王曉元,李曙光*,趙軼峰,楊永江,武雪亮,李　坤,王金科，彭　濤

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科,張家口　075000;2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:shuguangli6688@126.com)

1　材料與方法

1.1　病例資料

收集2016-09～2017-01河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織40例和癌旁正常組織40例,癌組織取自癌灶中心處,癌旁組織取自殘端切緣經(jīng)病理證實(shí)為正常腸組織。全部病例均為原發(fā)性腫瘤,且術(shù)前未行新輔助放化療等針對性治療,術(shù)后標(biāo)本均在手術(shù)切除組織后1 h獲得,并存于液氮中。

1.2　主要試劑與實(shí)驗方法

1.2.1主要試劑兔抗人單克隆濃縮型SLC12A5抗體,購于香港abcam公司;兔抗人GAPDH多克隆一抗、羊抗兔二抗,購于美國Santa Crue公司;DAB顯色劑購于上海Gene Tech公司?？俁NA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)指示劑、RIPA試劑、BCA蛋白定量試劑盒、引物均購自美國Life Technologies公司。

1.2.2RT-PCR法檢測SLC12A5 mRNA表達(dá)提取并測定總RNA濃度,設(shè)計SLC12A5上游引物:5′-GCAGGAGCCATGTACATCCT-3′,下游引物:5′-CCATGCAGGTGAGCACACA-3′;GAPDH上游引物:5′-GGAGATTGTTGCCATCAACG-3′,下游引物:5′-TTGGTGGTGCAGGATGCATT-3′;反應(yīng)體系:1×PCR Buffer 2.5 μl,dNTP 0.5 μl,cDNA模板2 μl,Taq酶1.25 U,上下游引物各1 μl,RNA 酶抑制劑1 μl,反應(yīng)總體積25 μl。根據(jù)試劑盒說明書操作進(jìn)行擴(kuò)增:以1 μl DNA樣本作為模板,以去離子水為陰性對照模板;擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃10 s,退火溫度15 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠后電泳分離,于紫外線燈下觀察結(jié)果。

1.2.3Western blot法檢測SLC12A5蛋白表達(dá)提取總蛋白并定量,取50 μg蛋白,置入5×緩沖液(4 ∶1),100 ℃水浴,5 min 3次,8% SDS-PAGE電泳,后轉(zhuǎn)至PVDF膜,取出膜,加5%脫脂奶粉封閉,棄封閉液滴加特異性一抗-4 ℃孵育過夜,加TBST洗滌液,滴加特異性二抗(1 ∶1 500)37 ℃孵育1 h,再次加入TBST洗滌液,ECL法檢測條帶,進(jìn)行密度定量分析。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色檢測SLC12A5蛋白表達(dá)10%甲醛溶液固定標(biāo)本,石蠟包埋,切片4 μm,蘇木精-伊紅染色,病理診斷。切片經(jīng)80 ℃烤箱烤片30 min,乙醇脫水,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復(fù);PBS洗3次,加一抗(1 ∶100)50 μl,4 ℃過夜;PBS洗3次,加二抗50 μl。室溫下DAB顯色,PBS洗3次,蘇木精輕度復(fù)染,鹽酸乙醇分化,流水沖洗10 min,梯度乙醇脫水,松節(jié)油透明,樹膠封片,陰性對照為PBS代替一抗,光鏡下觀察。

SLC12A5陽性表達(dá)的判定:陽性染色主要集中于細(xì)胞質(zhì)中,少量表達(dá)于細(xì)胞核,為棕黃色或褐色顆粒,計算陽性細(xì)胞百分比并評分,≤5%為0分,6%-25%為1分,26%-50%時為2分,51%-75%時為3分,>75%時為4分;無著色:0分,淺黃色:1分,黃色:2分,深黃色:3分。兩者相乘,0分為(-),1-4分為(+),5-8分為(++),9-12分為(+++),(+)-(+++)均視為陽性。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析,計數(shù)資料以百分率表示,運(yùn)用χ2檢驗表示 SLC12A5的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,設(shè)α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

徐州市中心城區(qū)分為12個片區(qū)，其中老城片區(qū)、壩山片區(qū)、云龍湖周邊片區(qū)、南部片區(qū)為優(yōu)化提升區(qū)，以傳統(tǒng)商業(yè)形態(tài)為主；北部片區(qū)、西部片區(qū)、銅山片區(qū)、機(jī)場片區(qū)、新城片區(qū)、高鐵生態(tài)商務(wù)片區(qū)為鼓勵發(fā)展區(qū)，商業(yè)綜合體布局為主；高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)區(qū)、金山橋片區(qū)為限制發(fā)展區(qū)，商業(yè)布局缺乏。

2　結(jié)果

2.1　SLC12A5的RT-PCR檢測結(jié)果

以SLC12A5/GAPDH 比值作為RT-PCR定量分析指標(biāo),癌組織中SLC12A5 mRNA 的表達(dá)水平(0.98±0.04)明顯高于結(jié)直腸正常組織(0.18±0.03),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008,見圖1)。

圖1　RT-PCR檢測結(jié)直腸癌及正常腸黏膜組織SLC12A5 mRNA的表達(dá)Figure 1　Expression level of SLC12A5 mRNA in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by reverse-transcription polymerase chain reaction

2 2　SLC12A5的Western blot檢測

以SLC12A5/GAPDH比值做蛋白定量檢測指標(biāo),SLC12A5蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平亦較結(jié)直腸正常組織高(0.86±0.05vs0.15±0.02),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017,見圖2)。

圖2　Western blot印跡法檢測結(jié)直腸癌及癌旁正常黏膜組織SLC12A5蛋白的表達(dá)Figure 2　Expression level of SLC12A5 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by Western blot

2.3　SLC12A5的免疫組化檢測

SLC12A5在結(jié)直腸癌組織組陽性表達(dá)率是87.50%(35/40),明顯高于癌旁正常黏膜的32.50%(13/40),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.27,P=0.000,見圖3及表1)。

2.4　SLC12A5蛋白與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

SLC12A5蛋白的表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤大小、分化程度無關(guān),而在有無腫瘤漿膜浸潤、有無肝轉(zhuǎn)移、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同腫瘤TNM分期、有無脈管浸潤中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見表2)。

A. 結(jié)直腸正常組織　 　B. 結(jié)直腸癌組織圖3　免疫組化檢測結(jié)直腸組織中SLC12A5蛋白的表達(dá) (×200)Figure 3　Expression level of SLC12A5 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by immunohistochemistry (×200)

表1SLC12A5蛋白在結(jié)直腸癌組織及正常組織中的表達(dá)(例)

Table1ExpressionofSLC12A5proteinincolorectaladenocarcinomaandnormalcolorectaltissues(cases)

組別nSLC12A5-++++++ χ2 P癌組 4056111816.2750.000正常組4027733

3　討論

SLC12A5是溶質(zhì)載體家族12亞組中的重要成員之一,定位于人染色體20q13.12,這是人類多種惡性腫瘤最常見的擴(kuò)增區(qū)[6]。SLC12A5最初是作為一種跨膜氯化鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體被發(fā)現(xiàn)的,這種轉(zhuǎn)運(yùn)體可以維持神經(jīng)元內(nèi)外氯平衡,因而最初對SLC12A5的研究僅局限于癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]。而近年來研究發(fā)現(xiàn)SLC12A5突變或異常表達(dá)參與某些實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。Yu等[9]通過單細(xì)胞測序研究發(fā)現(xiàn)突變型SLC12A5在大腸癌患者中呈高表達(dá),而在正常人群中呈低頻表達(dá),因而表明突變型SLC12A5在大腸癌中有潛在的致癌作用。Xu等[10]通過基因測序、基因擴(kuò)增技術(shù)發(fā)現(xiàn)SLC12A5與原發(fā)性大腸癌的發(fā)生密切相關(guān),其能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1過渡,增強(qiáng)其侵襲、遷移能力。SLC12A5抗凋亡的作用是通過抑制凋亡誘導(dǎo)因子和核酸內(nèi)切酶G-依賴的凋亡信號通路介導(dǎo)的;而促轉(zhuǎn)移作用是通過調(diào)節(jié)基質(zhì)體系結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵要素,包括基質(zhì)金屬蛋白酶和纖維連接蛋白等[11]。進(jìn)一步研究顯示SLC12A5的過表達(dá)與大腸癌患者生存期顯著下降關(guān)系密切。Liu等[12]通過實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測癌細(xì)胞系、蛋白免疫印跡和免疫組織化學(xué)法檢測SLC12A5在膀胱腫瘤中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)SLC12A5表達(dá)在膀胱腫瘤組織中表達(dá)明顯增加,SLC12A5表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)、血行轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Kaplan Meier生存曲線顯示高SLC12A5表達(dá)與膀胱腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān),且是患者生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo),考慮SLC12A5可能作為調(diào)節(jié)NF-κB信號通路和促進(jìn)MMP-7增殖的重要因子,促進(jìn)膀胱腫瘤轉(zhuǎn)移,增強(qiáng)其惡性生物學(xué)行為。

表2SLC12A5在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系(例)

Table2ExpressionofSLC12A5proteinincolorectaladenocarcinomatissuesanditscorrelationwithclinicalpathologicalfeatures(cases)

病理參數(shù)nSLC12A5-+陽性率(%)χ2P年齡0.0650.975 ≥60歲2231986.36 <60歲1821688.89腫瘤大小0.0830.781 ≥5cm2632388.46 <5cm1421285.71分化程度0.0710.962 高92775.00 中1821671.43 低1321170.59漿膜浸潤8.9540.002 有3423294.12 無63350.00TNM分期7.0970.008 Ⅰ+Ⅱ83562.50 Ⅲ+Ⅳ3223093.75淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8.2510.006 有2412395.83 無1641275.00肝轉(zhuǎn)移6.3330.016 有909100.00 無3152683.87脈管浸潤4.0970.041 有11011100.00 無2952482.76

本研究通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SLC12A5 mRNA 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平明顯高于結(jié)直腸正常組織,表明SLC12A5 mRNA在結(jié)直腸癌組織中廣泛表達(dá),而在正常黏膜組織中其表達(dá)沉默或下調(diào);應(yīng)用Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)SLC12A5蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平亦較結(jié)直腸正常組織高,免疫組化發(fā)現(xiàn)SLC12A5在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常組織,表明SLC12A5過表達(dá)在結(jié)直腸癌癌變過程中發(fā)揮關(guān)鍵的促進(jìn)作用,SLC12A5是一種促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的致癌基因。

深入研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌伴漿膜浸潤者較未侵及漿膜者SLC12A5蛋白表達(dá)明顯增高;伴肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤者較無轉(zhuǎn)移浸潤者SLC12A5蛋白表達(dá)明顯增高;TNM分期越高,SLC12A5蛋白表達(dá)也越高,表明SLC12A5蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān),對結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。

綜上所述,SLC12A5的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及其惡性生物學(xué)行為具有高度的相關(guān)性,因而SLC12A5有望成為新的腫瘤監(jiān)測指標(biāo),為臨床診治及預(yù)后監(jiān)測提供重要的參考。本實(shí)驗僅對SLC12A5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系做出了相關(guān)研究,但對其致癌機(jī)制、作用通路尚有待研究。

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