汪旭偉，馬 沛，王建偉，陳玉星

南陽市第一人民醫(yī)院普外科，河南 南陽 473010

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年全球的發(fā)病率僅次于胃癌[1]。然而，由于其異質(zhì)性和多變性，結(jié)腸癌的具體分子發(fā)病機(jī)制尚未明確[2]。家族遺傳性和基因突變也是結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中的重要部分[3-4]。因此，目前需要更好地了解結(jié)腸癌發(fā)病的分子基礎(chǔ)和發(fā)現(xiàn)對(duì)抗結(jié)腸癌的有效靶向藥物。

微小RNA(miRNA)是一種由20～25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，可以通過與靶向mRNA的3′UTR段結(jié)合配對(duì)達(dá)到促進(jìn)mRNA降解和翻譯的抑制過程[5-7]。目前已經(jīng)確定的相關(guān)miRNA在腫瘤中發(fā)揮致癌和抑癌作用的就有數(shù)百種，而且在不同類型的腫瘤miRNA扮演的角色也不盡相同[8]。最近各種報(bào)道[9-10]提出，多種miRNA在結(jié)腸癌中表達(dá)異常，且存在表達(dá)失控的現(xiàn)象(例如let-7、miR-21、miR-26、miR-221和miR-222等)，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡行為都有一定的調(diào)節(jié)能力。

腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[11]。BID作為Bax家族成員之一，對(duì)細(xì)胞損傷和線粒體修復(fù)有一定的調(diào)控作用，可以決定一群細(xì)胞的分化方向和存活比例[12]。Bax家庭成員擁有同源性結(jié)構(gòu)域，稱為BH1、BH2、BH3和BH4，其中BID占據(jù)最為關(guān)鍵的BH2[13]。

在我們的研究中，通過調(diào)控miR-26的表達(dá)，檢測(cè)BID的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-26和BID有相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，miR-26表達(dá)的下調(diào)可以通過BID的表達(dá)間接影響結(jié)腸癌的行為。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及標(biāo)本HT29、SW480、CW-2和SW620細(xì)胞購自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，并在含有質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS、100 mg/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2016年1月至2016年12月在本院接受結(jié)腸癌組織切除術(shù)的80例患者得到新鮮的結(jié)腸癌組織和相鄰結(jié)腸組織，手術(shù)切除后立即將組織放置液氮冷凍，儲(chǔ)存于-80 ℃直至使用。來自病理科的60例患者的結(jié)腸癌組織均獲得了醫(yī)院保護(hù)人類受試者委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了所有患者的知情同意。

1.2miR-inhibitor轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)miRNA和小干擾RNA(siRNA)由GenePharma(中國(guó)上海)合成。miRNA模擬物是代表成熟miRNA的合成雙鏈體。使用lip2000(QIAGEN)進(jìn)行siRNA和miRNA轉(zhuǎn)染。20 nmol/L siRNA或miRNA用于無血清培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48～72 h制備總RNA和蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步用于定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或蛋白質(zhì)印跡分析。

1.3mRNA的定量分析根據(jù)制造商的方案，使用miRVana miRNA分離試劑盒(Ambion)從培養(yǎng)的細(xì)胞或結(jié)腸癌的臨床樣品中提取總RNA和miRNA。使用TaqManq PCR方法來檢測(cè)組織和細(xì)胞中miR-26的表達(dá)。對(duì)于mRNA表達(dá)的定量分析，使用Primescript RT試劑盒(TaKaRa)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4蛋白質(zhì)提取和免疫印跡使用細(xì)胞裂解緩沖液(Cell Signaling)裂解細(xì)胞，用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將等量的總蛋白質(zhì)在質(zhì)量濃度為100 g/L的SDS聚丙烯酰胺凝膠中分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)。用含有質(zhì)量濃度為0.5 g/L的Tween20的Tris緩沖鹽水沖洗3次，然后使用質(zhì)量濃度為50 g/L的牛血清白蛋白封閉PVDF膜2 h，然后孵育BID一抗(濃度1∶1 000)，4 ℃冰箱，孵育過夜，次日，使用含有質(zhì)量濃度為0.5 g/L的Tween20的Tris緩沖鹽水沖洗3次，然后孵育二抗(濃度1∶5 000)，之后通過ECL顯影。

1.5熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定驗(yàn)證miR-26和BID的相關(guān)關(guān)系，使用雙熒光素酶測(cè)定，將24孔板中的miR-26和NC細(xì)胞與0.4 mg螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體和0.08 mg含有海腎螢光素酶(Promega)的pRL-TK對(duì)照載體共轉(zhuǎn)染，使用siPORTneoFX(Ambion，Austin，TX)，根據(jù)使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。使用雙光發(fā)光報(bào)告基因測(cè)定(Applied Biosystems)測(cè)量熒光素酶活性。將螢火蟲熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化后測(cè)定海腎螢光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6MTT測(cè)定將對(duì)數(shù)期結(jié)腸癌細(xì)胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸浮液并以1×103細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。在細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，加入20 μl MTT測(cè)定液，每孔充分混合均勻，并在37 ℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜 (DMSO)，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在24 h、48 h、72 h和96 h進(jìn)行MTT測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm時(shí)的吸光度，計(jì)算結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件包(SPSS，Chicago，IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析miR-26在結(jié)腸癌和配對(duì)臨近組織中的差異表達(dá)。采用單因素方差分析方法評(píng)估細(xì)胞增殖和侵襲實(shí)驗(yàn)三項(xiàng)之間差異，采用最小差別t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1miR-26的表達(dá)在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)使用qPCR檢測(cè)60例患者的結(jié)腸癌和相鄰非腫瘤結(jié)腸組織(癌旁組織)中miR-26的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與癌旁組織相比，miR-26的表達(dá)在結(jié)腸癌組織中明顯升高(P<0.05)(見圖1)。在4種結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT29、SW480、CW-2和SW620)中觀察到miR-26的表達(dá)均較高，其中SW480與其他細(xì)胞株相比，miR-26表達(dá)最高，且SW480的侵襲性相對(duì)較強(qiáng)(見圖2)。因此，選擇了SW480細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)研究。

注：與結(jié)腸癌組織比較，*P<0.05。

Fig1ExpressionofmiR-26incoloncancertissues;Fig2ExpressionofmiR-26incoloncancercelllines

2.2miR-26在不同臨床病理分期結(jié)腸癌中的表達(dá)情況通過qPCR檢測(cè)miR-26的表達(dá)與結(jié)腸癌的病理分期的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,結(jié)腸癌的病理分期越高，miR-26在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平越高(見圖3)。

2.3miR-26-inhibitor轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率miR-26-inhibitor靶向干擾抑制物由Gnenpharma有限公司合成。miR-26-inhibitor(5′-GGAAGAGCGAUCAAT-3′)。使用對(duì)照NC目標(biāo)序列(5′-UUCUUCGAACCGUTT-3′)作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株的比例在80%以上(見圖4～5)。miR-26-inhibitor轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞效果良好。

圖3 miR-26在不同臨床病理分期結(jié)腸癌中的表達(dá)情況Fig 3 Expression of miR-26 in different clinical pathological stages of colon cancer

2.4雙熒光素酶驗(yàn)證miR-26與BID的關(guān)聯(lián)為了尋找miR-26的下游靶點(diǎn)，利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-26的序列與下游BID基因的部分序列有相同的結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證二者之間是否有調(diào)節(jié)關(guān)系，進(jìn)行雙熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。首先，構(gòu)建了攜帶3′-UTR的熒光素酶報(bào)告因子，其中每個(gè)基因的結(jié)合位點(diǎn)與miR-26結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。熒光素酶測(cè)定顯示，miR-26下游結(jié)合3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)與BID相符合，而不是其他靶點(diǎn)基因，沉默miR-26過后可以導(dǎo)致熒光素酶活性顯著降低(見圖6B)。沉默miR-26后可明顯上調(diào)SW480細(xì)胞中BID的表達(dá)(見圖6A)。

2.5miR-26對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響為了研究miR-26對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，使用SW480細(xì)胞株進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染以沉默miR-26的表達(dá)。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-26對(duì)SW480細(xì)胞增殖情況的影響。miR-26-inhibitor組的細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比對(duì)照組明顯減慢[24 h:(17.2±2.5)%vs(8.1±1.2)%，P<0.05；48 h:(36.2±4.2)%vs(18.4±2.6)%，P<0.05；72 h:(67.5±8.1)%vs(21.4±2.8)%，P<0.01，96 h:(89.2±12.3)%vs(24.4±3.2)%，P<0.05]，培養(yǎng)96 h后抑制效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖7)。抑制miR-26后可以明顯抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖能力。

圖4 miR-26-inhibitor在結(jié)腸癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率(400×)；圖5 miR-26轉(zhuǎn)染效率對(duì)比Fig 4 Transfected efficiency of miR-26-inhibitor in colon cancer cells (400×)； Fig 5 miR-26 transfected efficiency

注：*P<0.05。

2.6miR-26對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響為了研究miR-26對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲能力的影響，使用SW480細(xì)胞株進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染以沉默miR-26的表達(dá)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-26對(duì)SW480細(xì)胞侵襲情況的影響。miR-26-inhibitor組細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目比對(duì)照組明顯減少[(51.25±8.54)%vs(195.24±11.65)%，P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖8)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-26-inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯少于對(duì)照組，細(xì)胞侵襲能力明顯降低。抑制miR-26后可以明顯抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株的侵襲能力。

注：96 h時(shí)兩組比較，*P<0.05。

注：*P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌是全世界消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率最高的疾病之一，發(fā)病率及死亡率僅次于胃癌[14]。有研究[15-16]顯示，多種基因蛋白在結(jié)腸癌中起重要作用，可以調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。然而，對(duì)于結(jié)腸癌的治療，目前臨床上仍然局限于手術(shù)切除及術(shù)后化療，生物靶向治療尚未在臨床上開展實(shí)施，所以，探討結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子病理機(jī)制尤為重要。

結(jié)腸癌發(fā)生主要與遺傳基因和環(huán)境因素有很大關(guān)聯(lián)。而部分基因位點(diǎn)的改變可能會(huì)導(dǎo)致部分miRNA的表達(dá)異常[17]。CLIMENT等[18]通過研究結(jié)腸癌組織中miR-26的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-26在結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，且miR-26可通過激活Smad2和STAT3發(fā)揮促癌作用。目前有相關(guān)研究已經(jīng)證明miRNA在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，例如miR-21、miR-143和miR-145等[19]。據(jù)報(bào)道[20]，miR-26在結(jié)腸癌中上調(diào)，因此被認(rèn)為是一種有促癌作用的miRNA，而且miR-26a通過結(jié)合下游相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散。然而，miR-26的下游具體靶點(diǎn)及它們之間是如何作用的,目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。

miR-26位于19q14.12染色體，有研究[21]表明，miR-26與腫瘤關(guān)系密切，一般在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。成熟的miR-26一般在乳腺癌、肝癌及結(jié)腸癌等組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。LIU等[22]檢測(cè)miR-26在乳腺癌中的表達(dá)異常，乳腺癌中miR-26表達(dá)水平與正常組織相比也出現(xiàn)表達(dá)異常，且與乳腺癌的遷移和侵襲能力相關(guān)。本研究通過qPCR檢測(cè)骨肉瘤組織和正常肺組織miR-26的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-26在結(jié)腸中表達(dá)明顯上調(diào)，表明miR-26在結(jié)腸癌中起促癌作用。結(jié)合前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過抑制miR-26的表達(dá)后，進(jìn)一步研究miR-26在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲過程中的作用。結(jié)果表明，抑制miR-26后，可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。而miR-26是否是通過調(diào)控下游蛋白的表達(dá)來調(diào)控結(jié)腸癌的行為，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們繼續(xù)探討。

Bax家族是凋亡蛋白家族中一種典型蛋白，在許多神經(jīng)細(xì)胞腫瘤和生殖系統(tǒng)中進(jìn)行過研究[23]，Bax可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素c從線粒體中釋放，引起細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞凋亡[24]。之前有相關(guān)報(bào)道，Bax可刺激細(xì)胞色素c流出，但其中具體機(jī)制尚不明確，在以前的報(bào)道中，簡(jiǎn)單地統(tǒng)計(jì)了少數(shù)Bax蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和影響增殖的事件，其中包括線粒體構(gòu)象的改變，但具體的分子機(jī)制仍不明確，只是初步認(rèn)為在線粒體內(nèi)環(huán)境中發(fā)生了某種突變[25]。BID是Bax家族中的一種，BID的表達(dá)水平可以影響B(tài)ax在線粒體外膜上的表達(dá)情況[26]。我們之前已經(jīng)研究過BID可以引起的Bax構(gòu)象的變化導(dǎo)致其下游N-末端結(jié)構(gòu)域的變化，從而影響其對(duì)腫瘤細(xì)胞干擾作用[27]。Bax家庭成員BID在調(diào)節(jié)中細(xì)胞色素c釋放的過程中發(fā)揮重要作用。但是BID能否對(duì)miR-26抑制腫瘤細(xì)胞的部分生物學(xué)功能尚無相關(guān)研究。我們實(shí)驗(yàn)擬研究BID對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響及其上游可能起總調(diào)控作用的miRNA定位，探討miR-26對(duì)BID的調(diào)控影響結(jié)腸癌的惡性生物學(xué)行為。

已知BID是可以受到多種miRNA調(diào)控，介導(dǎo)在不同腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控作用。針對(duì)BID在細(xì)胞中的表達(dá)不同，有研究[28]提出，其可能和細(xì)胞膜表面受體數(shù)量相關(guān)，當(dāng)其表達(dá)上調(diào)或激活時(shí)，可以影響細(xì)胞本身的增殖行為。在本研究中，我們檢查了miR-26介導(dǎo)BID調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)作用的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-26可以調(diào)控下游BID基因表達(dá)情況，可能是通過調(diào)控BID的表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到BID是miR-26表達(dá)調(diào)控過程中所必需的。結(jié)果表明，在結(jié)腸癌中常見的miR-26異常表達(dá)可以影響B(tài)ID的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控結(jié)腸癌的生物學(xué)行為。

本研究系統(tǒng)地研究了miR-26和BID在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖侵襲中的作用和可能機(jī)制。BID被鑒定為miR-26的可能新靶標(biāo)，并被證明是結(jié)腸癌細(xì)胞增殖所必需的。這些發(fā)現(xiàn)將有助于更好地了解結(jié)腸癌的分子發(fā)病機(jī)制，并提示miR-26和BID的類似物可能被認(rèn)為是結(jié)腸癌診斷和治療過程中的新策略。

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