韓　曼,劉曉華,杜劍青

(1陜西中醫(yī)藥大學(xué)生理學(xué)教研室,咸陽　712046;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理生理學(xué)與生理學(xué)系;*通訊作者,E-mail:dujianq@mail.xjtu.edu.cn)

心源性疾病引起的胸痛越來越受到重視,而心肌缺血是引起心源性胸痛的主要原因之一?，F(xiàn)已明確缺血損傷的心肌組織可釋放多種致痛物質(zhì),如,緩激肽(bradykinin,BK)、腺苷、組織胺、5-羥色胺、鉀離子、前列腺素等。這些化學(xué)因素具有協(xié)同作用,可激活心臟交感神經(jīng)Aδ和C類纖維末梢引起疼痛。大鼠雖無心源性疼痛,但是存在與心源性疼痛相似的心臟傷害性感受。2001年,Jou等[1]通過心包內(nèi)注射化學(xué)性致痛物質(zhì)誘發(fā)大鼠心臟傷害性感受,表現(xiàn)為心臟-軀體運(yùn)動反射,該反射以背斜方肌肌電(electromyogram,EMG)為觀測指標(biāo)。本課題組采用心包內(nèi)注射化學(xué)性致痛物質(zhì)制備大鼠心臟傷害性感受模型對心源性疼痛中樞調(diào)控節(jié)機(jī)制的研究已取得初步進(jìn)展[2-4]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有一個以腦干中線結(jié)構(gòu)為中心、由許多腦區(qū)組成的痛覺調(diào)制的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueductal gray,PAG)處于核心地位,是中樞內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),處在承上啟下的重要地位[5,6]。研究表明電刺激大鼠PAG對脊髓背角神經(jīng)元放電、熱輻射痛閾具有抑制作用[7,8],然而,電刺激PAG對心臟傷害性感受是否具有下行性抑制調(diào)控作用,尚不清楚。本研究擬通過電刺激激活PAG,觀察大鼠心包內(nèi)注射BK誘發(fā)背斜方肌EMG活動及脊髓背角c-Fos表達(dá)的變化,探討PAG對心臟傷害性感受的下行性調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1　主要試劑與儀器

BK、戊巴比妥鈉(均購于美國Sigma公司),藥物均溶解于生理鹽水中,配制成所需濃度。BK:1 μg/ml和50 μg/ml;戊巴比妥鈉:20 g/L和5 g/L。兔抗大鼠c-Fos多克隆抗體(AB7963;美國Abcam公司);ABC Kit免疫組化試劑盒(PK-6101;美國Vector公司)。蠕動泵(BT100-2J,保定蘭格恒流泵有限責(zé)任公司);小動物呼吸機(jī)(DW3000-B型,淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);BL-420A生物信號采集與分析系統(tǒng)及壓力換能器(成都泰盟生物科技有限公司);大鼠腦立體定位儀(日本Narishige公司)。

1.2　實(shí)驗(yàn)動物分組

實(shí)驗(yàn)選用36只雄性10周齡清潔級SD大鼠,體質(zhì)量280-300 g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(生產(chǎn)許可證:SCXK(陜)2012-003),大鼠在標(biāo)準(zhǔn)清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)。動物隨機(jī)分為3組:生理鹽水組、BK組、電刺激+BK組,每組12只。其中每組6只大鼠記錄背斜方肌肌電,余6只大鼠行免疫組化染色。

1.3　實(shí)驗(yàn)動物模型建立

SD大鼠給予2%戊巴比妥鈉45-55 mg/kg腹腔麻醉。行氣管插管后對動物實(shí)施人工呼吸(潮氣量5.0-6.0 ml,呼吸頻率60-70次/min),左側(cè)頸靜脈插管用于補(bǔ)液及維持麻醉[0.05%戊巴比妥鈉,15 mg/(kg·h)],右側(cè)頸總動脈插管用于監(jiān)測動脈血壓,維持平均動脈壓處于90-100 mmHg,從而保證一個穩(wěn)定而合適的麻醉狀態(tài)。暴露左側(cè)背斜方肌,記錄EMG。直腸溫度計監(jiān)測大鼠體溫,通過溫控儀維持大鼠體溫在(37.0±0.5)℃。

心包插管術(shù)與給藥方法:為實(shí)現(xiàn)用心包內(nèi)BK誘發(fā)大鼠心臟傷害性感受的目的,對大鼠左側(cè)上胸部第一到第三肋軟骨處行開胸術(shù),暴露胸腺和心臟。用玻璃探針在心包膜上開一小孔,將一內(nèi)徑0.051 cm、外徑0.094 cm、長12-14 cm遠(yuǎn)端有數(shù)個小洞的硅膠管順胸腺中線經(jīng)此孔插入心包約2 cm,依次縫合各層胸壁組織,以固定心包插管。

心臟-軀體運(yùn)動反射實(shí)驗(yàn)給藥方法:通過心包插管向心包內(nèi)注射BK 0.2 ml(1 μg/ml),記錄EMG活動60 s后回抽,0.2 ml無菌生理鹽水連續(xù)沖洗心包5次并回抽,同一只大鼠,心包注射BK每次間隔40 min。整個過程用0.05%戊巴比妥鈉維持麻醉。

免疫組化實(shí)驗(yàn)給藥方法:大鼠實(shí)施基礎(chǔ)手術(shù)后4 h,心包內(nèi)一次性注射BK溶液0.2 ml(50 μg/ml),保留不回抽。整個過程用0.05%戊巴比妥鈉維持麻醉,心包內(nèi)注射BK 2 h后灌注。

背斜方肌EMG的記錄:同芯電極以30°的角度插入背斜方肌約1.5-1.7 mm,通過BL-420A生物信號采集與分析系統(tǒng)記錄其EMG活動,每次BK誘發(fā)EMG活動總放電單位數(shù)(TMUD)通過BL-420A分析軟件直接統(tǒng)計得出。由于不同大鼠BK誘發(fā)的TMUD有所不同,為了消除個體之間的差異,每只大鼠首次心包內(nèi)注射BK所誘發(fā)的TMUD被標(biāo)化為100%,作為基礎(chǔ)對照,其后續(xù)EMG的TMUD均以首次TMUD為分母進(jìn)行標(biāo)化,得出百分?jǐn)?shù),即EMG的變化率。

1.4　PAG電刺激

將動物頭部固定于大鼠腦立體定位儀上,行頂骨開顱術(shù)。同芯刺激電極(內(nèi)徑0.2 mm)經(jīng)大鼠腦立體定位儀推進(jìn)入PAG內(nèi),根據(jù)Paxinos and Watson大鼠腦圖譜[9]對PAG進(jìn)行腦立體定位,參數(shù)如下:前囟后7.5-8.5 mm,腦表面下5.5-6.5 mm,中線向右旁開0.5 mm。電刺激參數(shù):100、150和200 μA,100 Hz,0.1 ms陰極電流。對于電刺激+BK組,PAG電刺激10 s后,再進(jìn)行心包內(nèi)注射BK。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,通以30 μA、30 s陽極電流進(jìn)行電損毀,以標(biāo)記PAG內(nèi)電刺激位點(diǎn)。對中腦做40 μm的連續(xù)冰凍切片后,行尼氏染色,從組織學(xué)角度確認(rèn)電刺激位點(diǎn),只統(tǒng)計電刺激位點(diǎn)在PAG內(nèi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。將電刺激位點(diǎn)重建和標(biāo)記在Paxinos and Watson大鼠腦圖譜PAG橫切面上。

1.5　c-Fos免疫組織化學(xué)染色

免疫組化動物經(jīng)相應(yīng)處理后,暴露大鼠心臟,經(jīng)左心室升主動脈插管灌注固定。先用150 ml 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)快速灌流,繼之以約200 ml含30%飽和苦味酸和4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH 7.4)固定溶液快速灌注固定,然后再以同樣的固定液250 ml緩慢滴注,持續(xù)l.5-2 h。灌注完畢后取腦與T3-T5脊髓,置于上述新鮮固定液中后固定4 h(4 ℃)。繼之將上述組織轉(zhuǎn)入含30%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中(4 ℃)沉底后，冰凍切片,片厚30 μm。電刺激組腦片行尼氏染色,在顯微鏡下進(jìn)一步確定電刺激位點(diǎn)。T3-T5脊髓按照切片順序隔3取1,分兩組收集于含0.01 mol/L的PBS的洗片盒中備用。免疫組織化學(xué)ABC法兔抗鼠c-Fos抗體的工作濃度為1 ∶1 000。對照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗,其余步驟相同。用Olympus光學(xué)顯微鏡(BX51)照相,用軟件SPOT對切片進(jìn)行圖像采集,用Imag-Pro-Plus軟件計數(shù)。

1.6　統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各處理因素干預(yù)大鼠心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的變化率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用One-way ANOVA并LSD檢驗(yàn)進(jìn)行分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的變化

生理鹽水組大鼠背斜方肌均無EMG活動,BK組大鼠均有EMG反應(yīng)(見圖1A)。為了驗(yàn)證心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的EMG活動是否具有可靠的重復(fù)性,于6只大鼠間隔40 min心包內(nèi)連續(xù)5次注射BK。結(jié)果表明第2次至第5次心包內(nèi)BK所誘發(fā)的EMG與第1次BK注射所誘發(fā)的EMG活動(標(biāo)化為:100%)無明顯差別,分別為第1次的98.75%±0.75%、97.94%±0.56%、97.11%±0.52%、96.63%±0.68%。原始肌電實(shí)例見圖1B。

圖1　大鼠心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的EMG活動Figure 1　EMG responses of rats induced by intrapericardial bradykinin

2.2　電刺激PAG對心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG活動的影響

電刺激PAG強(qiáng)度依賴性地抑制心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的背斜方肌EMG活動(見圖2A),EMG分別下降至BK前對照的50.63%±1.52%、43.27%±1.99%和28.88%±0.97%。電刺激PAG的組織再建圖見圖2B

2.3　電刺激PAG對心包內(nèi)注射BK誘發(fā)脊髓背角c-Fos表達(dá)的影響

大鼠心包內(nèi)注射生理鹽水后,T3-T5脊髓背角Ⅰ-Ⅴ層有非常少量的c-Fos陽性表達(dá),數(shù)量為21.83±5.08,左右背角表達(dá)無明顯差別。相反,心包內(nèi)注射BK誘發(fā)了脊髓背角c-Fos的顯著表達(dá),數(shù)量為205.83±10.07(P<0.05)。然而當(dāng)150 μA電刺激PAG后,心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的脊髓背角c-Fos表達(dá)顯著減少,數(shù)量為93.33%±7.76%(P<0.05,見圖3)。

3　討論

脊髓以上中樞對脊髓背角傷害性信息的傳入具有下行性抑制調(diào)控作用。PAG是位于中腦頂蓋與被蓋之間由密度高的神經(jīng)細(xì)胞圍繞中腦水管構(gòu)成的一片環(huán)形區(qū)域,是中樞下行性抑制調(diào)控系統(tǒng)承上啟下的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[10,11]。研究表明電刺激或微量注射嗎啡于PAG可以引起顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[7,8,12],然而這些研究主要關(guān)注軀體痛覺,對內(nèi)臟痛覺尤其是心臟痛覺的研究甚少。這部分歸因于心臟痛覺模型建立困難。2001年,Jou等[1]建立了心包內(nèi)注射化學(xué)性致痛物制備心臟傷害性感受動物模型,該模型制備簡單,利用背斜方肌EMG作為痛反應(yīng)指標(biāo)易于檢測,為心臟痛覺的研究奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用心包內(nèi)注射BK制備心臟傷害性感受動物模型,結(jié)果表明電刺激PAG能夠抑制心包內(nèi)BK誘發(fā)的背斜方肌EMG活動,且呈強(qiáng)度依賴性效應(yīng),說明PAG對心臟傷害性感受具有下行性抑制調(diào)控作用。

圖2　電刺激PAG對心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的肌電活動Figure 2　Effects of electrical stimulation in PAG on the EMG response evoked by intrapericardial BK

A.生理鹽水組　　　　B. 緩激肽組　　 　　C. 電刺激+緩激肽組圖3　各組大鼠脊髓背角c-Fos的表達(dá) (×200)Figure 3　Expression of c-Fos in the spinal dorsal horn of rats in each group (×200)

c-Fos是原癌基因中的即刻早期基因產(chǎn)物。Hunt等[13]首先將原癌基因用于痛覺研究中,從此,觀察c-Fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的空間表達(dá)狀況成為探索傷害性感受神經(jīng)通路最常用的方法之一。神經(jīng)解剖學(xué)研究表明起源于心臟的交感傳入纖維,中樞突進(jìn)入T1-T4或T5節(jié)段后角和中間帶外側(cè)核,與脊髓上行通路的神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系[14]。因此,以上區(qū)域c-Fos表達(dá)的增加代表著該部位參與傷害性信息的傳遞或整合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,心包內(nèi)注射BK激活了心臟初級傳入纖維進(jìn)而導(dǎo)致T3-T5節(jié)段Ⅰ-Ⅴ層c-Fos表達(dá)增加，而電刺激激活PAG明顯抑制了c-Fos免疫樣反應(yīng),這與電刺激PAG抑制背斜方肌肌電活動的電生理結(jié)果相一致。兩種結(jié)果均支持激活PAG對心臟傷害性感受發(fā)揮下行性抑制調(diào)控作用。

PAG的細(xì)胞和神經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)都是異質(zhì)性的,其內(nèi)含有多種經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽,如阿片肽、5-羥色胺、γ-氨基丁酸、P物質(zhì)等。韓濟(jì)生[15]認(rèn)為PAG主要通過兩條下行通路對脊髓背角神經(jīng)元產(chǎn)生抑制調(diào)控作用,一條是PAG-RVM-脊髓背角;另一條是PAG-LRN-脊髓背角。我們前期研究已證實(shí),RVM對心包內(nèi)BK誘發(fā)的心臟傷害性感受產(chǎn)生抑制調(diào)控作用[16],同時,電刺激LRN抑制了心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的心臟傷害性感受[17]。那么,PAG對心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的心臟傷害性感受究竟通過何種下行通路發(fā)揮下行性抑制調(diào)控作用,有待下一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jou CJ,Farber JP,Qin C,etal.Intrapericardial algogenic chemicals evoke cardiac-somatic motor reflexes in rats[J]. Auton Neurosci, 2001, 94(1-2):52-61.

[2]韓曼,劉曉華,杜劍青.脊髓5-羥色胺受體參與延髓外側(cè)網(wǎng)狀核對大鼠心臟傷害性感受的下行性抑制調(diào)控[J].南方醫(yī)科大學(xué),2017,37(9):1190-1194.

[3]Liu XH, Zhang Q, Han M,etal. Intrapericardial capsaicin and bradykinin induce different cardiac-somatic and cardiovascular reflexes in rats[J]. Auton Neurosci, 2016, 198:28-32.

[4]韓曼,劉曉華,杜劍青.脊髓NK1受體與非NMDA受體對大鼠心臟-軀體運(yùn)動反射的調(diào)節(jié)作用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,34(12):1728-1732.

[5]韓濟(jì)生.疼痛學(xué)[M].北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2012:74-75.

[6]Millan MJ.Descending control of pain[J].Prog Neurobiol,2002,66(6):355-474.

[7]杜劍青,張?zhí)煜?程珍鳳.PAG電刺激和微注射嗎啡對脊髓WDR和NS神經(jīng)元放電的影響[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,21(1):9-12.

[8]王寧,張婷,蘇園林,等.中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)電刺激與丘腦電刺激對大鼠傷害感知行為[J].生理學(xué)報,2016,68(2):115-125.

[9]Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates[M]. 4nd edi. San Diego, CA:Academic Press,1998.

[10]Morgan MM. Differences in antinociception evoked from dorsal and ventral regions of the caudal periaquductal gray matter[M]//Depaulis A, Bandler R. The midbrain periaqueductal gray matter: functional, anatomical, and neurochemical organization. New York: Plenum Press, 1991: 139-150.

[11]Chen T, Li J, Feng B,etal. Mechanism underlying the analgesic effect exerted by endomorphin-1 in the rat ventrolateral periaqueductal gray[J]. Mol Neurobiol, 2015, 51(1):1-18.

[12]Lovick TA. Interactions between descending pathways from the dorsal and ventrolateral periaqueductal gray matter in the rat[M]//Depaulis A, Bandler R, editors. The midbrain periaqueductal gray matter: functional, anatomical, and neurochemical organization. New York: Plenum Press, 1991: 101-120.

[13]Hunt SP, Pini A, Evan G. Induction of c-fos-like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation[J]. Nature, 1987, 328(6131): 632-634.

[14]柏樹令.系統(tǒng)解剖學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:449-450.

[15]韓濟(jì)生.神經(jīng)科學(xué)[M].北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2009:657-658.

[16]Sun N, Liu XH, Du JQ,etal. Rostroventral medulla-mediated biphasic modulation of the rat cardiosomatic motor reflex[J]. Neuroscience, 2011, 185:174-182.

[17]韓曼,劉曉華,杜劍青.電刺激延髓外側(cè)網(wǎng)狀核對大鼠心臟-軀體運(yùn)動反射的下行性抑制作用及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2012,38(3):433-437.