張艷霞，李躍輝，張麗紅，張年萍，閆燕艷，楊小會(huì)，馮湘玲

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西 大同037009； 2.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，湖南 長沙410078；3.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長沙410078)

同源盒 (homeobox,HOX)基因最初是在研究果蠅的胚胎發(fā)育調(diào)控過程中被發(fā)現(xiàn)，是形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化和維持成體細(xì)胞穩(wěn)定的主要調(diào)節(jié)基因，其絕大多數(shù)分散在整個(gè)基因組，只有39個(gè)HOX基因，即HOX基因家族，有序地排列在特定的染色體上[1]。越來越多的研究顯示：HOX基因表達(dá)改變與多種實(shí)體腫瘤密切相關(guān)，如肺癌[2]、乳腺癌[3]和口腔癌[4]等。Cillo等[5]研究發(fā)現(xiàn)：HOXA13在肝癌樣本中高表達(dá)，而在相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中低表達(dá)，但對(duì)于HOXA13在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用目前少有報(bào)道。本研究采取RNA干擾技術(shù)，使HOXA13基因在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，進(jìn)而從基因水平研究HOXA13對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑人肝癌細(xì)胞株HepG2和 QGY-7703購自中南大學(xué)細(xì)胞中心。plent-U6-GFP載體(山東維真生物技術(shù)有限公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，嘌呤霉素(研科生物試劑公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，細(xì)胞培養(yǎng)板、MTT和DMSO(北京鼎國昌盛技術(shù)有限責(zé)任公司)，Lipofectamine 2000 Reagent(上海英維捷基貿(mào)易有限公司)，Giemsa染料和碘化丙啶(PI)(美國Sigma公司)。

1.2plent-U6-GFP/si-HOXA13重組載體構(gòu)建從GenBank中提取HOXA13基因序列 (序列號(hào)：NM_000522 )，設(shè)計(jì)、合成HOXA13基因的干擾序列

5′-CAGAATCGTATTGGTTACA-3′，并定向克隆入plent-U6-GFP載體，構(gòu)建plent-U6-GFP/si-HOXA13重組載體，并以空載體plent-U6-GFP為對(duì)照。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將HepG2和QGY-7703細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板；第2天轉(zhuǎn)染，具體操作方法參照脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)產(chǎn)品說明書。A液制備：分別取2 μL Lipofectamine 2000與48 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱放置5 min；B液制備：分別取1 μg重組質(zhì)粒plent-U6-GFP/si-HOXA13和1 μg對(duì)照質(zhì)粒plent-U6-GFP與49 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱放置5 min；將A液和B液混勻，靜置25 min；將待轉(zhuǎn)染的HepG2和QGY-7703細(xì)胞用D-Hank’s液洗1次，然后加入450 μL無血清RPMI-1640，再分別將上述A 液和B液混合溶液加至板中，混勻后培養(yǎng)4～6 h；換新鮮的無抗生素的RPMI-1640，48 h后傳代，然后加含1 mg·L-1嘌呤霉素的RPMI-1640篩選陽性克隆。

1.4RT-PCR法鑒定HOXA13干擾效果按 FERMENTAS產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：取細(xì)胞總RNA 2 μg，加Oligo(dt)18引物1 μL，加無Rnase的去離子水12 μL，輕輕混勻后，70℃、5 min；迅速將取出的PCR管放于冰上冷卻，再加入5×Reaction buffer 4 μL，Ribonuclease inhibitor 1 μL和dNTP mix 2 μL，輕輕混勻后，70℃、5 min；再加1 μL RevertAidTMM-MuLV Reverse transcriptase，輕輕混勻，42℃、 60 min，70℃ 、10 min，反應(yīng)終止后進(jìn)行PCR。PCR條件：95℃ 、1 min預(yù)變性；95℃、30 s，60℃、30 s，68℃、90 s，循環(huán)28次；68℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1% Agaross凝膠(含0.8%Goldview)電泳進(jìn)行鑒定。人HOXA13引物：正向引物5′-GGCCTTACCACCACCATCAG-3′，反向引物5′-TGGCGTATTCCCGTTCAAGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為315 bp。GAPDH 引物：正向引物5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，反向引物5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為580 bp。

1.5Western blotting法鑒定HOXA13干擾效果分別制備5%的濃縮膠和10%的分離膠；樣品制備：分別取50 μg蛋白樣品，加5%的巰基乙醇，在100℃下煮沸5 min；電泳：先在70 V電壓下電泳約30 min，然后在100 V電壓下電泳約2 h；轉(zhuǎn)膜：分別將濾紙、SDS-PAGE膠、轉(zhuǎn)印膜、濾紙按負(fù)極到正極的順序放置在轉(zhuǎn)膜裝置上，100 mA轉(zhuǎn)膜2 h；抗體孵育：將轉(zhuǎn)印后的轉(zhuǎn)印膜置于封閉液中，4℃過夜。將轉(zhuǎn)印膜取出，放于含1∶400稀釋的Rabbit Anti-Human HOXA13的抗體溶液中，置于恒溫?fù)u床上反應(yīng)2 h，將膜取出漂洗3次， 每次3～5 min，再加1∶3 000稀釋的Mouse Anti-Rabbit IgG-HRP的抗體溶液中，置于恒溫?fù)u床上反應(yīng) 1 h ；PBST漂洗3次，每次3～5 min；暗室內(nèi)進(jìn)行曝光、顯影和定影；膠片掃描。

1.6實(shí)驗(yàn)分組以HOXA13基因沉默的HepG2和 QGY-7703細(xì)胞(HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13)為實(shí)驗(yàn)組，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HepG2和 QGY-7703細(xì)胞(HepG2/C和QGY-7703/C)為對(duì)照組。

1.7MTT法檢測細(xì)胞生長速度各組細(xì)胞均按5×103/孔的數(shù)量分別接種于96孔板，然后在培養(yǎng)箱中放置24 h；分別加MTT(終濃度為5 g·L-1)，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸盡上層液體，再分別加入200 μL DMSO，約8 min后，酶標(biāo)儀490 nm處測吸光度(A)值。以A值為縱軸，時(shí)間為橫軸繪制HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C細(xì)胞生長曲線圖，比較2組細(xì)胞的生長速度。

1.8細(xì)胞倍增時(shí)間檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞以1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板，第2天收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。按以下計(jì)算公式計(jì)算HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C細(xì)胞的平均倍增時(shí)間：TD=t[lg2/(lgNt1-lgN0)](TD為細(xì)胞倍增時(shí)間，t為培養(yǎng)時(shí)間，N0、Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時(shí)后的細(xì)胞數(shù))。

1.9平板克隆形成能力檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞均按1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，在培養(yǎng)箱中放置2～3周；終止培養(yǎng)后，甲醇固定15 min；Giemsa染色15 min，洗去染色液，空氣風(fēng)干；計(jì)算克隆數(shù)(多于50個(gè)細(xì)胞者為1個(gè)克隆)。

1.10細(xì)胞周期檢測將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞以5×104個(gè)接種于培養(yǎng)瓶，24 h后，用不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；再換完全培基，第2天收集細(xì)胞，用D-Hank’s液將細(xì)胞漂洗2次，PI染色25～35 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布情況。

2　結(jié)　果

2.1沉默HOXA13基因細(xì)胞系的構(gòu)建分別將重組質(zhì)粒plent-U6-GFP/si-HOXA13和對(duì)照質(zhì)粒plent-U6-GFP用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HepG2和 QGY-7703細(xì)胞，經(jīng)2 mg·L-1嘌呤霉素篩選約14 d，挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，首先采用RT-PCR法分別檢測HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13、HepG2/plent-U6-GFP、QGY-7703/ plent-U6-GFP/si-HOXA13和QGY-7703/ plent-U6-GFP細(xì)胞中的HOXA13 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13和QGY-7703/plent-U6-GFP/si-HOXA13細(xì)胞中HOXA13 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而對(duì)照組HepG2/plent-U6-GFP和QGY-7703/plent-U6-GFP細(xì)胞HOXA13 mRNA水平明顯無變化(圖1 A和B)，分別將HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13、QGY-7703/plent-U6-GFP/si-HOXA13、HepG2/ plent-U6-GFP和QGY-7703/ plent-U6-GFP細(xì)胞系命名為HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C。進(jìn)一步采用Western blotting法分別檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C細(xì)胞中HOXA13蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13細(xì)胞中HOXA13蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(圖1 C和D)，結(jié)果與RT-PCR法檢測結(jié)果一致。說明沉默HOXA13細(xì)胞系建立成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Lane 1:HepG2/C cells; Lane 2:HepG2/si-HOXA13 cells; Lane 3:QGY-7703/C cells: Lane 4:QGY-7703/si- HOXA13 cells.

圖1RT-PCR (A,B) 和Western blotting (C,D)法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染plent-U6-GFP/si-HOXA13和plent-U6-GFP細(xì)胞中HOXA13表達(dá)電泳圖

Fig.1Electrophoregram of expressions of HOXA13 in cells transfected with plent-U6-GFP/si-HOXA13 and plent-U6-GFP detected by RT-PCR(A,B) and Western blotting(C,D) methods

2.22組細(xì)胞生長曲線與對(duì)照組HepG2/C和QGY-7703/C細(xì)胞比較，實(shí)驗(yàn)組HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13細(xì)胞的生長速度明顯下降。見圖2。

圖2MTT法檢測2組HepG2(A) 與QGY-7703 (B) 細(xì)胞的生長曲線

Fig.2Growth curves of HepG2(A) and QGY-7703(B) cells in two groups detected by MTT method

2.32組細(xì)胞倍增時(shí)間HepG2/C和HepG2/si-HOXA13細(xì)胞平均倍增時(shí)間分別為(4.59±0.27)和(6.02±0.86 )h；QGY-7703/C和QGY-7703/si-HOXA13細(xì)胞平均倍增時(shí)間分別為(4.93±0.17)和(6.43±0.66)h；實(shí)驗(yàn)組HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13細(xì)胞的平均倍增時(shí)間明顯延長，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.42組細(xì)胞克隆形成數(shù)HepG2/C和HepG2/si-HOXA13細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為(264.00±12.62)和(165.00 ±10.61)個(gè)；QGY-7703/C和QGY-7703/si-HOXA13細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為(269.00±4.43)和(215.00±4.50)個(gè)；實(shí)驗(yàn)組HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。見圖3。

2.52組細(xì)胞周期的分布HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞比例分別是(59.90±3.10)%和(55.19±2.10)%；S期細(xì)胞比例分別是(25.00±2.17)%和(32.71±2.07)%；G2/M期細(xì)胞比例分別是(13.10±1.23)%和(12.10±1.23)%。而HepG2/C和QGY-7703/C細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞比例分別是(52.72±3.26)%和(47.12±2.26)%；S期細(xì)胞比例分別是(34.56±2.77)%和(41.78±2.57)%；G2/M期細(xì)胞比例分別是(12.10±1.52)%、(11.10±1.49)%。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13細(xì)胞G1期比例增多，S期細(xì)胞比例減少。見圖4。

A,B:Control group;C,D:Experimental group;A,C:HepG2 cells; B,D:QGY-7703 cells.

A,B Control group; C,D Experimental group;A,C:HepG2 cells;B,D:QGY-7703 cells.

3　討　論

HOX基因是調(diào)控機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化的主要分子之一[6]，分為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD 4種類型，各自排列在一條特定的染色體上[7]。越來越多的研究[8-10]顯示：HOX異常與人類許多腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)聯(lián)。Vider等[11]研究發(fā)現(xiàn)：HOXB6、HOXB8、HOXC8和HOXC9基因在結(jié)腸癌細(xì)胞CaCo-2和HT-29中表達(dá)上調(diào)。有研究[12]顯示：HOXA1、HOXA5、HOXA10和 HOXC6基因在肺癌樣本中的表達(dá)明顯升高，其中以HOXA5和 HOXA10基因的差異表達(dá)尤為明顯 。Kanai等[13]發(fā)現(xiàn)：HOXA9、HOXB3、HOXB8 和 HOXB9在肝癌樣本中的表達(dá)明顯升高。Quagliatat等[14]發(fā)現(xiàn)HOXA13在肝癌組織中高表達(dá)與肝癌預(yù)后不良有密切關(guān)聯(lián)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HOXA13基因沉默以后，HepG2和QGY-7703細(xì)胞的體外生長速度明顯降低，細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長，克隆形成能力也明顯降低，表明可能是基因水平的改變導(dǎo)致了HOXA13蛋白表達(dá)減少，從基因水平印證了HOXA13可以使肝癌細(xì)胞的生長速度明顯加快、細(xì)胞倍增時(shí)間明顯縮短、克隆形成能力也明顯增加，從而增殖速度加快、成瘤能力增加，加速了腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，導(dǎo)致其預(yù)后不良，與Quagliatat等[14]的研究結(jié)果趨勢一致。另外，肝癌細(xì)胞的生長速度明顯加快，細(xì)胞倍增時(shí)間明顯縮短，而血管形成相對(duì)不足導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)不足，從而腫瘤更容易發(fā)生出血、壞死等繼發(fā)改變，更容易破壞局部組織和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這也是導(dǎo)致腫瘤不良預(yù)后的原因[15]?？梢奌OXA13可以使肝癌的惡性程度增加。

Gu等[16]研究HOXA13對(duì)食管鱗癌的促瘤作用發(fā)現(xiàn)：HOXA13沉默后，食管鱗癌細(xì)胞的克隆形成能力、裸鼠成瘤能力均明顯降低。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HOXA7基因有效沉默后，HepG2和QGY-7703 細(xì)胞體外生長速度明顯減慢，細(xì)胞周期也發(fā)生改變，即G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低，裸鼠體內(nèi)成瘤能力也下降，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白E1和細(xì)胞周期蛋白2 表達(dá)水平也明顯下降。且在正常肝細(xì)胞中采用基因重組的方法使 HOXA7 過表達(dá)后，肝細(xì)胞的體外增殖速度加快，細(xì)胞周期蛋白E1 和細(xì)胞周期蛋白2水平明顯升高。說明HOXA7能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，與細(xì)胞周期蛋白 E1和細(xì)胞周期蛋白2介導(dǎo)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中HOXA13基因有效沉默后，HepG2和 QGY-7703細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯變化，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，可能是HOXA13在HepG2和 QGY-7703細(xì)胞中的表達(dá)具有周期依賴性，以維持HepG2和 QGY-7703細(xì)胞的有絲分裂，其機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，有效沉默HOXA13后，可引起肝癌細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長和增殖能力明顯降低，說明HOXA13 在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用，這為以HOXA13為靶點(diǎn)的肝癌診斷和治療提供了新的理論依據(jù)及靶向策略。

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