馬鴻云，莊新明，許維國(guó)，劉　一

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院脊柱外科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所 中科院生態(tài)環(huán)境高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130022)

乳腺癌是目前世界上最常見的女性惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。有資料[2]顯示：中國(guó)乳腺癌發(fā)病率占全球發(fā)病率的12.2%，死亡率占全球的9.6%。乳腺癌惡性程度高，極具侵襲性，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]，特別是骨轉(zhuǎn)移，可造成骨骼肌肉組織持續(xù)丟失[4]，引起疼痛、病理性骨折及關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等一系列繼發(fā)癥狀。病程晚期患者往往喪失自理能力，生活質(zhì)量差，存活率低。因此，找到一種更為安全有效的治療方法是臨床亟待解決的難題之一，并已經(jīng)成為治療晚期乳腺癌的迫切需要。

目前臨床上尚缺乏有效的乳腺癌治療措施，其主要的治療手段包括病灶廣泛切除、內(nèi)分泌治療、雙膦酸鹽治療、放射治療和化學(xué)治療等[5]。其中，化學(xué)治療起著十分重要的作用，但由于其嚴(yán)重的不良反應(yīng)和耐藥性的發(fā)生，臨床應(yīng)用受到很大限制。為了改善目前的情況，研究者[6]開發(fā)了多種聚合物納米顆粒來作為藥物運(yùn)載體，并利用其靶向性、刺激反應(yīng)釋放等優(yōu)點(diǎn)，有效提高了乳腺癌的治療效果。目前，聚合物納米粒子治療乳腺癌等惡性腫瘤的研究[7-8]已有報(bào)道。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)具有CD44受體靶向性[9-11]，可以積累聚集于乳腺癌組織中，增加局部藥物水平，提高抗腫瘤效率。本研究以HA為原料合成靶向納米粒子，旨在通過研究HA納米粒子對(duì)小鼠4T1乳腺癌的抑制、體內(nèi)代謝及微觀病理的影響，探討其對(duì)4T1腫瘤的殺傷作用及其生物安全性，為HA納米粒子在乳腺癌治療方面的應(yīng)用提供依據(jù)。由于乳腺癌具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，晚期常發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，本研究目前僅為前期研究，后續(xù)將會(huì)進(jìn)一步探討搭載阿霉素(doxorubicin，DOX)和順鉑(cisplatin，CDDP)的HA納米粒子HACDDP-DOX在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器4～5周的雌性BALB/c小鼠(長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2016-0008。實(shí)驗(yàn)用4T1乳腺癌細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，上海)。HA(相對(duì)分子質(zhì)量為100 000，華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司)，鹽酸阿霉素(北京華豐聯(lián)博科技有限公司)，CDDP(山東鉑源制藥有限公司)，青霉素和鏈霉素(華北制藥股份有限公司)，抗增殖細(xì)胞蛋白Ki-67抗體(Ki-67，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，上海)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3，美國(guó)艾碧康生物有限公司)。Milli-Q水凈化設(shè)備(美國(guó)密理博有限公司)，Uv-Vis型分光光度計(jì)(日本島津)，透射電子顯微鏡(TEM，日本電子株式會(huì)社)，動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS，美國(guó)Wyatt公司)，光學(xué)顯微鏡(日本尼康顯微鏡光學(xué)儀器公司)，激光共聚焦顯微鏡LSM 780(德國(guó)蔡司公司)，體內(nèi)熒光成像儀(美國(guó)Cambridge研究和儀器公司)。

1.2HACDDP-DOX的綠色合成和粒徑測(cè)量綠色合成是指采用無毒、無害的原料、催化劑和溶劑，選擇具有高選擇性、高轉(zhuǎn)化率，不生產(chǎn)或少生產(chǎn)對(duì)環(huán)境有害的副產(chǎn)品合成，其目的是從根本上消除或減少環(huán)境污染[12]。本研究中HACDDP-DOX納米粒子合成過程以水作為溶劑，無毒性原料和催化劑參與，降低了納米粒子的有機(jī)毒性。具體合成過程如下：稱取300 mg HA，溶于50 mL去離子水中，攪拌10 min。然后稱取30 mg DOX溶解于5 mL去離子水中，待溶解充分，逐滴加入HA溶液中(3～4滴·min-1)，攪拌過夜。隨后，將一定量的CDDP溶液逐滴加入到上述體系，37℃攪拌72 h。通過透析法[截留相對(duì)分子質(zhì)量(MWCO)3 500]透析24 h去除額外游離的藥物，最后將溶液凍干，得到HACDDP-DOX粉末[13]。所有過程均需避光處理。DOX和CDDP的載藥量(DLC)和載藥率(DLE)通過紫外光譜法和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測(cè)定。DLC和DLE通過以下公式計(jì)算[14]：DLC=納米粒子負(fù)載藥物的質(zhì)量/載藥納米粒子的質(zhì)量×100%,DLE=納米粒子負(fù)載藥物的質(zhì)量/總投入藥的質(zhì)量×100%。

納米粒子的粒徑通過TEM和DLS測(cè)定。TEM測(cè)試：將10.0 μL濃度為0.1 g·L-1的載藥納米粒子溶液滴到銅網(wǎng)上，室溫下干燥，將樣品置于TEM下觀察，測(cè)試電壓100 kV。DLS測(cè)試：將載藥納米粒子溶于pH值為7.4的PBS溶液中，利用Wyatt QELS裝置在25℃下測(cè)定。

1.3體外釋放實(shí)驗(yàn)載藥納米粒子的釋放表現(xiàn)在PBS中進(jìn)行，將1.0 mg的HACDDP-DOX分別溶解于10 mL pH值分別為5.5、6.8和7.4的PBS中，將溶液轉(zhuǎn)移到MWCO 3 500的透析袋中,然后將透析袋放入盛有100.0 mL不同pH值的PBS的燒杯中，放入37℃震蕩恒溫箱中恒溫震蕩，模擬體內(nèi)藥物釋放環(huán)境。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)取出2.0 mL釋放液，再補(bǔ)充加入2.0 mL PBS。利用UV-Vis分光光度計(jì)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定DOX的釋放量。

1.4HACDDP-DOX穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將0.5 mg的HACDDP-DOX分別溶解于5 mL pH值分別為5.5、6.8和7.4的PBS中配制成0.1 g·L-1溶液。再將溶液轉(zhuǎn)移到DLS樣品瓶中，分別在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)用Wyatt QELS裝置檢測(cè)其粒徑隨時(shí)間的變化。

1.5HACDDP-DOX體內(nèi)腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)選取4～5周的雌性BALB/c小鼠，所有小鼠的飼養(yǎng)過程符合吉林大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的相關(guān)制度。將2.0×106個(gè)4T1細(xì)胞懸浮于100.0 μL PBS后，原位注射到BALB/c小鼠的第2對(duì)乳房脂肪墊以建立小鼠4T1乳腺癌模型。當(dāng)腫瘤體積增大至約80 mm3時(shí)將小鼠隨機(jī)平均分成3組(n=8)，分別用DOX濃度相同粒徑為(80.0±17.4) nm的HACDDP-DOX納米粒子、游離DOX/CDDP以及作為對(duì)照組的PBS通過尾靜脈注射進(jìn)行治療；DOX濃度相同，均為5 mg·kg-1，每4 d治療1次，共治療3次。治療前一天開始，每天測(cè)量小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積，共持續(xù)13 d。腫瘤體積采用以下公式計(jì)算[15]：V=(L×S2)/2。其中，L和S(mm)分別為腫瘤的最大和最小直徑，實(shí)驗(yàn)利用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量。

1.6病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)在最后一次治療后第3天，分別收集小鼠體內(nèi)的腫瘤組織和主要器官(心、肝、脾、肺和腎)。經(jīng)過固定、切片和染色后用光學(xué)顯微鏡觀察切片，確定腫瘤大小和臟器損傷情況，以分析納米粒子在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制情況和生物安全性。HE染色評(píng)估臟器損傷情況及腫瘤抑制情況。腫瘤空白片進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)Ki-67表達(dá)情況，以反映腫瘤組織增殖情況；檢測(cè)Caspase-3水平以反映腫瘤組織凋亡情況。腫瘤免疫熒光通過激光共聚焦顯微鏡成像、觀察，并采用Image J 1.8.0 軟件進(jìn)行半定量分析。

2　結(jié)　果

2.1HACDDP-DOX納米粒子的特征HA中的羧基可為DOX與CDDP通過靜電和金屬螯合作用提供結(jié)合位點(diǎn)，使得HA能夠相互交聯(lián)形成聚合物納米粒子，增加DOX的載藥效率，DOX的DLC和DLE分別為5.4%和52.3%。HACDDP-DOX納米粒子的TEM和DLS檢測(cè)結(jié)果顯示：HACDDP-DOX納米粒子粒徑(Dh：流體力學(xué)直徑)分布均勻，為(80.0±17.4)nm(圖1A)。HACDDP-DOX穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：HACDDP-DOX可以在pH值為7.4環(huán)境中保持較長(zhǎng)時(shí)間(>3 d)的穩(wěn)定性，而在pH值為6.8和5.5酸性環(huán)境中粒徑增大、膨脹和裂解(圖1B和C)。HACDDP-DOX在pH值為6.8和5.5條件下較pH值為7.4環(huán)境下更易釋放DOX(圖1D)。

A: Typical TEM micrograph of HACDDP-DOX nanoparticles(The insets showed the Dh value); B:Stability of HACDDP-DOX nanoparticles in different pH buffers over time; C: Dh values of HACDDP-DOX nanoparticles in different pH buffers at 48 h; D:Release behavior of DOX from HACDDP-DOX nanoparticles in different pH PBS.*P<0.05,**P<0.01 compared with pH 7.4 group.

圖1HACDDP-DOX納米粒子的特征

Fig.1Characteristics of HACDDP-DOX nanoparticles

2.2各組小鼠的腫瘤體積和體質(zhì)量以小鼠乳腺癌(4T1)腫瘤為模型，通過腫瘤體積測(cè)量觀察HACDDP-DOX的抑瘤效果。與對(duì)照組比較，在13 d的治療期內(nèi)HACDDP-DOX組4T1腫瘤體積的抑制效果最好(P<0.01)，其次是DOX/CDDP(P<0.01)。DOX制劑對(duì)4T1腫瘤體積的抑制具有以下順序：HACDDP-DOX > DOX/CDDP(P<0.05)。與對(duì)照組比較，DOX/CDDP組小鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.01);HACDDP-DOX組小鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)，但小于DOX/CDDP組。見圖2(插頁(yè)三)和圖3。

2.3各組小鼠病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)和體內(nèi)代謝對(duì)照組小鼠肝臟中央靜脈旁有腫瘤轉(zhuǎn)移灶，且對(duì)照組和DOX/CDDP組小鼠肺泡間隔明顯增寬，而HACDDP-DOX組小鼠未出現(xiàn)上述情況(圖4，見插頁(yè)三)。腫瘤的病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：HACDDP-DOX組和DOX/CDDP組腫瘤組織均有壞死，HACDDP-DOX組腫瘤組織壞死程度明顯重于DOX/CDDP組。腫瘤免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：與DOX/CDDP組比較，HACDDP-DOX組Caspase-3熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而Ki-67熒光減弱，半定量結(jié)果表明：Caspase-3活性明顯升高(P<0.01)，而Ki-67活性明顯下降(P<0.01)。見圖5(插頁(yè)三)和圖6。生物熒光成像進(jìn)一步分析在注射藥物不同時(shí)間(2、6和12 h)后DOX在體內(nèi)臟器的組織分布情況發(fā)現(xiàn)：隨著時(shí)間推移，DOX可有效聚集于乳腺癌腫瘤部位，而非體內(nèi)正常器官。見圖7(插頁(yè)四)。

A:Tumor volume; B: Body weight.*P<0.01 compared with control group；△P<0.05 compared with DOX/CDDP group.

圖3各組小鼠腫瘤體積和體質(zhì)量

Fig.3Tumor volumes and body weights of mice in various groups

3　討　論

近年來，隨著納米醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，納米技術(shù)

*P<0.01 compared with control group.

圖6各組小鼠乳腺癌組織中Caspase-3(A)和Ki-67(B)的表達(dá)

Fig.6Expression levels of Caspase-3(A) and Ki-67(B) in breast cancer tissue of mice in various groups

已經(jīng)成為21世紀(jì)的關(guān)鍵技術(shù)之一，推動(dòng)了多個(gè)研究領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，特別是癌癥精準(zhǔn)治療領(lǐng)域。HA具有較好的生物相容性和CD44受體靶[9-11]向性，可以積累聚集于CD44受體過表達(dá)的乳腺癌等腫瘤組織中，靶向釋放化療藥物，提高抗腫瘤效率。本研究選擇以HA作為原料通過綠色合成途徑合成載藥納米粒子HACDDP-DOX，并通過荷瘤小鼠尾靜脈注射HACDDP-DOX以驗(yàn)證、探討其對(duì)4T1乳腺癌的靶向抑制作用。

與傳統(tǒng)化療藥物比較，聚合物納米粒子負(fù)載的抗腫瘤藥物具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：①刺激反應(yīng)釋放；②聯(lián)合、協(xié)同治療[16]；③跨越生物屏障[17]；④靶向治療[18]；⑤增強(qiáng)腫瘤積累；⑥延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間等。HACDDP-DOX納米粒子可以通過CD44受體靶向性積累于腫瘤組織中，并在腫瘤等酸性條件下刺激反應(yīng)性釋放搭載藥物，增強(qiáng)治療效果。通過體內(nèi)生物熒光成像分析HACDDP-DOX經(jīng)由尾靜脈注入體內(nèi)2、6和12 h后DOX的分布情況顯示：隨著時(shí)間延長(zhǎng)，HACDDP-DOX在乳腺腫瘤組織中聚集增多，這可能是由于藥物載體與腫瘤表面CD44受體的主動(dòng)靶向作用，而這也是其靶向性的藥理學(xué)基礎(chǔ)。此外，HACDDP-DOX組肝臟熒光強(qiáng)度在注射后2和6 h較高，提示肝臟為其主要代謝器官，納米粒子可被Kupffer吞噬細(xì)胞吞噬清除。體外釋放實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證實(shí)：HACDDP-DOX能夠在腫瘤等酸性條件下膨脹、裂解，響應(yīng)性釋放DOX，這也進(jìn)一步為其提高抗腫瘤效果提供了理論基礎(chǔ)。

本研究中小鼠乳腺癌抑制曲線和體質(zhì)量變化曲線結(jié)果顯示：HACDDP-DOX納米粒子對(duì)4T1乳腺癌的抑制效果最好。與對(duì)照組比較，DOX/CDDP組小鼠體質(zhì)量明顯下降，腫瘤體積明顯縮小；HACDDP-DOX組小鼠體質(zhì)量也減輕，但小于DOX/CDDP組。上述結(jié)果表明相對(duì)于DOX/CDDP來說，天然高分子納米化可以明顯減小游離化療藥物的系統(tǒng)毒性，提高其安全性。DOX和CDDP作為傳統(tǒng)化療藥物可引起包括消化道反應(yīng)、骨髓抑制和肝腎功能損害等在內(nèi)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，且長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致腫瘤耐藥性的出現(xiàn)[19-21]。本文作者通過HE染色對(duì)體內(nèi)主要臟器和腫瘤組織進(jìn)行了病理學(xué)分析，進(jìn)一步證實(shí)了HACDDP-DOX納米粒子的生物安全性，可有效降低化療藥物對(duì)肝臟、肺臟等主要臟器的損傷。4T1腫瘤是一種高轉(zhuǎn)移性腫瘤[22]，腫瘤病理學(xué)分析顯示：HACDDP-DOX納米粒子能夠引起腫瘤組織壞死，同時(shí)有效抑制4T1腫瘤的轉(zhuǎn)移。Ki-67是在細(xì)胞G1、S、G2和M期出現(xiàn)的核抗原，由于其半衰期短，因此可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性。本研究免疫熒光染色顯示：應(yīng)用HACDDP-DOX納米粒子后，腫瘤Ki-67活性明顯下降，說明腫瘤增殖受到抑制。此外，免疫熒光染色還顯示HACDDP-DOX組Caspase-3活性明顯升高，且Caspase-3在凋亡早期階段即被激活，并裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，執(zhí)行凋亡功能[23]，說明HACDDP-DOX誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，HACDDP-DOX納米粒子可以有效靶向于4T1乳腺癌，在降低化療藥物系統(tǒng)毒性的同時(shí)增加腫瘤局部的藥物水平，明顯抑制乳腺癌生長(zhǎng)。本研究雖然證實(shí)HACDDP-DOX納米粒子能夠靶向積累于腫瘤組織，但未對(duì)其在體內(nèi)的代謝進(jìn)行定量分析，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用及細(xì)胞內(nèi)代謝分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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