崔小麗,山　媛,袁　婕,趙　瑞,馬　妮,呂　樺

(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科,西安　710068；*通訊作者,E-mail:lvh2113@163.com)

癲癇是一組由不同病因引起,腦部神經(jīng)元高度同步化,且常具自限性的異常放電所致,以發(fā)作性、短暫性、重復性及刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征。Eriksson和其同事在1998年初次提出人腦內(nèi)有神經(jīng)再生。在難治性顳葉癲癇患者病理標本中可以發(fā)現(xiàn)神經(jīng)前體細胞增殖分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞。癲癇持續(xù)狀態(tài)以后幾天就會看到神經(jīng)發(fā)生,幾周以后還會保持高水平。動物在正常情況下,其新生神經(jīng)元接受功能性傳入信息,繼而將信號傳出到突觸后神經(jīng)元。在癲癇哺乳動物腦組織發(fā)現(xiàn)新生神經(jīng)元異位遷移,異位到門區(qū),形成異常的神經(jīng)環(huán)路,提高神經(jīng)元的興奮性,導致癲癇的反復發(fā)作。癲癇發(fā)作后,海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平出現(xiàn)明顯改變。這一現(xiàn)象為探討癲癇后海馬結(jié)構(gòu)和功能可塑性的變化提供全新思路,也為癲癇的治療帶來新的曙光。阿司匹林對癲癇發(fā)生過程中神經(jīng)發(fā)生有何作用尚不清楚。本實驗采用氯化鋰-匹羅卡品致癲癇大鼠模型,觀察非甾體抗炎藥阿司匹林對匹羅卡品誘導大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬異常神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控研究。

1　材料和方法

1.1　主要試劑

氯化鋰(廣東西隴化工廠);匹羅卡品(Sigma-Aldrich);溴甲基東莨菪堿(Sigma-Aldrich);水合氯醛(上海山浦化工有限公司);阿司匹林(Sigma-Aldrich);地西泮注射液(西安利君精華藥業(yè)有限公司);小鼠抗BrdU抗體(Santa Cruz Biotechnology);羊抗DCX抗體(Santa Cruz Biotechnology);生物素標記的羊抗小鼠IgG(Vector laboratories,Burlingame,CA);生物素標記的兔抗羊IgG(Vector laboratories,Burlingame,CA);生物素-卵白素-HRP復合物(Sigma-Aldrich)。

1.2　實驗動物及分組

雄性SD大鼠75只,清潔級,體質(zhì)量200-250 g,購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心,飼養(yǎng)于12 h/12 h光暗環(huán)境(8:00-20:00),自由飲水,給予標準飲食。所有的動物實驗處理嚴格按照國家健康協(xié)會制定的實驗動物護理和使用指南。75只大鼠隨機等分為正常對照組、模型組、0 h阿司匹林干預組、3 h阿司匹林干預組和24 h阿司匹林干預組(癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)70 min,地西泮注射液終止發(fā)作,終止后的即刻給予阿司匹林干預定為0 h阿司匹林干預組,終止后的3 h、24 h分別開始給藥,定為3 h阿司匹林干預組和24 h阿司匹林干預組)。

1.3　氯化鋰-匹羅卡品致大鼠癲癇模型

大鼠腹腔注射氯化鋰(3 meq/kg,美國Sigma公司),間隔18-20 h腹腔注射匹羅卡品(30 mg/kg,美國Sigma公司),在注射匹羅卡品前15-20 min大鼠給予皮下注射溴甲基東莨菪堿(1 mg/kg)以減少外周膽堿能反應。注射匹羅卡品后約15 min大鼠會出現(xiàn)行為學變化,行為變化的記錄和等級依照Racine評分標準[1]:0級,無任何反應;1級,行為固定,面肌抽搐;2級,點頭和濕狗樣動作;3級,雙側(cè)前肢陣攣;4級,前肢陣攣和后肢站立;5級,站立并摔倒。大鼠出現(xiàn)連續(xù)的四級以上發(fā)作持續(xù)70 min,給予地西泮終止發(fā)作。建模時對照組腹腔注射給予等量生理鹽水。終止發(fā)作半小時后,每只大鼠皮下注射生理鹽水10 ml,減少大鼠的死亡率,補充建模時的消耗。造模后前2 d,給予大鼠糊狀常規(guī)鼠糧。

1.4　阿司匹林干預及分組

將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、0 h阿司匹林(20 mg/kg,腹膜腔內(nèi)注射1次/d)干預組、3 h阿司匹林干預組、24 h阿司匹林干預組,阿司匹林溶于含5%二甲基亞砜(5%DMSO)的生理鹽水,各組都是連續(xù)給藥20 d,對照組和模型組都是給予等量的含5%DMSO的生理鹽水。

1.5　BrdU給藥方法

建模癲癇發(fā)作后第6天大鼠腹腔注射BrdU 10 mg/ml(50 mg/kg,Sigma公司),每12 h一次,共4次。BrdU末次注射后28 d處死大鼠,觀察新生細胞的分化遷移情況。

1.6　標本制備

于實驗設計的時間點,將各實驗組大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉,迅速開胸暴露膈肌,小心挑破膈肌顯露心臟,剝離心包膜,經(jīng)左心室進入主動脈,固定針頭,剪破右心耳,迅速灌注。首先灌注生理鹽水150 ml沖去血液,然后用4%多聚甲醛(4 ℃,pH=7.4)固定,先快速灌注200 ml,再慢速灌注200 ml。開顱取腦,將腦組織入4%多聚甲醛后固定4 h,再入30%蔗糖,放置在4 ℃,直到組織沉底。冰凍切片機恒溫,將腦組織中的海馬部分冠狀位連續(xù)切片,片厚30 μm。每只大鼠隔5張腦片取一張組成一套,每套10張腦片,共6套。預做免疫組織化學染色的入0.01 mol/L PBS中,其他的入凍存液(60%丙三醇:40% 0.01 mol/L PBS),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7　免疫組織化學染色

BrdU染色:切片依次入下列流程:0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;50%甲酰胺/2×標準檸檬酸鹽-氯化鈉液(standard saline citrate,SSC)=1 ∶1,65 ℃,2 h;2×SSC漂洗2次,10 min/次;37 ℃水浴2 mol/L鹽酸30 min;pH=8.5 0.1 mol/L 硼酸10 min;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;80%甲醇 ∶30%雙氧水=1 ∶1 30 min;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;0.01 mol/L PBS ∶0.3%Triton-X100=100 ∶1 30 min;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;切片入小鼠抗BrdU單克隆抗體(1 ∶500,Santa Cruz)室溫24 h;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;切片入生物素化的羊抗小鼠IgG(1 ∶500,Vector Laboratories,Burlingame,CA)室溫2 h;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;切片入生物素-卵白素-HRP復合物(1 ∶500,Sigma)室溫2 h;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;葡萄糖氧化酶-DAB顯色。顯色后依次裱片,晾干后酒精梯度脫水,二甲苯透明,樹膠封片。對照組用0.01 mol/L PBS代替抗體稀釋液,其余同上,結(jié)果均為陰性。抗體稀釋液為含1%胎牛血清白蛋白和0.3% Triton-X100的0.01 mol/L PBS。

DCX染色:漂片依次入下列溶液:0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次),80%甲醇 ∶雙氧水=100 ∶1 30 min;0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次),0.01 mol/L PBS ∶30% Triton=100 ∶1 30 min;0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次);漂片入含羊抗DCX(1 ∶500,Santa Cruz Biotechnology)的抗體稀釋液中,室溫孵育24 h,0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次);再入生物素化的兔抗羊IgG(1 ∶500,Vector laboratories,Burlingame,CA)中,室溫孵育2 h;0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次),生物素-卵白素-HRP復合物(1 ∶500,Sigma-Aldrich),室溫孵育2 h;0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次);葡萄糖氧化酶-DAB法顯色。顯色后依次裱片,晾干后酒精梯度脫水,二甲苯透明,樹膠封片。對照組用0.01 mol/L PBS代替抗體稀釋液,其余同上,結(jié)果均為陰性。

1.8　統(tǒng)計學分析

BrdU計數(shù)采用雙盲法,于BX-51,Olympus顯微鏡200倍下觀察并計數(shù)門區(qū)內(nèi)BrdU陽性細胞數(shù),結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,各均數(shù)之間的比較采用One-way ANOVA,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。對所有DCX陽性細胞,計數(shù)新生神經(jīng)元門區(qū)基數(shù)突數(shù)量并測量基數(shù)突長度。用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果

2.1　行為學表現(xiàn)

大鼠在腹腔注射匹羅卡品后5 min內(nèi),出現(xiàn)搔抓、流涎、腹瀉等外周反應;10-15 min出現(xiàn)面部陣攣,包括眨眼、動須、節(jié)律性咀嚼和點頭等Ⅱ級以上的表現(xiàn)，約20 min后出現(xiàn)前肢痙攣,后肢站立并摔倒等Ⅳ級以上的發(fā)作表現(xiàn)。

2.2　阿司匹林干預后減少了新生細胞向門區(qū)的異常遷移

BrdU末次注射28 d處死大鼠行免疫組化,各實驗組新生細胞在齒狀回內(nèi)的分布有明顯的差異(見圖1)。正常組和阿司匹林干預組中,BrdU陽性細胞呈圓形或橢圓形,主要分布于亞顆粒增生帶和顆粒細胞層;模型組中BrdU陽性細胞主要分布于門區(qū)(見圖1)。統(tǒng)計學結(jié)果定量分析表示,模型組門區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)量明顯增加,與其他組間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而各干預組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。該結(jié)果表明癲癇發(fā)作后新生細胞出現(xiàn)向門區(qū)的異常遷移;阿司匹林干預能夠明顯地減少這種異常遷移。

2.3　阿司匹林干預后顯著減少SE后門區(qū)內(nèi)DCX陽性突起的數(shù)量和長度

正常情況下DCX主要分布于亞顆粒增生帶,突起伸向分子層。BrdU注射28 d后,新生神經(jīng)元表現(xiàn)出異常遷移模式,形成異位門區(qū)基樹突和門區(qū)異位神經(jīng)元(見圖2)。模型組的突起有一部分伸向了門區(qū);模型組DCX向門區(qū)的異位遷移明顯的增加,阿司匹林干預后,新生神經(jīng)元向門區(qū)的遷移較模型組減少,突起的數(shù)量和突起的長度都較模型組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3，4),而各干預組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。正常對照組、模型組、0 h Asp干預組、3 h Asp干預組、24 h Asp干預組突起的數(shù)量分別為10.0±6.45，184.67±19.86，33.33±10.09，28.67±7.53，28.20±8.44(見圖3)；突起的長度分別為(173.45±3.46)μm，(2 952.9±636.33)μm，(1 206.3±241.87)μm，(868.20±139.03)μm，(948.87±124.26)μm(見圖4)。

3　討論

癲癇嚴重地危害著人類的生命,其在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)病率僅次于腦血管病,對個人而言嚴重地影響其身心發(fā)展,對家庭社會而言無疑是一極大的負擔。該病的不可預知性,更是讓我們難以防范。到目前為止,抗癲癇藥種類繁多,但沒有任一種藥物能夠從根源上解決問題,而仍然有30%癲癇患者發(fā)作癥狀不能得到有效的控制[2],所以全人類亟需找到新的抗癲癇方法,從根源上解決問題,也就是抗癲癇發(fā)生。目前比較公認的一種說法是,癲癇發(fā)生或者說潛伏期是一段時期,指在受到創(chuàng)傷如腦損傷、中風、持續(xù)的熱性驚厥、癲癇持續(xù)狀態(tài)或腦炎后,出現(xiàn)第一次自發(fā)性發(fā)作之前的一段時期。癲癇發(fā)生的過程中改變了神經(jīng)元的興奮性,確立了主要的內(nèi)部鏈接,以及結(jié)構(gòu)的改變。這些改變包括神經(jīng)變性、神經(jīng)發(fā)生等[3]。癲癇發(fā)生過程中一個重要改變?yōu)樾律窠?jīng)元的異常遷移,大量研究已經(jīng)證實,海馬齒狀回顆粒細胞的異常整合,其中包括門區(qū)異位顆粒細胞,是顳葉癲癇的重要病理特征[4],在癲癇持續(xù)狀態(tài)后,新生神經(jīng)元的正常遷移方向受到干擾,這些新生神經(jīng)元形成的基樹突,異常伸向門區(qū),在門區(qū)內(nèi)無序排列,形成門區(qū)的異位神經(jīng)元,有研究發(fā)現(xiàn)[5],這些新生神經(jīng)元在電生理特性及形態(tài)上與齒狀回的顆粒細胞非常相似,但與成熟的顆粒細胞不同的是,門區(qū)異位神經(jīng)元可以與海馬CA3區(qū)錐體細胞同步,產(chǎn)生異常爆發(fā)點燃,氯化鋰-匹羅卡品誘導的癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中,給予抗有絲分裂抑制劑,可以抑制海馬神經(jīng)發(fā)生,進而減少門區(qū)異位神經(jīng)元的形成,最終降低癲癇發(fā)作的頻率。也有研究表明癲癇持續(xù)狀態(tài)后齒狀回新生顆粒神經(jīng)元爆發(fā)性增加,這些新生神經(jīng)元同時表現(xiàn)出異常遷移[6]，導致形成異常神經(jīng)網(wǎng)絡,興奮性環(huán)路重組,腦的興奮性與抑制性失平衡,這使得神經(jīng)細胞過度興奮及高度同步化,導致癲癇反復發(fā)作。

圖1　阿司匹林對癲癇大鼠海馬齒狀回內(nèi)BrdU標記新生細胞表達的影響Figure 1　Effect of aspirin on BrdU labeling newborn cells in hippocampal dentate gyrus(DG) of epileptic rats

A.正常對照組；B.癲癇模型組； C.0 h Asp干預組；D.3 h Asp干預組；E.24 h Asp干預組(scale bar=100 μm);　F.B圖方框部位的放大(Scale bar=50 μm)圖2　阿司匹林對癲癇大鼠海馬齒狀回內(nèi)DCX標記新生神經(jīng)元遷移表達的影響Figure 2　Effect of aspirin on aberrant migration of DCX-labeled newborn cells in hippocampal dentate gyrus(DG) of epileptic rats

與Control組相比,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01圖3　阿司匹林干預對SE后門區(qū)內(nèi)DCX陽性突起的數(shù)量的影響Figure 3　Effect of aspirin on DCX-positive dendritic processes reaching into the hilus after SE

與Control組相比,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01圖4　阿司匹林干預對SE后門區(qū)內(nèi)DCX陽性突起長度的影響Figure 4　Effect of aspirin on the length of DCX-positive dendritic processes reaching into the hilus after SE

近期發(fā)現(xiàn)癲癇的發(fā)生過程中炎性因子起了重要作用[7],在癲癇患者的標本和動物實驗中都觀察到有炎性分子的大量表達。在炎癥存在的情況下癲癇發(fā)作的閾值減低。炎癥分子在不同程度上影響神經(jīng)元的興奮性,機制之一為,IL-1β和TNF通過阻斷星型膠質(zhì)細胞對谷氨酸的再攝取[8],增加了細胞外谷氨酸的濃度,同時也促進了星型膠質(zhì)細胞釋放谷氨酸。此外,細胞因子和前列腺素物質(zhì)還調(diào)節(jié)電壓門控和受體門的離子通道的功能。如果在癲癇發(fā)生的潛伏期進行干預,那么癲癇發(fā)生的病理變化將被控制,后期也將可能不會有癲癇自發(fā)發(fā)作?？寡姿幇⑺酒チ帜芊窀淖儼d癇發(fā)生過程中的病理變化,從根源上控制癲癇還沒有詳細的被證明。本實驗中我們利用氯化鋰-匹羅卡品致癲癇大鼠模型,在靜默期給予抗炎藥阿司匹林干預,觀察癲癇形成過程中的結(jié)構(gòu)病理變化。在該部分實驗中我們觀察到非甾體抗炎藥阿司匹林有神經(jīng)保護作用,這和以往的報道是一致的[9],減少了海馬神經(jīng)元的丟失。減少神經(jīng)元損傷這一作用對其將來能否應用于臨床治療癲癇起很好的支持作用。難治性癲癇患者大部分為耐藥,現(xiàn)有的抗癲癇藥物不能控制其臨床癥狀,這些患者腦內(nèi)大多有一共同的變化,即海馬神經(jīng)元丟失變性。因此在各種傷害性腦損傷誘導腦內(nèi)級聯(lián)事件的發(fā)生,導致癲癇自發(fā)性發(fā)作之前給予神經(jīng)保護性藥物或許能夠減少后期的自發(fā)性發(fā)作。與本課題組的既往研究一致[10],在該實驗中我們還發(fā)現(xiàn),癲癇組大鼠海馬新生神經(jīng)元出現(xiàn)向門區(qū)的異常遷移,這些異位的神經(jīng)元成為癲癇反復發(fā)作的新的靶點。海馬區(qū)異常的神經(jīng)發(fā)生導致了癲癇發(fā)作及認知功能下降[11],本研究的結(jié)果表明,抗炎藥阿司匹林干預明顯地減少了神經(jīng)元的異常遷移,差異有統(tǒng)計學意義。成年海馬部位亞顆粒增生帶還可以產(chǎn)生新的細胞,神經(jīng)前體細胞從亞顆粒細胞層呈放射狀遷移至海馬顆粒細胞層的基底部,在此神經(jīng)前體細胞分化為顆粒細胞,進而建立突觸聯(lián)系[12]。癲癇發(fā)作后,這些異位入門區(qū)的神經(jīng)元與CA3區(qū)的錐體神經(jīng)元整合成新的網(wǎng)絡,可能導致后期癲癇的自發(fā)性發(fā)作。這些異位的神經(jīng)元還可和苔蘚纖維建立連接[13],進而導致自發(fā)爆發(fā)動作電位。癲癇發(fā)生后,海馬新生神經(jīng)元出現(xiàn)異位遷移的確切機制尚未闡明,近來研究表明細胞外基質(zhì)蛋白Reelin使神經(jīng)元朝著正常的方向遷移[14],在匹羅卡品致癲癇大鼠模型中,研究發(fā)現(xiàn)Reelin表達下降,因此上調(diào)Reelin或許可以減少齒狀回神經(jīng)發(fā)生和新生神經(jīng)元的異常遷移。目前我們課題組發(fā)現(xiàn),癲癇發(fā)作后門區(qū)激活的小膠質(zhì)細胞可能指導了新生神經(jīng)元的異常遷移,給予小膠質(zhì)細胞的抑制劑米諾環(huán)素可以阻斷新生神經(jīng)元向門區(qū)的異常遷移[15]。但哪種機制是最重要的,需要下一步實驗的進一步證實。

綜上本實驗表明抗炎藥阿司匹林能夠減少新生神經(jīng)元的異常遷移。阿司匹林上述作用可能使得其能夠減少癲癇反復自發(fā)發(fā)作,給臨床治療提供了一定的參考價值。抗炎藥是通過什么途徑影響了癲癇發(fā)生過程中的病理變化也是一個很有意義的課題,在今后的實驗中我們將會從分子水平進一步闡述,以期為臨床預防與治療難治性癲癇提供依據(jù)。

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