馬 軍， 李雨濛， 李 南， 任凱凱， 馬佳康， 孫 佳， 張 進(jìn)， 蘇彥河，袁 翎， 段芳齡

1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450014；2.鄭州大學(xué)消化疾病研究所；3.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科；4.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科；5.河南省腫瘤醫(yī)院放療科

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于第8位，占所有癌癥死亡率的第6位。中國(guó)食管癌病例占全球一半以上，每年約有15萬(wàn)人死于這一疾病，是我國(guó)癌癥相關(guān)死亡的第4大病因。食管癌主要有食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌2個(gè)亞型，我國(guó)ESCC的發(fā)病率在90%以上[1]。高死亡率是食管癌的一個(gè)典型特征，因此迫切需要新的生物標(biāo)記物來(lái)更精確地診斷和治療食管癌，尤其是ESCC。

microRNA (miRNA) 是一類由內(nèi)源基因編碼的、長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的小RNA，在細(xì)胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用。既往研究表明，miR-204、miR-205可能參與腫瘤的形成與進(jìn)展[2]，但在食管癌中的研究仍較少。

PANDOLFI等[3]于2011年提出的ceRNA(競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA)假說(shuō)認(rèn)為，內(nèi)源性RNA分子具有miRNA作用位點(diǎn)，可以競(jìng)爭(zhēng)性地與miRNA結(jié)合，從而間接調(diào)控miRNA靶基因的作用。ceRNA假說(shuō)的提出賦予mRNA和非編碼RNA新的、更為廣泛的生物學(xué)功能。不同類型的RNA之間,包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)、mRNA等，通過RNA-RNA相互作用所構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在病理生理過程中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤的生成和發(fā)展[4]。

lncRNA是長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的非編碼 RNA[5]，在細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，與人類眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展都有著密切的聯(lián)系。有研究[6]表明，lncRNA可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ESCC相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出差異表達(dá)的mRNA、lncRNA及miRNA，成功構(gòu)建了miR-204、miR-205相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并找出與亞洲ESCC患者生存相關(guān)的lncRNA。通過對(duì)7個(gè)同時(shí)調(diào)節(jié)miR-204、miR-205的lncRNA的靶基因進(jìn)行GO、KEGG、蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)等分析，預(yù)測(cè)這些lncRNA在亞洲ESCC中的臨床意義、分子調(diào)控機(jī)制，為ESCC的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1TCGA數(shù)據(jù)下載及差異基因篩選從TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載ESCC mRNA、miRNA的測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床信息。截至2018年2月23日，數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄ESCC mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)92例，其中81例ESCC組織樣本及11例癌旁正常組織樣本；收錄miRNA ESCC測(cè)序數(shù)據(jù)108例，包括ESCC組織樣本95例，癌旁正常組織樣本13例。其中亞洲ESCC mRNA測(cè)序樣本37例，miRNA測(cè)序樣本44例。使用R語(yǔ)言“edgeR”包篩選差異基因，篩選條件為：log 2-fold change (logFC)>2且P<0.05。

1.2ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出的差異lncRNA、差異miRNA在miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行配對(duì)。利用starBase在線軟件(http://starbase.sysu.edu.cn/)對(duì)篩選出的差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，miRDB、miRTarBase、TargetScan 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因，從而得到lncRNA-miRNA-mRNA 的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape v3.5.1軟件制圖。

1.3生存分析利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中亞洲人ESCC的生存時(shí)間，采用的是R語(yǔ)言中的“Survival”軟件包，對(duì)特異的lncRNA進(jìn)行生存分析，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4lncRNA靶基因預(yù)測(cè)、GO及KEGG分析lncRNA靶基因預(yù)測(cè)利用MEM(https://biit.cs.ut.ee/mem/)在線分析，每個(gè)lncRNA選取200個(gè)靶基因進(jìn)行下一步分析。GO、KEGG使用Cytoscape中的“ClueGO”、“CluePedia”APP完成，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)利用在線軟件STRING(https://string-db.org/)尋找蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。相關(guān)圖表利用Cytoscape中的“stringAPP”完成，并刪除未出現(xiàn)在互作網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1ESCC差異基因篩選及miR-204、miR-205相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ESCC的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析，共篩選出差異lncRNA 1 160個(gè)、mRNA 2 064個(gè)、miRNA 69個(gè)。通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，miR-204、miR-205是ESCC中重要的節(jié)點(diǎn)基因，提取其相關(guān)的lncRNA 38個(gè)、mRNA 13個(gè)，并成功構(gòu)建了以miR-204/205為節(jié)點(diǎn)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中FER1L6-AS1、MIR205HG、TM4SF19-AS1、ADAMTS9-AS2、HOTTIP、LINC00520、SOX2-OT、LINC00524和 RMST這9個(gè)lncRNA可同時(shí)調(diào)控miRNA-204及miRNA-205(見圖1)。

2.2miR-204、miR-205相關(guān)lncRNA生存分析為了研究差異基因與亞洲ESCC患者總生存期的關(guān)系，我們對(duì)miR-204、miR-205相關(guān)的lncRNA、mRNA進(jìn)行OS分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)ER1L6-AS1和LINC00504與亞洲ESCC患者生存顯著相關(guān)(見圖2)，未發(fā)現(xiàn)與亞洲ESCC患者生存相關(guān)的mRNA(見表1)。

2.3lncRNA靶基因預(yù)測(cè)及GO、KEGG分析用MEM在線軟件對(duì)9個(gè)lncRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，LINC00524和TM4SF19-AS1未預(yù)測(cè)出下游靶基因，其余7個(gè)lncRNA根據(jù)相關(guān)性選取前200個(gè)作為目標(biāo)靶基因,去除重復(fù)值后共有1 165個(gè)靶基因。1 165個(gè)預(yù)測(cè)靶基因在TCGA中2 064個(gè)差異表達(dá)mRNA中驗(yàn)證，篩選出141個(gè)mRNA作為最終靶基因。GO分析共發(fā)現(xiàn)9個(gè)細(xì)胞成分、7個(gè)分子功能相關(guān)富集，主要參與細(xì)胞間連接、突觸、通道活性、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等功能。KEGG分析發(fā)現(xiàn)4條相關(guān)通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、GABA能突觸、嗎啡成癮等通路(見圖3)。

注：紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因。三角形、圓形及八邊形分別代表miRNA、lncRNA和mRNA。

lncRNAGeneID基因坐標(biāo)(hg19)表達(dá)水平P值FDRFER1L6-AS1ENSG00000181171chr8:123,984,138-124,040,782下調(diào)2.06E-075.24E-06LINC00504ENSG00000248360chr4:14,470,465-14,888,169上調(diào)0.00130.0085

圖2 亞洲人ESCC生存相關(guān)lncRNA Kaplan-Meier生存曲線

圖3 lncRNA靶基因GO、KEGG分析

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建141個(gè)靶基因通過STRING在線分析其相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，結(jié)果顯示,54個(gè)編碼蛋白質(zhì)形成包含67個(gè)互相作用關(guān)系的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(見圖4)。從圖中可以看出：GNG7、ADCY5、NMUR2、PTGER3、KPT5位于網(wǎng)絡(luò)的中心，與多種蛋白質(zhì)之間存在相互作用。

圖4 lncRNA靶基因編碼蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

3 討論

miRNA是目前研究最多的非編碼RNA，它可以作為癌基因或抑癌基因[7]，在腫瘤的生成、侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程中發(fā)揮重要作用。既往研究[2]表明,miR-204、miR-205與多種腫瘤的形成與進(jìn)展關(guān)系密切。

miR-204在ESCC細(xì)胞(EC109、TE10)中，可以下調(diào)(FOXM1)，從而抑制瘤細(xì)胞增殖[8]；術(shù)后復(fù)發(fā)的ESCC患者miR-204表達(dá)降低[9]；在ESCC中，miR-204作為ceRNA成員，其作用可被lncRNA UCA1競(jìng)爭(zhēng)，從而解除miR-204對(duì)SOX4基因的抑制，促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖[10]。我們的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-204在ESCC中表達(dá)下調(diào)，這表明miR-204可能作為抑癌基因參與ESCC的形成與進(jìn)展。

在ESCC中，生活方式可能改變miR-205在腫瘤組織中的表達(dá)，吸煙可以使腫瘤組織miR-205表達(dá)增高，而酗酒可以使其表達(dá)降低[11]。PAN等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-205能促進(jìn)ESCC細(xì)胞EMT活性、抑制凋亡，并通過DNA修復(fù)信號(hào)通路促進(jìn)放療抵抗，因此,在ESCC中，miR-205起著癌基因的作用。然而，MATSUSHIMA等[13]基因芯片結(jié)果顯示，盡管在ESCC中miR-205高表達(dá)，但表現(xiàn)為抑癌基因作用，可以抑制瘤細(xì)胞侵襲和遷移，并通過抑制其靶基因ZEB2，抑制瘤細(xì)胞EMT活性；而且，XU等[14]也發(fā)現(xiàn)，miR-205可以在ESCC患者血中表達(dá)下降。HEZOVA等[15]的實(shí)驗(yàn)顯示，miR-205在不組織類型的食管癌中，作用不同，在食管腺癌中表現(xiàn)為抑癌基因，而在ESCC表現(xiàn)為癌基因。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，ceRNA在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中具有重要的作用，并參與腫瘤的生成與進(jìn)展[16]。目前文獻(xiàn)ESCC中ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多，但miR-205在ESCC中的ceRNA網(wǎng)絡(luò)還未見報(bào)道，miR-204的ceRNA網(wǎng)絡(luò)文獻(xiàn)報(bào)道的僅有UCA1-miR-204-SOX4，因此，ESCC中l(wèi)ncRNA相關(guān)的ceRNA調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，miR-204和miR-205是ESCC ceRNA網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點(diǎn)，以此為節(jié)點(diǎn)，這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)可能對(duì)研究ESCC生成、進(jìn)展相關(guān)機(jī)制提供新的方法。

對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)lncRNA可同時(shí)調(diào)控miR-204及miR-205，我們推測(cè)這些lncRNA與ESCC關(guān)系密切。其中LINC00504與患者的生存呈負(fù)相關(guān)，其表達(dá)量越高患者的生存時(shí)間越短；FER1L6-AS1與患者生存呈正相關(guān)，表達(dá)量越高患者生存時(shí)間越長(zhǎng)。這表明FER1L6-AS1和LINC00504可能是ESCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

另外，這些lncRNA的靶基因與細(xì)胞間連接、突觸、通道活性、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等功能及神經(jīng)活性配體—受體相互作用、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、GABA能突觸、嗎啡成癮等通路顯著相關(guān)，可能參與ESCC的形成與進(jìn)展。PPI網(wǎng)絡(luò)為我們進(jìn)一步研究lncRNA對(duì)基因的調(diào)控和在ESCC中的作用機(jī)制有積極的提示價(jià)值。

[1] DENG H Y, WANG Y C, NI P Z, et al. Long noncoding RNAs are novel potential prognostic biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma: an overview [J]. J Thorac Dis, 2016, 8(8): E653-E659. DOI: 10.21037/jtd.2016.07.01.

[2] LAGES E, IPAS H, GUTTIN A, et al.MicroRNAs: molecular features and role in cancer [J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2012, 17: 2508-2540.

[3] SALMENA L, POLISENO L, TAY Y, et al. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? [J]. Cell, 2011, 146 (3): 353-358. DOI: 10.1016/j.cell.2011.07.014.

[4] TAY Y, RINN J, PANDOLFI P P. The multilayered complexity of ceRNA crosstalk and competition [J]. Nature, 2014, 505(7483): 344-352. DOI: 10.1038/nature12986.

[5] SPIZZO R, ALMEIDA M I, COLOMBATTI A, et al. Long non-coding RNAs and cancer: a new frontier of translational research? [J]. Oncogene, 2012, 31(43): 4577-4587. DOI: 10.1038/onc.2011.621.

[6] SCHMITT A M, CHANG H Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways [J]. Cancer Cell, 2016, 29(4): 452-463. DOI: 10.1016/j.ccell.2016.03.010.

[7] LING H, GIRNITA L, BUDA O, et al. Non-coding RNAs: the cancer genome dark matter that matters! [J]. Clin Chem Lab Med, 2017, 55(5): 705-714. DOI: 10.1515/cclm-2016-0740.

[8] SUN Y, YU X, BAI Q. miR-204 inhibits invasion and epithelial-mesenchymal transition by targeting FOXM1 in esophageal cancer [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(10): 12775-12783.

[9] OKUMURA T, KOJIMA H, MIWA T, et al. The expression of microRNA 574-3p as a predictor of postoperative outcome in patients with esophageal squamous cell carcinoma [J]. World J Surg Oncol, 2016, 14(1): 228. DOI: 10.1186/s12957-016-0985-3.

[10] JIAO C, SONG Z, CHEN J, et al. lncRNA-UCA1 enhances cell proliferation through functioning as a ceRNA of Sox4 in esophageal cancer [J]. Oncol Rep, 2016, 36(5):2960-2966. DOI: 10.3892/or.2016.5121.

[12] PAN F, MAO H, BU F,et al. Sp1-mediated transcriptional activation of miR-205 promotes radioresistance in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Oncotarget, 2017, 8 (4):5735-5752. DOI: 10.18632/oncotarget.13902.

[13] MATSUSHIMA K, ISOMOTO H, YAMAGUCHI N, et al. MiRNA-205 modulates cellular invasion and migration via regulating zinc finger E-box binding homeobox 2 expression in esophageal squamous cell carcinoma cells [J]. J Transl Med, 2011, 9:30. DOI: 10.1186/1479-5876-9-30.

[14] XU H, YAO Y, MENG F, et al. Predictive value of serum miR-10b, miR-29c, and miR-205 as promising biomarkers in esophageal squamous cell carcinoma screening [J]. Medicine, 2015, 94(44):e1558. DOI: 10.1097/MD.0000000000001558.

[15] HEZOVA R, KOVARIKOVA A, SROVNAL J, et al. MiR-205 functions as a tumor suppressor in adenocarcinoma and an oncogene in squamous cell carcinoma of esophagus [J]. Tumour Biol, 2016, 37(6): 8007-8018. DOI: 10.1007/s13277-015-4656-8.

[16] HUANG M, ZHONG Z, LV M, et al. Comprehensive analysis of differentially expressed profiles of lncRNAs and circRNAs with associated co-expression and ceRNA networks in bladder carcinoma [J]. Oncotarget, 2016, 7(30): 47186-47200. DOI: 10.18632/oncotarget.9706.