jìn)行dbSNP過(guò)濾,得到可能與HBOC發(fā)病相關(guān)的16個(gè)突變基因(見圖2,表2)。

2.2　基因重測(cè)序

將上述16個(gè)突變基因在201,205,209,217,219,305和313七個(gè)樣本中進(jìn)行重測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)病者中均有FAM83E基因突變(NM-017708:p.Ser387Gly),男性成員201也攜帶該突變(見表3)。

2.3　基因表達(dá)分析

分析TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)和GSE12470卵巢癌數(shù)據(jù),可見FAM83E基因在BC和OC組織中的表達(dá),較正常組織明顯升高(見圖3)。

對(duì)三個(gè)樣品的突變進(jìn)行注釋,其中101和207共有的,而203沒(méi)有的突變共938個(gè)圖2　全外顯子測(cè)序結(jié)果Figure 2　Results of whole exome sequencing

3　討論

大多數(shù)HBOC綜合征由BRCA1和BRCA 2種系突變(germline mutation)引起,BRCA 1/2基因作用于DNA的損傷修復(fù)、細(xì)胞周期的調(diào)控和凋亡,能夠維持基因組的完整性,促進(jìn)損傷細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞癌變[4,5]。仍有部分HBOC病因尚未得到很好的解釋,目前對(duì)于其他易感基因的研究越來(lái)越得到重視,包括Fanconi貧血相關(guān)(FANCD2、FANCA、FANCC),錯(cuò)配修復(fù)(MMR)相關(guān)(MLH1、MSH2、PMS1、PMS2、MSH6),DNA檢驗(yàn)點(diǎn)相關(guān)(ATM、ATR、CHK1/2)以及一些抑癌基因(TP53、SKT11、PTEN)在多種腫瘤綜合征中都被證實(shí)與增加的BC和OC風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[6,7]。WES又稱為定向外顯子組捕獲(tar-geted exome capture),可選擇性地對(duì)人類基因組的編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序,從而發(fā)現(xiàn)罕見及常見疾病相關(guān)的異?；騕8]。最近,M??tt?等[9]通過(guò)WES對(duì)13個(gè)HBOC家系的研究發(fā)現(xiàn),DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response,DDR)途徑中的18個(gè)突變基因與腫瘤發(fā)病有關(guān),其中,ATM、MYC、PLAU、RAD1和RRM2B基因變異在HBOC患者中的比例顯著高于對(duì)照者(優(yōu)勢(shì)比1.16-2.16)。我們運(yùn)用該方法篩選出的FAM83E基因,此前尚未有報(bào)道。根據(jù)連鎖分析、候選基因的突變和關(guān)聯(lián)分析的方法,鑒別不同風(fēng)險(xiǎn)的遺傳易感基因,將其分為高外顯率、中外顯率和低外顯率易感基因3類。FAM83E突變(p.Ser387Gly)軟件預(yù)測(cè)為中外顯率(moderate),不能排除該家系中以復(fù)合雜合形式存在的隱性遺傳模式的突變基因。

表2938個(gè)突變dbSNP過(guò)濾后初步篩選的候選易感基因

Table2Candidatesusceptiblegenesin938mutateddbSNPafterpreliminaryscreening

染色體定位 基因 外顯子生物型轉(zhuǎn)錄本 密碼子改變功能影響 chr1-40228236PPIEMISSENSENM-001195007:p.Asn295LysaaC/aaAMODERATEchr3-51378785DOCK3MISSENSENM-004947:p.Arg1295GlncGg/cAgMODERATEchr3-64666963ADAMTS9MISSENSENM-182920:p.Glu198GlygAg/gGgMODERATEchr3-100091482TOMM70AMISSENSENM-014820:p.Arg474GlyAgg/GggMODERATEchr3-196674932PIGZMISSENSENM-025163:p.Tyr279SertAt/tCtMODERATEchr14-76232602TTLL5MISSENSENM-015072:p.Lys636GluAaa/GaaMODERATEchr17-4057991CYB5D2MISSENSENM-144611:p.Gly139ArgGga/AgaMODERATEchr17-43347856MAP3K14MISSENSENM-003954:p.Arg632ThraGg/aCgMODERATEchr17-48166507ITGA3MISSENSENM-005501:p.Ile1027ValAtc/GtcMODERATEchr17-76968197LGALS3BPMISSENSENM-005567:p.Arg407TrpCgg/TggMODERATEchr19-48305157TPRX1MISSENSENM-198479:p.Met371ValAtg/GtgMODERATEchr19-49106768FAM83EMISSENSENM-017708:p.Ser387GlyAgt/GgtMODERATEchr19-49929883LOC100507003MISSENSENM-001195256:p.Tyr66HisTac/CacMODERATEchr19-52619875ZNF616MISSENSENM-178523:p.Arg181LysaGg/aAgMODERATEchr22-32110652PRR14LMISSENSENM-173566:p.Thr1058MetaCg/aTgMODERATEchr22-43036201ATP5L2MISSENSENM-001165877:p.Leu27SertTg/tCgMODERATE

表316個(gè)候選易感基因在其他家系成員中的重測(cè)序驗(yàn)證

Table3Validationof16candidatesusceptiblegenesinotherfamilymembersbyresequencing

基因201205209217219305313PPIE-------DOCK3-GG-GA-GG-GA--GG-GAADAMTS9-TT-TC-TT-TC--TT-TCTOMM70ATT-TCTT-TC--TT-TC--PIGZ------AA-ACTTLL5-TT-TCTT-TC----CYB5D2--GG-GA-GG-GA-GG-GAMAP3K14CC-CGCC-CGCC-CGCC-CGCC-CG--ITGA3AA-AGAA-AGAA-AGAA-AGAA-AG--LGALS3BP---CC-CTCC-CT--TPRX1AA-AG-AA-AG-AA-AG--FAM83EAA-AGAA-AG-AA-AGAA-AG--LOC100507003TT-CTTT-CTTT-CT-TT-CT--ZNF616GG-GAGG-GAGG-GA-GG-GA--PRR14L---CC-CTCC-CT-CC-CTATP5L2--TT-TCTT-TCTT-TC-TT-TC

“-”表示無(wú)突變

A. TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)顯示乳腺癌組織FAM83E表達(dá)較正常組織明顯升高B. GSE12470卵巢癌數(shù)據(jù)顯示卵巢癌組織FAM83E表達(dá)較正常組織明顯升高圖3　生物信息學(xué)分析FAM83E基因在乳腺癌和卵巢癌中的表達(dá)Figure 3　Expression of FAM83E gene in breast cancer and ovarian cancer by bioinformatics analysis

FAM83E(family with sequence similarity 83,member E)屬于一個(gè)高度保守的FAM83基因家族,該家族成員具有癌基因特點(diǎn),在大多數(shù)人類腫瘤中表達(dá)上調(diào)[10]。目前研究較多的是FAM83B。Cipriano等[11]基于慢病毒的可驗(yàn)證插入突變(validation based insertional mutagenesis,VBIM)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)人類乳腺上皮細(xì)胞(HME1)惡性轉(zhuǎn)化的FAM83B基因,進(jìn)一步real-time PCR分析表明,FAM83B在多種腫瘤組織中的表達(dá)明顯比正常組織升高,包括乳腺、肺、卵巢、宮頸、睪丸、甲狀腺、膀胱癌和淋巴瘤,并且FAM83B上調(diào)與某些特殊腫瘤亞型、腫瘤分級(jí)和不良預(yù)后相關(guān)[12]。在乳腺癌、肺癌、卵巢癌和宮頸癌細(xì)胞(MCF7、H1299、SKOV3和Hela)中干涉FAM83B的表達(dá)均明顯抑制細(xì)胞增殖。升高的FAM83B引起MAPK和mTOR信號(hào)通路活化,對(duì)靶向治療耐藥,相應(yīng)的信號(hào)通路抑制劑:MEK(U0126),mTOR(rapamycin)和c-Raf(RAF kinase inhibitor I)可抑制FAM83介導(dǎo)的細(xì)胞增殖[13]。亞克隆分析表明DUF1669結(jié)構(gòu)域是FAM83B與c-Raf結(jié)合,進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化所必需的[14]。因此推測(cè)FAM83其他家族成員也具有相似作用。

目前,FAM83E基因在惡性腫瘤中的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式,生化實(shí)驗(yàn)中常通過(guò)基因定點(diǎn)突變Ser為丙氨酸(相關(guān)位點(diǎn)不能被磷酸化)模擬去磷酸化狀態(tài),將Ser突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼?利用其PO4基團(tuán)的負(fù)電荷效應(yīng)而更易磷酸化)模擬過(guò)磷酸化狀態(tài)。因此,我們推測(cè),FAM83E突變(p.Ser387Gly)(絲氨酸突變?yōu)楣劝彼?,促使該蛋白自身活化,進(jìn)而持續(xù)激活下游MAPK/ERK和AKT/mTOR信號(hào)通路,促進(jìn)BC和OC發(fā)生發(fā)展。后續(xù)值得進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究,深化理解BC和OC發(fā)病機(jī)制,可望發(fā)現(xiàn)新型驅(qū)動(dòng)基因及潛在治療靶點(diǎn)。

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