王翠艷，王志偉

1.濮陽市人民醫(yī)院消化一科，河南 濮陽 457000； 2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腔內(nèi)血管外科

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其5年生存率較低。近年來，隨著人們生活方式的改變、人口老齡化的加快、空氣污染的加劇等，胃癌的發(fā)病率逐漸上升。研究[1-2]表明，胃癌的死亡率占腫瘤死亡的第2位，嚴(yán)重危害人類的生命安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年美國胃癌的新增病例約2.8萬，新增死亡人數(shù)約1萬，占腫瘤發(fā)病率和死亡率的第1位和第2位[3]。研究統(tǒng)計(jì)表明，2015年中國胃癌新增病例約73萬，新增死亡人數(shù)約61萬[4]。目前胃癌的主要治療方法是手術(shù)結(jié)合放化療，但因胃癌早期癥狀不明顯以及缺乏早期診斷的標(biāo)志物，大部分的胃癌患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后差，5年生存率低。大量的研究[5-6]表明，癌癥的發(fā)生、發(fā)展受多種因素的影響，例如基因的突變、缺失、表達(dá)失調(diào)均可引起細(xì)胞惡性增殖、侵襲、遷移紊亂等。因此，尋找新的生物學(xué)靶基因位點(diǎn)成為目前研究的熱點(diǎn)之一。ANK2是一種細(xì)胞支架蛋白，屬于錨蛋白家族(Ankyrins, ANKs)的成員之一，廣泛表達(dá)于機(jī)體的各個組織。近年來的研究[7]證實(shí)，錨蛋白家族參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。但ANK2在胃癌中的研究較少，因此本研究通過siRNA特異性沉默ANK2基因表達(dá)，觀察其表達(dá)量降低對胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖、侵襲、細(xì)胞周期的影響，為胃癌診斷治療以及分子機(jī)制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人胃癌細(xì)胞系SGC-7901購自中科院細(xì)胞庫，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、流式細(xì)胞儀、Matrigel膠均購自美國BD公司，細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell小室均購自美國Corning公司，ANK2抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京聯(lián)科生物公司，低溫離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：采用質(zhì)量濃度為750 g/L的酒精提前處理實(shí)驗(yàn)試劑和耗材，超凈工作臺紫外燈照射30 min；將凍存與液氮中的SGC-7901細(xì)胞系快速放入37 ℃水浴箱中，搖勻，采用3 ml滴管吹勻細(xì)胞，加入8 ml RPMI-1640培養(yǎng)基，采用質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清和雙抗，混勻離心，棄上清，加入5 ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度70%～80%時，采用質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰酶消化細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液后置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：以新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并將細(xì)胞密度調(diào)整為6×105ml-1，然后接種在6孔板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)。細(xì)胞融合度90%～95%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為3組：對照組、無義組、siRNA-ANK2組。轉(zhuǎn)染前2 h，更換為無胎牛血清的培養(yǎng)基，將4 μg siRNA ANK2或siRNA 無義序列與250 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基混合均勻，10 μl Lipofectamine 2000與250 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基混勻，將稀釋的DNA混合液加入到Lipofectamine 2000混合液中，室溫靜置20 min，然后將混合液轉(zhuǎn)移至6孔板中，混勻，轉(zhuǎn)染4～6 h，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ANK2蛋白表達(dá)量的檢測：采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ANK2蛋白表達(dá)量。PBS洗滌各組細(xì)胞2遍，吸取500 μl RIPA裂解液，冰上放置10 min，將細(xì)胞完全粉碎，離心，取上清。BCA法測定樣品蛋白濃度，玻璃板清洗干凈，配置質(zhì)量濃度為100 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠，置于蛋白電泳槽中，加入適量電泳液。取蛋白質(zhì)樣品與5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴10 min，然后迅速冰浴10 min，每個上樣孔加入40 μg蛋白樣品，調(diào)整電壓至80 V進(jìn)行電泳，至藍(lán)色條帶到達(dá)凝膠底部0.5 cm處，調(diào)整電壓至100 V，藍(lán)色條帶移動至凝膠底部，停止電泳。去除濃縮膠，將攜帶目的蛋白的凝膠置于電轉(zhuǎn)液中浸泡20 min，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，正面進(jìn)行標(biāo)記，放入5%封閉液中，搖床上封閉60 min。TBS-T洗膜10 min，置于一抗溶液中，4 ℃過夜。TBS-T洗膜5次×5 min，放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中，混合均勻，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜5次×5 min，加入ECL的A、B液反應(yīng)1 min，暗盒中曝光，成像儀中成像，分析蛋白質(zhì)光密度值。

1.2.4 細(xì)胞活性的檢測：常規(guī)消化各組細(xì)胞，以2×103/孔細(xì)胞接種于96孔板上，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔細(xì)胞中加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀上450 nm波長測定細(xì)胞的吸光度(OD值)。

1.2.5 細(xì)胞周期的檢測：常規(guī)消化各組細(xì)胞，加入PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入質(zhì)量濃度為700 g/L的乙醇(提前預(yù)冷)固定12 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，加入500 μl PI(含RNA酶)，避光，4 ℃孵育0.5 h，置于流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm細(xì)胞各周期DNA含量。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力的檢測：提前將Matrigel膠、培養(yǎng)基、Transwell小室置于4 ℃冰箱中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠至4 g/L，吸取70 μl Matrigel膠加入Transwell小室上室底部，搖勻，置于37 ℃恒溫箱中通風(fēng)30 min，使Matrigel膠充分凝固。吸取無血清的培養(yǎng)基加入Transwell小室中。胰酶消化已饑餓24 h的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105ml-1。取200 μl細(xì)胞稀釋液接種于Transwell小室上室中，下室中加入700 μl質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，置于24孔板上，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，無菌PBS緩沖液清洗3次，隨機(jī)選取5個視野拍照計(jì)數(shù)，每組5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ANK2蛋白的表達(dá)量Western blotting檢測轉(zhuǎn)染siRNA ANK2或siRNA 無義序列后胃癌SGC-7901細(xì)胞中ANK2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如表1、圖1所示，與對照組相比，siRNA-ANK2組ANK2蛋白水平顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.219,P<0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ANK2蛋白的表達(dá)量Fig 1 The expression of ANK2 protein in transfected cells

組別ANK2/GAPDH對照組0.386±0.045無義組0.367±0.043siRNA-ANK2組0.216±0.030*F值16.358P值0.004

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2沉默ANK2表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖情況的影響CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染siRNA ANK2或siRNA無義序列后胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖情況的變化。如表2所示，與對照組相比，無義組細(xì)胞的OD值無顯著變化，siRNA-ANK2組細(xì)胞的OD值顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.811,P<0.05)。

2.3沉默ANK2表達(dá)對胃癌細(xì)胞周期的影響流式

細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染siRNA ANK2或siRNA無義序列后胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的變化。如表3所示，與對照組相比，無義組細(xì)胞周期無明顯變化，siRNA-ANK2組細(xì)胞周期G0/G1期比例顯著升高(t= 3.008,P<0.05)，S期顯著降低(t=4.016 ,P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 沉默ANK2表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖情況的影響

注：與對照組相比，*P<0.05。

表3 沉默ANK2表達(dá)對胃癌細(xì)胞周期的影響Tab 3 Effect of silencing ANK2 expression on cell cycle of gastric cancer(±s) %

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.4沉默ANK2表達(dá)對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell法檢測轉(zhuǎn)染siRNA ANK2或siRNA無義序列后胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的變化。如表4所示，與對照組相比，無義組細(xì)胞的侵襲數(shù)無顯著變化，siRNA-ANK2組細(xì)胞的侵襲數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.813,P<0.05)。

表4 沉默ANK2表達(dá)對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響Tab 4 Effect of silencing ANK2 expression on invasion ability of

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

近年來，癌癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，發(fā)病率逐年升高。腫瘤的發(fā)生主要是由于機(jī)體受到某種因素的刺激導(dǎo)致原癌基因和抑癌基因表達(dá)量失衡。目前,臨床上常采用手術(shù)治療聯(lián)合放射、化學(xué)療法，但無法根除或徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，腫瘤患者常出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，且常規(guī)化療特異性較差，不僅殺傷腫瘤細(xì)胞，而且損害機(jī)體正常的細(xì)胞，具有較大的不良反應(yīng)[8]?；蛑委熓且环N安全、有效、不良反應(yīng)小的治療方法，成為腫瘤生物治療研究的重點(diǎn)。RNA干擾技術(shù)是一種高效、特異性高、作用范圍廣、操作簡單的基因抑制技術(shù)，主要通過導(dǎo)入特異性雙鏈RNA，引起靶基因特定的沉默應(yīng)答反應(yīng)，從而抑制靶基因的表達(dá)，目前多用于基因治療和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中相關(guān)基因功能的探索[9-10]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過siRNA技術(shù)特異性降低ANK2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞SGC-7901轉(zhuǎn)染siRNA ANK2后，細(xì)胞中ANK2蛋白的表達(dá)量明顯降低。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，研究表明，機(jī)體內(nèi)抑癌基因和癌基因的平衡與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[11-12]，但目前對胃癌的生長和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不完全清楚，因此，研究其生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，對胃癌的診斷和治療具有重要意義。腫瘤的惡性生長、侵襲、遷移是導(dǎo)致腫瘤預(yù)后較差、死亡率增加的主要原因[13-14]。ANK2編碼的Ankyrin-B屬于ANKs家族，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。研究[7,16-17]發(fā)現(xiàn)，ANKs在前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在本實(shí)驗(yàn)中，CCK-8檢測細(xì)胞的增殖活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)胃癌細(xì)胞SGC-7901中ANK2表達(dá)量下降時，細(xì)胞的增殖活性明顯降低；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANK2表達(dá)量下調(diào)時，G0/G1期的細(xì)胞比例明顯增多，S期的細(xì)胞比例降低，表明沉默ANK2基因表達(dá)能使人胃癌細(xì)胞SGC-7901的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制其向S期轉(zhuǎn)化；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ANK2基因沉默的SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力明顯降低。研究[18]表明，干擾ANK2基因的表達(dá)可有效抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，沉默胃癌細(xì)胞SGC-7901中ANK2表達(dá)，可以降低胃癌細(xì)胞增殖活性，抑制胃癌細(xì)胞生長，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，阻礙胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，ANK2可能成為胃癌基因治療的潛在靶點(diǎn)。

[1] HAMASHIMA C. Current issues and future perspectives of gastric cancer screening [J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(38): 13767-13774. DOI: 10.3748/wjg.v20.i38.13767.

[2] SHMULEVICH I. Large-scale molecular characterization and analysis of gastric cancer [J]. Chin J Cancer, 2014, 33(8): 369-370.

[3] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics,2017 [J].CA Cancer J Clin,2017,67(1):7-30. DOI: 10.3322/caac.21387.

[4] CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132. DOI: 10.3322/caac.21338.

[5] 王思萌, 高柳村, 帖君, 等. Cetuximab抑制胃癌SGC7901/ADR細(xì)胞的增殖并增加其化療敏感性[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 13(12): 2253-2256, 2264.

WANG S M, GAO L C, TIE J, et al. In vitro proliferation repression and an increase of chemo-sensitivity of Cetuximab as monotherapy in chemo-refractory gastric cancer cell line SGC7901/ADR [J]. Progress in Modern Biomedicine, 2013, 13(12): 2253-2256, 2264.

[6] KüHL S J, KüHL M. On the role of Wnt/β-catenin signaling in stem cells [J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1830(2): 2297-2306.DOI: 10.1016/j.bbagen.2012.08.010

[7] WNG T, ABOU-OUF H, HEGAZY S A, et al. Ankyrin G expression is associated with androgen receptor stability, invasiveness, and lethal outcome in prostate cancer patients [J]. J Mol Med (berl), 2016, 94

(12): 1411-1422. DOI: 10.1007/s00109-016-1458-4.

[8] 羅靜. RNA干擾在抗腫瘤中的作用研究進(jìn)展[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2017, 34(4): 340-343. DOI: 10.7683.xxyxyxb.2017.04.025.

[9] ZHANG G, WANG Z, QIAN F, et al. Silencing of the ABCC4 gene by RNA interference reverses multidrug resistance in human gastric cancer[J]. Oncol Rep, 2015, 33(3): 1147-1154.DOI: 10.3892/or.2014.3702.

[10] 曹大龍, 劉黎明. RNA 干擾技術(shù)在腫瘤基因治療中的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2015, 21(14): 2566-2569. DOI: 10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.026.

CAO D L, LIU L M. Research progress of RNA interference in tumor gene therapy [J]. Medical Recapitulate, 2015, 21(14): 2566-2569. DOI: 10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.026.

[11] JIANG C, CHEN X, ALATTRAR M, et al. MicroRNAs in tumorigenesis, metastasis, diagnosis and prognosis of gastric cancer[J]. Cancer Gene Ther, 2015, 22(6): 291-301.DOI: 10.1038/cgt.2015.19.

[12] LIANG L, FANG J Y, XU J. Gastric cancer and gene copy number variation: emerging cancer drivers for targeted therapy[J]. Oncogene, 2016, 35(12): 1475-1482. DOI: 10.1038/onc.2015.209.

[13] NISHIDA T, EGASHIRA Y, AKUTAGAWA H, et al. Predictors of lymph node metastasis in T1 colorectal carcinoma: an immunophenotypic analysis of 265 patients [J]. Dis Colon Rectum, 2014, 57(8): 905-915.DOI: 10.1097/DCR.0000000000000168.

[15] CAO W, WEI W, ZHAN Z, et al. Role of miR-647 in human gastric cancer suppression [J]. Oncol Rep, 2017, 37(3): 1401-1411.

[16] BABINA I S, MCSHERRY E A, DONATELLO S, et al. A novel mechanism of regulating breast cancer cell migration via palmitoylation-dependent alterations in the lipid raft affiliation of CD44[J]. Breast Cancer Res, 2014, 16(1): R19. DOI: 10.1186/bcr3614.

[17] CATTARUZZA F, JOHNSON C, LEGGIT A, et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2013, 304(11): G1002-G1012. DOI: 10.1152/ajpgi.00005.2013.

[18] MONTANINI L, LASAGNA L, BARILI V, et al. MicroRNA cloning and sequencing in osteosarcoma cell lines: differential role of miR-93[J]. Cell Oncol (Dordr), 2012, 35(1): 29-41. DOI: 10.1007/s13402-011-0059-z.