韓 波，賈 政，耿 宇

烏蘭察布市中心醫(yī)院普外科，內(nèi)蒙古 集寧 012000

結(jié)直腸癌是一種最常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率在所有惡性腫瘤中已躍居第2位[1]。結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿、表現(xiàn)不典型，確診時(shí)已有超過25%Ⅱ期患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，其5年存活率低于65%。結(jié)直腸癌的治療在Ⅰ期、Ⅱ期患者以手術(shù)切除為主，Ⅲ期輔以放療和化療[2-3]。但患者由于身體素質(zhì)、局部復(fù)發(fā)和全身轉(zhuǎn)移等因素的影響，使得盡管傳統(tǒng)結(jié)直腸癌臨床分期或分型相同的患者，其術(shù)后結(jié)局差別也很大。因此，尋找判斷結(jié)直腸癌患者術(shù)后結(jié)局和預(yù)后的生物標(biāo)志物顯得尤其重要。

黏蛋白1(mucin 1, MUC1)是一種結(jié)構(gòu)性跨膜蛋白，具有高度糖基化的胞外結(jié)構(gòu)域。生理狀態(tài)下，MUC1主要表達(dá)于各種腺體或腔道，如乳腺、食管、胃、十二指腸、空回腸、結(jié)腸、胰腺、前列腺和肺等上皮細(xì)胞的頂緣，從而對(duì)上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，并在信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。近年的研究[4-6]發(fā)現(xiàn)， MUC1在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在過表達(dá)的情況，并且由于癌巢內(nèi)瘤細(xì)胞極性的喪失，MUC1呈現(xiàn)全細(xì)胞膜和胞漿共同分布的現(xiàn)象。但MUC1在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分布改變的臨床意義仍不清楚。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種上皮細(xì)胞間連接分子，通常表達(dá)于細(xì)胞膜上，如果出現(xiàn)于胞漿或胞核，稱為異位表達(dá)。生理情況下，β-catenin與E-cadherin結(jié)合錨定在細(xì)胞膜上，構(gòu)成細(xì)胞間連接的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在調(diào)控細(xì)胞間黏附中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，β-catenin與E-cadherin解離細(xì)胞間鏈接破壞，除此之外，異位的β-catenin入核后，通過啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路加快腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腫瘤浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[7-8]。本研究以67例結(jié)直腸癌患者的石蠟標(biāo)本為研究對(duì)象，通過免疫組織化學(xué)染色，結(jié)合患者的臨床數(shù)據(jù)，探討MUC1在結(jié)直腸癌中表達(dá)的臨床意義及是否與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取烏蘭察布市中心醫(yī)院2010年8月1日至2013年8月1日病理檢查確診為結(jié)直腸癌且臨床資料齊全的石蠟組織標(biāo)本67例納入本研究。男35例，年齡(62.7±9.2)歲；女32例，年齡(63.7±9.4)歲；其中結(jié)腸癌45例，直腸癌22例；高分化腺癌34例，中分化腺癌23例，低分化腺癌10例；所有患者術(shù)前均未接受任何放療或化療。

1.2免疫組化檢測(cè)MUC1和β-catenin的表達(dá)所有標(biāo)本用質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛緩沖液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色確定標(biāo)記部位。應(yīng)用MUC1兔抗人單克隆抗體(福州邁新生物有限公司)和β-catenin兔抗人單克隆抗體(福州邁新生物有限公司)，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟，全自動(dòng)免疫組化機(jī)進(jìn)行染色操作。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)MUC1陽(yáng)性表達(dá)判定[6]：細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞著色深度進(jìn)行綜合評(píng)分：未見陽(yáng)性細(xì)胞為0分，<30%計(jì)1分，30%～ 60%計(jì)2分，61%～74%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分；基本不著色為0分，淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕色計(jì)3分。MUC1陽(yáng)性評(píng)分值=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×染色強(qiáng)度，每例標(biāo)本至少計(jì)數(shù)3個(gè)視野，求平均數(shù)，<3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

β-catenin異位陽(yáng)性判定[9]：β-catenin表達(dá)于正常腸上皮細(xì)胞膜上，如果細(xì)胞膜表達(dá)下降，細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為異位陽(yáng)性表達(dá)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：≥70%細(xì)胞膜染色陽(yáng)性計(jì)0分，<70%細(xì)胞膜染色陽(yáng)性或≥70%細(xì)胞膜染色陽(yáng)性但<10%胞質(zhì)染色陽(yáng)性計(jì)1分，≥10%細(xì)胞質(zhì)染色陽(yáng)性計(jì)2分，≥10%細(xì)胞核染色陽(yáng)性計(jì)3分，≥10%細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色陽(yáng)性計(jì)4分。每例標(biāo)本至少計(jì)數(shù)3個(gè)視野，求平均數(shù)，<2分為陰性，≥2分為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；MUC1與β-catenin陽(yáng)性表達(dá)評(píng)分的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MUC1陽(yáng)性表達(dá)和β-catenin異位與患者臨床特征的關(guān)系結(jié)直腸癌組織中腸上皮細(xì)胞極性排列的分布狀態(tài)在部分區(qū)域喪失，且有絲分裂象明顯。MUC1的表達(dá)不再局限于腸上皮細(xì)胞面向腔道的頂端細(xì)胞膜，而是向全細(xì)胞擴(kuò)散，并在胞漿中出現(xiàn)(見圖 1A～1B)。與癌周正常組織比較，MUC1的陽(yáng)性表達(dá)顯著增加(20.9%vs64.2%，P<0.05)，并顯著影響腫瘤的分化程度(χ2=8.696，P=0.013)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(χ2=3.963，P=0.047)。結(jié)直腸癌組織中局限于腸上皮細(xì)胞膜上表達(dá)的β-catenin向胞漿，甚至細(xì)胞核異位(見圖 1C～1D)。癌周正常組織β-catenin幾乎全部集中表達(dá)在細(xì)胞膜上，很少出現(xiàn)異位現(xiàn)象(4.5%vs68.7%，P<0.05)。癌組織中β-catenin的表達(dá)顯著影響腫瘤的分化程度(χ2=9.393，P<0.05)、浸潤(rùn)深度(χ2=5.235，P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(χ2=11.015，P<0.05)(見表1)。

圖1 MUC1表達(dá)和β-catenin異位情況(200×) A：MUC1在結(jié)直腸癌旁正常組織的陰性表達(dá)；B：MUC1在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)；C：β-catenin在結(jié)直腸癌旁正常組織的正常表達(dá)；D：β-catenin在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性異位表達(dá)Fig 1 The expressions of MUC1 and β-catenin heterotopia(200×) A: the negative expression of MUC1 in peritumoral normal tissue of colorectal carcinoma; B: the positive expression of MUC1 in colorectal carcinoma; C: the normal expression of β-catenin heterotopia in peritumoral normal tissue of colorectal carcinoma; D: the positive ectopic expression of β-catenin heterotopia in colorectal carcinoma

Tab 1 The influence of MUC1 expression and β-catenin heterotopia on clinical and pathological features of patients with colorectal carcinoma 比例/%

2.2結(jié)直腸癌組織中MUC1表達(dá)與β-catenin異位的相關(guān)性分析結(jié)直腸癌組織中MUC1表達(dá)的積分值與β-catenin異位陽(yáng)性積分值的Pearson相關(guān)分析表明，MUC1的表達(dá)與β-catenin異位呈顯著正相關(guān)(R2=0.208，P<0.05，見圖2)。

圖2 結(jié)直腸癌組織中MUC1表達(dá)與β-catenin異位相關(guān)性分析Fig 2 The analysis of Pearson between MUC1 expression and β-catenin heterotopia in colorectal carcinoma tissue

3 討論

大量基礎(chǔ)和臨床研究[2,4-6, 10]發(fā)現(xiàn)，MUC1在肺癌、腎癌、胰腺癌、前列腺癌中表達(dá)顯著升高，并通過Wnt信號(hào)通路啟動(dòng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，參與癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。我們以結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除組織石蠟標(biāo)本為對(duì)象的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中腸上皮細(xì)胞極性排列狀態(tài)破壞，MUC1的表達(dá)不再局限于腸上皮細(xì)胞面向腔道的頂端細(xì)胞膜，而是向全細(xì)胞擴(kuò)散，并在胞漿中出現(xiàn)，與癌周組織比較，MUC1的陽(yáng)性表達(dá)大量增加，并顯著影響腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況；此外，癌組織中β-catenin表達(dá)向胞漿，甚至細(xì)胞核異位。β-catenin的異位表達(dá)顯著影響腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。因此，MUC1的表達(dá)上調(diào)和β-catenin的異位表達(dá)都預(yù)示患者的不良預(yù)后。MUC1表達(dá)與β-catenin異位的相關(guān)性分析顯示，兩者呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果提示，MUC1可能通過Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子β-catenin異位參與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的進(jìn)展過程。

MUC1是一種結(jié)構(gòu)性跨膜糖蛋白，參與機(jī)體的多種生物學(xué)過程。但MUC1并沒有直接DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而是通過多種核轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)基因的表達(dá)與調(diào)控。近年研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)MUC1表達(dá)增加，可抑制β-catenin與E-cadherin的結(jié)合，破壞細(xì)胞間連接的穩(wěn)定性，出現(xiàn)抗細(xì)胞間黏附效應(yīng)，促進(jìn)癌細(xì)胞的逃逸和轉(zhuǎn)移。此外，MUC1與β-catenin相互作用的結(jié)果引起β-catenin由細(xì)胞膜向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，然后β-catenin作為核轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)。大量基礎(chǔ)研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin與DNA結(jié)合蛋白，如T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子家族，形成復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)控c-myc、cyclin D1、MMP-7等基因的轉(zhuǎn)錄[10]。β-catenin由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移入核啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的過程也即開始腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。這種現(xiàn)象已在乳腺癌、肝癌等腫瘤的進(jìn)展過程中得到證實(shí)[12-13]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中MUC1表達(dá)顯著增加，并與β-catenin異位密切相關(guān)，這些改變也影響著腫瘤的侵襲行為。但目前的研究?jī)H局限于臨床觀察，還缺乏MUC1和β-catenin之間相互作用的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)。此外，報(bào)道[10]證實(shí)，腎癌細(xì)胞MUC1表達(dá)顯著增加，通過Wnt信號(hào)經(jīng)典的SNAIL機(jī)制，引起上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的侵襲和浸潤(rùn)?？紤]到β-catenin和SNAIL信號(hào)傳導(dǎo)過程中具有共同的調(diào)控分子GSK3β，結(jié)直腸癌瘤細(xì)胞的侵襲與浸潤(rùn)是否也會(huì)有MUC1/SNAIL機(jī)制啟動(dòng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)程，值得進(jìn)一步探討。

總之，本研究在結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中證實(shí)，MUC1高表達(dá)與β-catenin異位呈顯著正相關(guān)，二者顯著影響腫瘤的侵襲行為，并可作為判斷結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

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