李希寧，陳曉春，朱云飛，曹涇楠，鄒憶婷，杜　霄，王旗春

(湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，浙江 湖州 313000)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmennopausal osteoporosis,PMOP) 是一種與衰老有關(guān)的常見病，主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女[1]。PMOP核心發(fā)病機(jī)制為雌激素下降之后導(dǎo)致骨重建與骨吸收失衡，即成骨細(xì)胞的骨形成能力下降而破骨細(xì)胞的骨吸收能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加以及易于骨折[2-3]。因此，PMOP的防治已成為目前迫切需要解決的公共健康問題。目前PMOP發(fā)病機(jī)制研究主要集中在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能不平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)流失過多[4-6]，但成骨細(xì)胞功能減弱和破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)的誘導(dǎo)機(jī)制并未給予深入研究[7]。PERK是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上錯(cuò)誤或未折疊蛋白的聚集可引起PERK的活化,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的直接結(jié)果[8]。PERK基因敲除的小鼠中，成骨細(xì)胞的分化和成熟障礙并伴有Ⅰ型膠原(typeⅠcollogen，ColⅠ)分泌減少，導(dǎo)致骨骼發(fā)育受損，同時(shí)成骨細(xì)胞內(nèi)核心結(jié)合因子1(core-binding factor a1，cbfa1)和osterix的表達(dá)下調(diào)[9-10]，提示PERK很可能是一種新的調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和成骨細(xì)胞活動(dòng)的因子。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察PERK信號(hào)通路與成骨細(xì)胞分化和凋亡有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子和其他重要信息分子之間的聯(lián)系，探討PERK信號(hào)通路在PMOP發(fā)生時(shí)在成骨細(xì)胞凋亡和骨轉(zhuǎn)換加速中的作用，闡明PMOP的發(fā)生機(jī)制，為制定骨質(zhì)疏松的防治策略提供新的思路和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器雌性Wistar大鼠(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(浙)2012-0178。TRIzol試劑盒(Invitrogen公司,美國(guó))，High-Capacity cDNA ReverseTranscription Kit和Power SYBR○RGreen PCRMaster Mix(Applied Biosystems公司,美國(guó))，SMARTpool reagents Nrf2和Transfection Reagent(ThermoFisher公司,美國(guó))，Primary antibody(Santa Cruz公司,美國(guó))，RIPA裂解液(Transgen Biotech公司,中國(guó))。凝膠電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽(Bio-Rad公司，美國(guó))，PCR儀(ThermoFisher公司，美國(guó))。

1.2大鼠PMOP模型復(fù)制及實(shí)驗(yàn)分組雌性Wistar大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，分為3組，每組15只：① 正常對(duì)照組(大鼠不作處理)；② 骨質(zhì)疏松組(雌性大鼠卵巢摘除)；③ 骨質(zhì)疏松治療組(大鼠卵巢摘除后尾靜脈注射雌激素)。

1.3血液分析儀檢測(cè)大鼠血清中蛋白水平大鼠飼養(yǎng)3個(gè)月后，采用眼球摘除法取大鼠全血樣本，室溫靜置2 h，1 000 r·min-1離心5 min，取上層血清樣本，經(jīng)血液分析儀檢測(cè)各種大鼠血清中ColⅠ、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣素(osteoclcin,OCN)水平。

1.4RT-PCR法檢測(cè)大鼠骨組織中PERK、ATF4、Runx2、osterix、RANKL和OPG基因表達(dá)取大鼠股骨，經(jīng)液氮反復(fù)冷凍變脆敲碎，按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，并用Nano-Drop分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。按照High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit和Power SYBR○RGreen PCR Master Mix說明書合成cDNA和PCR擴(kuò)增，GAPDH 作為內(nèi)參。使用StepOnePlus system software導(dǎo)出Ct值，基因相對(duì)表達(dá)水平采用2-(△Ct)計(jì)算。

1.5Western blotting法檢測(cè)大鼠骨組織中PERK、ATF4、Runx2、osterix、RANKL和OPG蛋白表達(dá)取大鼠股骨，經(jīng)液氮反復(fù)冷凍變脆敲碎，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，每個(gè)泳道加入15 μg蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h后，分別加入稀釋后的抗小鼠一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h，ECL顯影，應(yīng)用Gel Image system-1600凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.6HE染色觀察骨組織形態(tài)學(xué)取大鼠股骨，4%多聚甲醛固定24 h，20%甲酸和15%乙二胺四乙酸脫鈣14 d，各級(jí)乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色觀察。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠血清中ColⅠ、ALP和OCN水平與對(duì)照組比較，骨質(zhì)疏松組大鼠血清中ColⅠ、ALP和OCN水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與骨質(zhì)疏松組比較，骨質(zhì)疏松治療組大鼠血清ColⅠ、ALP和OCN水平明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1各組大鼠血清ColⅠ、ALP和OCN水平

Tab.1Levels of serum ColⅠ，ALP and OCN of rats in various groups

GroupColⅠALPOCNControl10．16±1．567．83±1．748．77±2．96Osteoporosis4．99±1．62??3．01±1．24?2．06±0．37??Osteoporosis　treatment9．02±2．13△7．50±1．38△8．45±1．37△

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.01 compared with osteoporosis group.

2.2各組大鼠骨組織中PERK、ATF4、Runx2、osterix、RANKL和OPG基因表達(dá)水平與對(duì)照組比較，骨質(zhì)疏松組大鼠骨組織中PERK和ATF4基因表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2和osterix基因表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化促進(jìn)骨質(zhì)吸收因子RANKL基因表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與骨質(zhì)疏松組比較，骨質(zhì)疏松治療組骨組織中PERK、ATF4、Runx2和osterix基因表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而RANKL表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)。見表2。

2.3各組大鼠骨組織中PERK、ATF4、Runx2、osterix、RANKL和OPG蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，骨質(zhì)疏松組大鼠骨組織中PERK、Runx2和osterix蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，ATF4和RANKL蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與骨質(zhì)疏松組比較，骨質(zhì)疏松治療組大鼠骨組織中PERK和Runx2蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而RANKL蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見圖1和表3。

表2各組大鼠骨組織中成骨標(biāo)志物基因表達(dá)水平

GroupPERKATF4Runx2osterixRANKLOPGControl3．24±2．136．12±1．654．17±0．748．65±2．955．87±1．856．10±0．98Osteoporosis0．80±1．62??2．51±1．40?1．66±0．48??1．72±1．56??14．62±3．01??4．74±1．52Osteoporosistreatment3．65±2．68△△6．01±0．37△△3．82±1．17△7．41±2．51△△6．37±1．74△△5．89±2．09

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with osteoporosis group.

Lane 1: Control group; Lane 2: Osteoporosis treatment group; Lane 3: Osteoporosis group.

圖1各組大鼠骨組織中成骨標(biāo)志物蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1Electrophoregram of protein expressions of osteogenic markers in bone tissue of rats in various groups

2.4各組大鼠骨組織形態(tài)表現(xiàn)與對(duì)照組比較，骨質(zhì)疏松組大鼠股骨骨干中破骨細(xì)胞數(shù)量增多，功能活躍，骨干中出現(xiàn)多個(gè)骨質(zhì)吸收形成的骨陷窩；與骨質(zhì)疏松組比較，骨質(zhì)疏松治療組大鼠股骨骨干結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，破骨細(xì)胞功能減弱，骨質(zhì)吸收陷窩消失。見圖2(插頁四)。

3　討　論

PMOP的核心發(fā)病機(jī)制為雌激素下降后導(dǎo)致骨重建與骨吸收失衡[11]。目前對(duì)于PMOP發(fā)病機(jī)制的研究[12]主要集中在成骨細(xì)胞的活性下降和破骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)，但內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制尚缺乏研究。本研究通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討PMOP發(fā)生時(shí)分子水平調(diào)控機(jī)制的異常改變，為PMOP的防治提供新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

表3各組大鼠骨組織中成骨標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平

GroupPERKATF4Runx2OsterixRANKLOPGControl0．87±0．541．24±0．651．17±0．740．25±0．130．07±0．030．40±0．74Osteoporosis0．06±0．02??1．51±0．34?0．66±0．13??0．72±0．39??0．69±0．49??0．54±0．22Osteoporosistreatment0．38±0．15△△1．61±0．571．12±0．68△0．96±0．51△△0．15±0．38△△0．49±0．09

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with osteoporosis group.

正常情況下，骨骼的結(jié)構(gòu)完整和功能保持取決于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞協(xié)同作用，維持骨重建與骨吸收的平衡[13]。成骨細(xì)胞作為骨形成的主要功能細(xì)胞，在分化成熟過程中會(huì)逐步表達(dá)特異性標(biāo)志物，如ALP、OCN和ColⅠ等[14-15]。同時(shí)，在此過程中也會(huì)受到一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Runx2、Osterix/Sp7、β-catenin、ATF4、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1和Smads 等[16-17]，它們彼此協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化及骨形成。成骨細(xì)胞功能下降，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)錄因子和成骨因子表達(dá)減少，是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松形成的主要因素。PERK基因敲除的小鼠中，成骨細(xì)胞分化和成熟障礙，并伴有ColⅠ分泌減少，導(dǎo)致骨骼發(fā)育受損。ATF4是PERK通路下游靶分子，同時(shí)也是較早受到關(guān)注的與成骨細(xì)胞分化和骨形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[18]。ATF4可協(xié)同cbfa1刺激成骨細(xì)胞內(nèi)OCN的表達(dá)，提示ATF4在成骨細(xì)胞分化、成熟和骨骼發(fā)育中有重要作用[18]。研究[19]顯示：體外培養(yǎng)功能活躍的成骨細(xì)胞中BiP和PDI表達(dá)水平明顯升高，而骨質(zhì)疏松癥患者功能不活躍的成骨細(xì)胞中BiP和PDI表達(dá)水平明顯下降，由此推測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激很可能刺激成骨細(xì)胞的成骨作用。

本研究結(jié)果顯示：雌性大鼠卵巢切除后，PERK和ATF4表達(dá)水平明顯降低，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2和osterix表達(dá)水平明顯降低，而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化促進(jìn)骨質(zhì)吸收的因子RANKL表達(dá)明顯升高，提示雌性大鼠卵巢切除后成骨細(xì)胞分化功能減弱而破骨細(xì)胞成熟增強(qiáng)引起骨質(zhì)吸收增強(qiáng)導(dǎo)致出現(xiàn)PMOP，通過外源補(bǔ)充雌激素能有效緩解此種癥狀。本研究結(jié)果為PMOP發(fā)生機(jī)制研究提供了科學(xué)依據(jù)，為制定骨質(zhì)疏松的防治策略提供了新的思路和理論依據(jù)。

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