■崔艷紅 韓慶功 王九峰 魏剛才 劉長忠

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193；2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

益生菌是能促進(jìn)動(dòng)物胃腸內(nèi)（主要是腸道）菌群生態(tài)平衡的活性微生物，因其無毒、無殘留、多功能、不污染環(huán)境等特點(diǎn)而日益受到青睞，是可作為抗生素替代品的一種新型環(huán)保飼料添加物。植物乳桿菌(Lactobacillus pluuturum，LP)是乳酸菌中的一種，屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，革蘭氏陽性、無芽孢、厭氧或兼性厭氧菌，最適生長溫度為30～35℃[1-2]，菌種為桿狀，呈單個(gè)、有時(shí)成對或成鏈狀排列，最適pH值6.5左右，屬于同型發(fā)酵乳酸菌[3]。

1989年美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料認(rèn)定協(xié)會(huì)(AAFCO)將植物乳桿菌列入可直接飼喂的益生菌菌種目錄。我國農(nóng)業(yè)部自1999年第105號(hào)公告起，到2013年第2045號(hào)公告《飼料添加劑品種目錄》，每次修訂后的目錄都將植物乳桿菌作為動(dòng)物養(yǎng)殖的微生物添加劑之一。目前用作益生菌的乳酸菌主要來源于人和動(dòng)物的腸道或糞便，當(dāng)前乳酸菌被廣泛應(yīng)用在食品、飼料發(fā)酵和微生態(tài)制劑領(lǐng)域。作為人和動(dòng)物腸道重要的益生菌群，在代謝過程中，乳酸菌能通過競爭性抑制作用在胃腸道內(nèi)占位、定植，抑制致病菌對胃腸道侵害，改善腸道微生物多樣性，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高機(jī)體免疫力和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種作用[4-11]。通常將乳酸菌的耐酸、耐膽鹽和黏附定植能力等作為評(píng)價(jià)篩選潛在益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)就植物乳桿菌對胃腸道環(huán)境的適應(yīng)能力、黏附特性、對胃腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)和腸黏膜形態(tài)的影響等方面進(jìn)行綜述。

1 植物乳桿菌對仔豬胃腸道環(huán)境的耐受力

植物乳桿菌對動(dòng)物高胃酸環(huán)境和消化道內(nèi)膽鹽等形成的高滲環(huán)境的耐受力是評(píng)價(jià)其益生效果好壞的重要指標(biāo)。對胃內(nèi)pH值、腸道膽鹽等的耐受性是保證益生菌在宿主體內(nèi)存活和生長的前提，是其發(fā)揮益生作用的先決條件。新生仔豬胃內(nèi)pH值通常在5.0～6.0之間，仔豬在斷奶后1～2周pH值恢復(fù)到3.5左右[12]，但依然高于成年豬pH值2.0～3.5的水平，飼料在胃內(nèi)的停留時(shí)間一般為2～4 h。腸道中膽鹽的濃度一般在0.03%～0.3%的范圍內(nèi)[13]。

張飛燕等[14]從健康散養(yǎng)雞的雞糞便中分離得到的植物乳桿菌，在pH值2.0的條件下，存活率可達(dá)到86%以上，在膽鹽濃度為0.3%時(shí)，存活率有所下降，為53.7%，但繼續(xù)提高膽鹽濃度到0.4%時(shí)，存活率仍可保持在36%以上。許女等[15]從西藏Kefir粒中分離獲得植物乳桿菌MA2，菌株在培養(yǎng)基pH值為2的酸性環(huán)境中培養(yǎng)2 h后，活菌數(shù)下降了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，從108下降到106；在培養(yǎng)基中膽鹽濃度為0.3%時(shí)，活菌數(shù)也下降了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，但當(dāng)膽鹽濃度提高到0.5%時(shí)，活菌數(shù)下降到105，只降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)，表明植物乳桿菌MA2菌株具有良好的耐酸、耐膽鹽特性。隋夢等[16]從發(fā)酵米粉中篩選出的植物乳桿菌Zhang-LL，菌株在pH值1.5～3.0的酸性環(huán)境中培養(yǎng)3 h，活菌數(shù)只下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，菌液濃度可達(dá)106CFU/ml；在膽鹽濃度為0.10%～0.50%環(huán)境中培養(yǎng)8 h后，活菌數(shù)在105～107CFU/ml之間，表明獲得的分離株具有較強(qiáng)的耐受胃腸道酸性和高滲環(huán)境的特性。在模擬人工胃液和腸液環(huán)境條件的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌N59-1在pH值為3的人工胃液中培養(yǎng)3 h后，存活率仍可達(dá)到為89%以上，再從胃液轉(zhuǎn)移到腸液保持3 h后，N59-1的存活率仍大于80%[17]。

張艷萍等[18]以海藻酸鈉和脫脂乳作為混合壁材對植物乳桿菌A409微囊化，微囊化后對酸性條件、膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、人工胃液和人工腸液均有較高的耐受性，穩(wěn)定性良好。程福亮等[19]的研究表明，豬源植物乳桿菌誘變株BL-15耐酸性較好，其在酸性條件下存活菌落總數(shù)的對數(shù)值與對照組基本一致；在耐膽鹽試驗(yàn)中，存活菌落總數(shù)與對照組中菌落總數(shù)的對數(shù)值相差小于2，表明對酸和膽鹽耐受效果較好。孟祥晨等[20]的研究表明，兩株植物乳桿菌在pH值3的PBS緩沖溶液中保持3 h，活菌數(shù)均超過9 log CFU/ml，在0.3%的膽鹽濃度中孵育8 h和在1%的膽鹽濃度中孵育4 h后，兩株植物乳桿菌活菌數(shù)均維持在8 log CFU/ml，表明對低酸和高膽鹽有較好的耐受力。不同來源的植物乳桿菌可以抵抗胃液較強(qiáng)的酸性環(huán)境和耐受動(dòng)物消化道內(nèi)膽鹽等形成的高滲環(huán)境，順利地到達(dá)仔豬腸道并存活，從而為發(fā)揮其益生功能奠定了基礎(chǔ)。

2 植物乳桿菌的黏附及對致病菌的黏附抑制

黏附是益生菌定植于宿主腸道發(fā)揮生理作用的前提條件，是實(shí)現(xiàn)其益生功能的第一步[21-22]。通過競爭性占位，在宿主腸黏膜形成生物屏障，從而排斥或置換阻止病原菌的定植；黏附定植腸道的乳酸菌，在適宜的環(huán)境中迅速生長繁殖，同時(shí)產(chǎn)生大量的初級(jí)代謝或次級(jí)代謝產(chǎn)物（如有機(jī)酸、過氧化氫和細(xì)菌素等），這些產(chǎn)物有利于調(diào)節(jié)胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的平衡的和激發(fā)宿主胃腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育[22-23]。有研究表明，乳桿菌的黏附具有較強(qiáng)的種屬特異性和宿主特異性[22-23]。在體外評(píng)價(jià)和篩選益生菌時(shí)，其黏附定植能力是衡量益生菌活菌制劑效果的重要指標(biāo)之一。

凌晨等[24]報(bào)道，乳酸菌可以黏附于仔豬腸上皮細(xì)胞且表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。乳酸菌與沙門菌或大腸埃希菌的黏附競爭，與對照組相比，致病菌的黏附能力受到抑制，并且對致病菌的黏附抑制率也呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，高含量的乳酸菌對沙門菌、大腸埃希菌的排斥率均高達(dá)88%以上，置換率也均達(dá)到70%以上。但是，低含量的乳酸菌黏附排斥作用顯著下降，同時(shí)自身黏附細(xì)胞的能力也顯著下降，對沙門菌的置換在低劑量時(shí)效果較差，甚至出現(xiàn)負(fù)向效果，即不但沒有發(fā)揮置換作用，反而增加了沙門菌對細(xì)胞的黏附率。張莉[25]在研究中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌C88對氯仿的疏水性極強(qiáng)（＞80%），氯仿為單極、酸性溶劑，是電子受體，表明C88菌株是強(qiáng)電子供體，對二甲苯和乙酸乙酯也都有較強(qiáng)的疏水性，從而間接表明C88菌株可能具有較強(qiáng)的黏附腸上皮細(xì)胞的能力。乳酸菌對Caco-2細(xì)胞的黏附試驗(yàn)表明，菌株C88對Caco-2單層細(xì)胞的黏附率高于鼠李糖乳桿菌GG；在黏附競爭試驗(yàn)中，菌株C88對四種致病菌（大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌和福氏志賀氏菌）抑制率為22%～71%不等，對四種致病菌的排斥作用和置換作用也很強(qiáng)，除排斥試驗(yàn)中的沙門氏菌外，其他都達(dá)到了極顯著的水平。有研究發(fā)現(xiàn)L.plantarumCS24.2能夠抑制30%～90%腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸炎沙門氏菌血清型傷寒沙門氏菌在人體腸上皮細(xì)胞Caco-2的定植，Dhanani等[26-27]的研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌黏附素EF-Tu在黏附腸道組織和抑制腸道病原體中發(fā)揮重要作用。Dhanani等[28]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CS24.2能抑制大腸桿菌O26∶H11對HT-29細(xì)胞的黏附，在大腸桿菌感染HT-29細(xì)胞后，并下調(diào)了細(xì)胞中TNF-α和IL-8的基因表達(dá)。Ren等[29]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能強(qiáng)烈抑制金黃色葡萄球菌對Caco-2細(xì)胞的黏附作用。

很多因素會(huì)影響乳酸菌黏附腸道上皮細(xì)胞，細(xì)菌自身因素如細(xì)菌生長時(shí)期、菌液濃度、乳酸菌細(xì)胞壁表面存在的壁磷壁酸、脂磷壁酸、肽聚糖、S層蛋白、相關(guān)表面蛋白和細(xì)胞分泌的胞外多糖等黏附素[30]；動(dòng)物因素如腸道內(nèi)pH值、溫度和腸道黏液的組分等。研究表明，乳酸菌的黏附定植具有屬種特異性和劑量效應(yīng)，對病原菌的抑制效果也與劑量、代謝產(chǎn)物等因素有關(guān)，動(dòng)物黏附效應(yīng)已經(jīng)被多數(shù)試驗(yàn)證明是益生菌抵抗致病菌的重要影響因子[31]，但具體的分子作用機(jī)制還不是很清楚。目前用于乳酸菌黏附特性評(píng)價(jià)的體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕屑?xì)胞模型、腸黏液模型和組織器官模型三類，但這些模型各具優(yōu)劣，能真實(shí)反映乳酸菌在宿主腸道黏附效果，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的乳酸菌黏附機(jī)制評(píng)價(jià)模型尚未建立。另也有不同的報(bào)道，如有人給17名健康志愿者每天兩次，連續(xù)服用18 d含6×109CFU的益生菌凍干粉A(L.plantarumMF1291，MF1298)和B(L.pentosusMF1300，L.salivariuDC5，L.plantarum DC13)，結(jié)果從糞便中不能監(jiān)測到L.plantarumDC13,在清除期的第24 d和30 d，從糞便中也不能監(jiān)測到L.plantarumMF1291和L.salivariuDC5[32]。因此益生菌在腸道中的黏附和定植是否是益生菌發(fā)揮生物活性的必須要素還需要進(jìn)一步的證實(shí)。

3 乳酸菌對腸道微生物多樣性的影響

在健康仔豬胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)中，絕大多數(shù)的乳酸菌菌種對仔豬的健康是有益的，并且乳酸菌屬厚壁菌門，是腸道最占優(yōu)勢的菌群之一；相反，腸桿菌科中很多菌種對動(dòng)物是有害的，腸桿菌屬變形菌門，一般是致病菌或者條件致病菌。因此，創(chuàng)造有利乳酸菌生長繁殖的條件，提高乳酸菌在腸道菌群中的豐度，減少致病菌的數(shù)量是保證仔豬腸道健康的關(guān)鍵。

益生菌可以提高腸道菌群的多樣性，抑制致病菌的生長繁殖，從而實(shí)現(xiàn)維持腸道微生物群落的動(dòng)態(tài)平衡[33]。已有研究表明，乳酸菌能選擇性促進(jìn)有益菌群的繁殖，提高腸道有益優(yōu)勢菌群所占比例，抑制有害微生物的生長，從而有效調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，Guerra-Ordaz等[4]報(bào)道，對斷奶仔豬飼喂植物乳桿菌[2×1010CFU/(頭·d)]8 d后，進(jìn)行ETEC K88攻毒試驗(yàn)，在攻毒后第6 d和第10 d屠宰，評(píng)價(jià)植物乳桿菌控制斷奶后仔豬大腸桿菌病的潛力，結(jié)果表明益生菌組顯著增加了植物乳桿菌在回腸和結(jié)腸中的數(shù)量，在結(jié)腸中的總?cè)樗峋鷶?shù)量也顯著增加，并顯示出減少腹瀉的趨勢。飼喂植物桿菌發(fā)酵飼料有益于豬抗沙門氏菌感染，影響或減少豬糞中腸桿菌科的數(shù)量[8-9]。趙秀英等[10]研究報(bào)道，斷奶前給仔豬飼喂植物乳桿菌和干酪乳桿菌，植物乳桿菌可顯著提高斷奶前回腸、結(jié)腸菌群多樣性和提高腸道乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量。與斷奶前相比，斷奶后3 d三組菌群多樣性都有所下降，表明腸道菌群的多樣性易受斷奶應(yīng)激的影響，但植物乳桿菌組的菌群多樣性依然顯著高于其他組，表明植物乳桿菌能緩解斷奶對菌群造成的影響，到斷奶后2周時(shí)，植物乳桿菌組菌群多樣性顯著高于對照組，并可促進(jìn)回腸、結(jié)腸乳酸菌和雙歧桿菌的生長。Tajima等[6]報(bào)道，用植物乳桿菌發(fā)酵液體飼料喂仔豬，與對照組和抗生素組相比，可以提高仔豬回腸和盲腸中細(xì)菌的多樣性，但三個(gè)處理組回腸中的大部分細(xì)菌序列屬于乳酸菌，占總細(xì)菌序列的92%以上。在盲腸中，對照組和抗生素組仍是乳酸菌占主導(dǎo)地位，分別占59%和64%。但在液體發(fā)酵飼料組中乳酸菌占總細(xì)菌序列的比例下降至31%，但厚壁菌門中的Dorea屬、糞球菌屬、羅斯氏菌屬和柔嫩梭菌豐度增加，胃腸道中的細(xì)菌多樣性增強(qiáng)。Kobashi等[7]報(bào)道，飼喂植物乳桿菌發(fā)酵液體飼料，仔豬糞便中乳酸菌的數(shù)量由斷奶時(shí)的8.77×108CFU/g DM，在斷奶后第28天增加至1.23×1012CFU/g DM，表明飼喂發(fā)酵液體飼料可以增加腸道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量。幾乎分離獲得的大腸桿菌菌株在斷奶后14 d內(nèi)全部耐金霉素，在斷奶后第28 d，發(fā)酵液體飼料組的耐金霉素的大腸桿菌菌株降低至22.2%，而對照組中的耐藥菌比例為88.9%，顯示飼喂發(fā)酵液體飼料會(huì)減少抗生素抗性細(xì)菌。

De Angelis等[34]報(bào)道，乳酸菌黏附和定植在腸道后，成為腸道正常菌群的成員，能夠阻止腸道細(xì)菌移位和調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡。Fuentes等[35]報(bào)道，口服活的植物乳桿菌或者復(fù)合益生菌制劑有效地抑制斷奶仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量，增加腸道有益菌如乳酸菌、雙歧桿菌的多樣性和數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。

4 乳酸菌對腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

單胃動(dòng)物蛋白質(zhì)的60%～70%是在小腸消化，因此小腸通常被認(rèn)為是仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，通過營養(yǎng)調(diào)控手段，促進(jìn)腸絨毛的發(fā)育和改善微絨毛結(jié)構(gòu)，可以增加小腸內(nèi)壁表面積，從而提高對營養(yǎng)素的吸收效率。絨毛之間的隱窩是絨毛新細(xì)胞的來源，當(dāng)絨毛損傷脫落時(shí)，隱窩細(xì)胞會(huì)向絨毛頂移行，并形成新的腸絨毛，隱窩深度是衡量腸上皮細(xì)胞更新速度的指標(biāo)，隨著細(xì)胞成熟率的上升，隱窩逐漸變淺，并且細(xì)胞的分泌功能增強(qiáng)。絨毛高度與隱窩深度比值能綜合反映小腸的功能狀態(tài)，當(dāng)腸黏膜受損時(shí)，則比值下降，表明動(dòng)物的消化吸收功能下降[36-37]。

腸道是重要的營養(yǎng)吸收器官，腸絨毛高度、隱窩深度等都是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。Gao等[37]的研究表明絨毛高度/隱窩深度能夠綜合反映小腸的功能狀態(tài)，其比值的下降，表明黏膜受損、消化吸收功能下降。劉虎傳等[38]研究結(jié)果表明，給斷奶仔豬飼喂乳酸菌后，可顯著提高28、35 d和42 d仔豬空腸和回腸絨毛的高度，顯著降低35、42 d仔豬空腸和28、35 d回腸的隱窩深度，顯著增加盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的含量，緩解了斷奶應(yīng)激對仔豬腸道內(nèi)環(huán)境的影響。Guerra-Ordaz等[4]報(bào)道，斷奶仔豬飼喂植物乳桿菌10 d后（2×1010CFU/d），回腸絨毛高度和杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，結(jié)腸消化道中氨的濃度降低，腸道內(nèi)環(huán)境得到改善。Suo等[5]研究表明，斷奶仔豬飼喂植物乳桿菌ZJ316 60 d后，提高了斷奶仔豬十二指腸、空腸以及回腸的絨毛高度，明顯促進(jìn)了小腸絨毛的發(fā)育，從而有利于提高對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而促進(jìn)仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的提高。

縣怡涵等[11]報(bào)道，仔豬從7日齡開始至24日齡隔日灌喂植物乳桿菌菌液，結(jié)果表明，能促進(jìn)35日齡斷奶仔豬空腸和回腸絨毛發(fā)育，增加了空腸絨毛的高度，顯著提高回腸隱窩深度，有增加回腸絨毛高度，降低絨腺比的趨勢。使用植物乳桿菌，能明顯改善腸道黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的生長，增加絨毛長度/隱窩深度。另外，植物乳桿菌NCU116能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞的增殖，并且提高黏蛋白的分泌量，增加腸道黏膜的完整性，有效增強(qiáng)了腸道上皮的屏障防御能力[39]。

5 小結(jié)

植物乳桿菌是動(dòng)物腸道正常的有益菌群之一，是生產(chǎn)實(shí)踐中選擇制備益生菌制劑的常用菌種，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑制有害菌定植、增強(qiáng)腸黏膜免疫等作用，但其作用效果受菌株屬種特異性、菌株劑量效應(yīng)、動(dòng)物個(gè)體生理差異等諸多因素影響，常導(dǎo)致研究應(yīng)用中效果不確實(shí)。目前就乳酸菌的研究，主要集中在乳酸菌的益生功能和其代謝產(chǎn)物方面，但關(guān)于代謝產(chǎn)物對宿主的作用模式、如何調(diào)控宿主的基因表達(dá)及維持微生物區(qū)系穩(wěn)定的分子機(jī)制等的研究還較少。益生菌的益生效應(yīng)不僅是在腸道的黏附定植和對致病菌抑制，更重要的是如何改變腸道菌群的組成，使之與有害菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制致病菌的生長和對宿主形成免疫應(yīng)答刺激。在今后的研究中，應(yīng)在細(xì)胞和分子水平上探討就菌株發(fā)揮作用的有效成分、養(yǎng)分吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附抑制和刺激腸黏膜免疫的機(jī)制。

腸道微生態(tài)的平衡是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到宿主和微生物間及微生物和微生物間復(fù)雜的調(diào)控反應(yīng)，飼料營養(yǎng)水平、消化道內(nèi)環(huán)境、宿主免疫系統(tǒng)、抗生素的使用和仔豬哺乳斷奶情況等宿主因素均會(huì)影響腸道微生物組成與分布。利用分子生物學(xué)手段，不斷深入探討腸道生態(tài)系統(tǒng)和宿主間的關(guān)系，通過膳食纖維、短鏈脂肪酸、菌群代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)手段調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)影響宿主代謝狀態(tài)，配合微生物基因組技術(shù)闡明微生物菌群關(guān)鍵成員發(fā)揮作用的分子機(jī)制，證明腸道菌群的改變與發(fā)生炎癥性疾病、肝病、肥胖和腸癌等腸道疾病之間的關(guān)系，將為促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體健康、預(yù)防和治療疾病提供理論基礎(chǔ)，隨著對乳酸菌研究的不斷深入，將會(huì)出現(xiàn)更多的功能性添加劑產(chǎn)品，并在未來的應(yīng)用中發(fā)揮重要的作用。