程萬(wàn)靜，何滋林，李玉明，溫珊，高喜丹，尚博，高博，劉暢，華葉婧，柳雅玲，隋宏書★

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，山東 泰安；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山東 泰安）

0 引言

胚胎工程需要大量?jī)?yōu)質(zhì)的成熟卵母細(xì)胞，哺乳動(dòng)物出生后卵巢中的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂一般停滯在第一次減數(shù)分裂的雙線期，此時(shí)的細(xì)胞核又稱為生發(fā)泡（Germinal Vesicle，GV）[1]。性成熟后，黃體生成素（Luteinizing Hormone, LH）峰出現(xiàn)，卵母細(xì)胞開始恢復(fù)減數(shù)分裂，排出一個(gè)或多個(gè)卵母細(xì)胞[2]。目前胚胎工程獲得的成熟卵母細(xì)胞主要來源于未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)（In Vitro Maturation，IVM）[3]。卵母細(xì)胞的體外成熟是指將GV期或MI期的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)發(fā)育到第二次減數(shù)分裂中期 （MII期） 的過程[4]。有研究表明IVM的效率主要取決于卵母細(xì)胞自身的質(zhì)量，而不是體外培養(yǎng)體系[5]。因此如何篩選優(yōu)質(zhì)的未成熟卵母細(xì)胞，是提高IVM效率的關(guān)鍵。卵子發(fā)生過程中，卵母細(xì)胞通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程中生發(fā)泡染色質(zhì)構(gòu)型發(fā)生明顯的變化，這在許多動(dòng)物上均有報(bào)道[6]。已經(jīng)表明，一些動(dòng)物卵母細(xì)胞的生發(fā)泡（GV）染色質(zhì)構(gòu)型與卵母細(xì)胞發(fā)育能力相關(guān)[7]，所以卵母細(xì)胞GV染色質(zhì)構(gòu)型可能作為判定多種動(dòng)物卵母細(xì)胞質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。

目前關(guān)于牛[8]，羊[7]，豬[9]和小鼠[10]的GV染色質(zhì)構(gòu)型已經(jīng)有許多研究。然而與人類生殖生理學(xué)有更多相似的豚鼠[11]，GV染色質(zhì)構(gòu)型的系統(tǒng)研究未見報(bào)道。對(duì)于其他動(dòng)物的研究表明，隨著卵泡的生長(zhǎng)，卵母細(xì)胞逐漸獲得減數(shù)分裂潛能和發(fā)育能力，但是從相同大小卵泡中分離出來的卵母細(xì)胞仍然具有異質(zhì)性，這可能對(duì)減數(shù)分裂進(jìn)程，胞質(zhì)成熟和之后的發(fā)育能力有影響[12]。因此，在培養(yǎng)之前，清楚地描述卵巢卵母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點(diǎn)，從而獲得卵母細(xì)胞質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是極為重要的。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用Hoeehst33342對(duì)豚鼠生發(fā)泡期卵母細(xì)胞進(jìn)行染色。根據(jù)染色質(zhì)凝集的程度，把豚鼠卵母細(xì)胞GV染色質(zhì)分為3種。我們的研究發(fā)現(xiàn)GV染色質(zhì)構(gòu)型分為染色質(zhì)彌散型（NSN型）和凝集在核周圍型（SN-1型和SN-2型）。隨著卵泡的生長(zhǎng)，大多數(shù)動(dòng)物（除了山羊外），染色質(zhì)構(gòu)型都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，就是彌散的染色質(zhì)逐漸在核周圍凝集成環(huán)[13]。本實(shí)驗(yàn)研究了卵母細(xì)胞生長(zhǎng)成熟過程中染色質(zhì)構(gòu)型的變化，這有助于明確染色質(zhì)構(gòu)型與成熟能力的關(guān)系。對(duì)卵母細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)型變化的研究，有助于在細(xì)胞和分子水平揭示卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

白色 1月齡雌性清潔級(jí)豚鼠（Hartley），體重 200～250g，購(gòu)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物房保持12h光照-黑暗循環(huán)，通風(fēng)良好，室溫維持在23～26℃。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)等程序均嚴(yán)格遵守執(zhí)行國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》中的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)和倫理指南。

1.2 GV染色質(zhì)構(gòu)型的制備

將卵母細(xì)胞移到含有0.1%透明質(zhì)酸酶的M2液滴中，用自制玻璃毛細(xì)管脫去卵丘細(xì)胞。再將脫去卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞移到含有10ug/mL Hoechst33342的M2中，在37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育5分鐘。最后將卵母細(xì)胞放在載玻片上，用蓋玻片壓扁。先用相差顯微鏡觀察核仁和核膜的形態(tài)，然后用正置熒光顯微鏡觀察GV染色質(zhì)構(gòu)型。

1.3 卵母細(xì)胞體外成熟

IVM培養(yǎng)基是在TCM-199中添加10%（v/v）FCS和10IU/mL PMSG。將10-12個(gè)COCs放到100μl的微滴里，表面覆蓋石蠟油，培養(yǎng)在37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中。一部分在培養(yǎng)的0，2，4，6小時(shí)后，檢查IVM的COCs的GV染色質(zhì)構(gòu)型，另外一些COCs培養(yǎng)24小時(shí)后評(píng)估核成熟的能力。

1.4 體外成熟卵母細(xì)胞的收集

取1月齡性成熟前雌性豚鼠卵巢，用PBS清洗3遍。在體式顯微鏡下，用鑷子和手術(shù)刀剝除多余的脂肪，按卵泡直徑分為＜0.5mm，0.5-0.8mm和0.8-1.2mm三組。用注射器針頭將豚鼠卵巢不同直徑的卵泡刺破后釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus oocytes complexes, COCs），然后用自制玻璃毛細(xì)管在體視顯微鏡下收集形態(tài)完整的COCs。在M2液滴中洗3遍。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理均由SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)以（mean±SEM ）表示。多樣本間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多重比較使用LSD方法。如果數(shù)據(jù)不符合單因素方差分析的條件，則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 GV染色質(zhì)構(gòu)型的分類

Hoechst33342染色后，用相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察。根據(jù)染色質(zhì)凝集的程度和核仁核膜的消失，將豚鼠的卵母細(xì)胞GV染色質(zhì)構(gòu)型分為3種，分別是NSN型，SN-1型和SN-2型。NSN型為染色質(zhì)不包圍核仁,染色質(zhì)彌散分布在整個(gè)核漿區(qū)域（Fig.1A，B）；SN-1型為部分染色質(zhì)凝集在核仁周圍，部分染色質(zhì)彌散在核漿內(nèi)（Fig.1C，D）；SN-2型表現(xiàn)為染色質(zhì)全部呈塊狀凝集在核仁周圍（Fig.1E，F(xiàn)）。

圖1 豚鼠卵母細(xì)胞GV染色質(zhì)的構(gòu)型的分類

2.2 卵泡生長(zhǎng)過程中卵母細(xì)胞的GV染色質(zhì)構(gòu)型變化

表1可見，從不同直徑卵泡中獲取的卵母細(xì)胞GV染色質(zhì)構(gòu)型的變化。來源于直徑＜0.5mm卵泡的卵母細(xì)胞GV染色質(zhì)構(gòu)型全部為NSN型。隨著卵泡的生長(zhǎng)，NSN型的比例下降（P＜0.05），SN-2型的比例顯著增加（P＜0.05），而在直徑0.5-0.8mm和0.8-1.2mm卵泡中卵母細(xì)胞SN-1型百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 豚鼠不同直徑卵泡卵母細(xì)胞的GV染色質(zhì)構(gòu)型

2.3 豚鼠不同直徑卵母細(xì)胞的GV染色質(zhì)構(gòu)型

表2可見，豚鼠不同直徑卵母細(xì)胞的GV染色質(zhì)構(gòu)型。直徑為60-70μm組的卵母細(xì)胞GV染色質(zhì)構(gòu)型全部為NSN型。直徑70-79μm組的卵母細(xì)胞，NSN型比例降低，SN-1型和SN-2型百分比升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而直徑為80-89μm組的卵母細(xì)胞NSN型的比例降低（P＜0.05），SN-2型的比例顯著增加（P＜0.05）。

表2 豚鼠不同直徑卵母細(xì)胞的GV染色質(zhì)構(gòu)型

2.4 卵母細(xì)胞IVM過程中GV染色質(zhì)構(gòu)型的變化

在體外成熟過程中，從直徑在0.8-1.2mm的卵泡中獲取的卵母細(xì)胞，NSN型和SN-1型比例減少，而SN-2型和GVBD型比例增多（見表 3）。

表3 直徑0.8-1.2mm卵泡卵母細(xì)胞體外成熟過程中GV染色質(zhì)構(gòu)型的變化

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用Hoeehst33342對(duì)豚鼠生發(fā)泡期卵母細(xì)胞進(jìn)行染色。根據(jù)染色質(zhì)的凝集程度和分布情況將染色質(zhì)構(gòu)型分為3類：染色質(zhì)彌散型（NSN型）和凝集在核周圍型（SN-1型和SN-2型）。豚鼠卵母細(xì)胞環(huán)繞構(gòu)型（SN-2）與小鼠的SN染色質(zhì)構(gòu)型和人的GV3染色質(zhì)構(gòu)型相似。豚鼠卵母細(xì)胞部分環(huán)繞構(gòu)型（SN-2）和彌散構(gòu)型（NSN）的染色質(zhì)凝集狀態(tài)與小鼠[10]的pSN和 NSN構(gòu)型染色質(zhì)構(gòu)型類似，這兩種染色質(zhì)彌散分布于整個(gè)生發(fā)泡中，凝集程度較低。

已經(jīng)證實(shí)，在小鼠[10]、馬[14]、人[15]和猴子[16]中，染色質(zhì)環(huán)狀凝集在核仁周圍，代表了卵母細(xì)胞GV構(gòu)型傾向于排卵。我們研究豚鼠發(fā)現(xiàn)，隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟，SN-2構(gòu)型比例升高，而NSN型比例逐漸降低（表1）。這說明豚鼠卵母細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)型與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)成熟有關(guān)系，并且染色質(zhì)環(huán)狀凝集在核仁周圍的構(gòu)型，即SN-2型更傾向于成熟。

胚胎生物技術(shù)越來越需要體外成熟的卵母細(xì)胞。雖然已經(jīng)深入的研究，但是體外產(chǎn)生的可存活胚胎的效率依然遠(yuǎn)不及體內(nèi)產(chǎn)生的。目前體外產(chǎn)生胚胎的一個(gè)常見問題是卵母細(xì)胞胞質(zhì)不能充分成熟[17]。盡管研究已經(jīng)表明，隨著卵泡的生長(zhǎng)，逐漸獲得減數(shù)分裂能力和胚胎發(fā)育能力，但是從同樣大小卵泡中獲取的卵母細(xì)胞具有異質(zhì)性，這可能解釋了染色質(zhì)構(gòu)型不同的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程，胞質(zhì)成熟能力和胚胎發(fā)育能力的不同[18]。因此，在培養(yǎng)前先根據(jù)卵母細(xì)胞不同染色質(zhì)構(gòu)型，作為衡量卵母細(xì)胞質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是十分重要的。

總之，明確豚鼠卵母細(xì)胞生發(fā)泡染色質(zhì)構(gòu)型與體外成熟能力的關(guān)系，對(duì)于胚胎工程中，動(dòng)物卵母細(xì)胞IVM前篩選優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞是十分有價(jià)值的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。