楊秀娟， 楊志軍， 李 碩△， 吉秀家， 寧艷梅， 王 燕

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 2. 甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)是典型的抗腫瘤藥，同時具有顯著的骨髓抑制作用，可損傷骨髓的造血干細(xì)胞，使外周紅細(xì)胞數(shù)量降低[1]，引起貧血。貧血屬于中醫(yī)血虛范疇，血虛證是指血液不足或血的濡養(yǎng)功能減退的病理狀態(tài)[2]。中醫(yī)認(rèn)為，有形之血生于無形之氣，氣為血之帥，血為氣之母，氣能生血，故在治療血虛病證，使用補(bǔ)血藥時，同時還應(yīng)與補(bǔ)氣藥相配。黃芪與當(dāng)歸是中醫(yī)學(xué)應(yīng)用于血虛病證中常見的配伍組合，以常用的黃芪-當(dāng)歸5∶1的當(dāng)歸補(bǔ)血湯為多見，具有促進(jìn)造血、增強(qiáng)免疫等功能。

紅芪是豆科植物多序巖黃芪(HedysarumpolybotrysHand. Mazz.)的干燥根，藥性微溫、味甘，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽，生津養(yǎng)血，行滯通痹等功效[3]。其最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》黃芪項(xiàng)下，并列為上品。在歷代本草文獻(xiàn)中，黃芪項(xiàng)下的“赤水耆”“赤色者”即為西北地區(qū)應(yīng)用歷史悠久的紅芪，認(rèn)為紅芪是黃芪的優(yōu)良品種[4]。自1985 年版《中國藥典》開始，將紅芪單列為一種中藥，現(xiàn)主要分布在甘肅隴南、天水、定西等地區(qū)，為甘肅十大隴藥之一，具有悠久的生產(chǎn)歷史[5]。黃芪-當(dāng)歸以5∶1配伍，其中當(dāng)歸可養(yǎng)血，黃芪可補(bǔ)氣生血，二者在補(bǔ)血作用中配伍相得益彰。紅芪與黃芪具有相似的功效，紅芪與當(dāng)歸配伍是否具有一定補(bǔ)血作用并未見相關(guān)報道，本課題將對紅芪單味藥、黃芪單味藥、紅芪-當(dāng)歸、黃芪-當(dāng)歸配伍進(jìn)行血瘀模型小鼠補(bǔ)血作用的研究，以期為紅芪在臨床上的應(yīng)用及開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種小鼠，SPF級，6～8周齡，體重18～22 g，雌雄各半，共70只，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，動物許可證號：SCXK(甘)2010-0001，動物實(shí)驗(yàn)合格證號：0000981。

1.2 藥品與試劑

紅芪、黃芪、當(dāng)歸藥材分別購自武都、隴西和岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊扶德教授鑒定紅芪為豆科植物多序巖黃芪(HedysarumpolybotrysHand. Mazz.)的干燥根；黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch )Bge.var.mongholicus(Bge)Hsiao)的干燥根；當(dāng)歸為傘科形多年生草本植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diele的干燥根。驢膠補(bǔ)血顆粒(批號：201607011H，國藥準(zhǔn)字：Z43021017)；驢膠補(bǔ)血顆粒根據(jù)成人臨床劑量40 g/(kg·d)按體表系數(shù)換算為等效劑量即驢膠補(bǔ)血顆粒給藥劑量為5.2 mg/(kg·d)，使用前用純凈水配置；環(huán)磷酰胺(批號：16092125，江蘇恒瑞)；煌焦油藍(lán)染液(批號：20170315， 北京索萊寶科技有限公司)；PBS緩沖液(批號：20160325，北京索萊寶科技有限公司)；瑞氏染液(批號：G1040，規(guī)格：500 ml)；生理鹽水(批號：1612193201，石家莊四藥有限公司)。

1.3 儀器

MH-1000調(diào)溫型電熱套(京科偉永興儀器有限公司)；HX-7型電子天平(慈溪市天東衡器廠)；AL104型電子分析天平(METTLER TOLEDO，瑞士)；EV311型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京萊佰泰科技有限公司)；BC-5390型動物血細(xì)胞分析儀(邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；微量采血管40 μl(批號20130716，淄博來緒醫(yī)用器材有限公司)； BX51-H01型倒置顯微鏡成像系統(tǒng)(奧林巴斯)。

1.4 紅芪及不同配伍樣品的制備

稱取適量紅芪、黃芪原藥材經(jīng)切制后，分別稱取80 g置水中浸泡1 h，加10倍量水煎煮1 h，濾取濾液；將剩余藥渣加入8倍量水煎煮0.5 h，過濾合并濾液，濃縮至200 ml紅芪、黃芪水煎液(含藥量0.40 g·ml-1)，紅芪-當(dāng)歸，黃芪-當(dāng)歸各96 g操作同上(含藥量0.48 g·ml-1)，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血虛小鼠模型建立[6]

小鼠常規(guī)飼喂7 d適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為7組，每組10只，稱取體重并記錄。除空白對照組外，其余各組在第1日、3日腹腔注射環(huán)磷酰胺80.0 mg·kg-1造模。以外周血象中紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte, LYM)、白細(xì)胞(white blood cell, WBC)、紅細(xì)胞壓積(hematocrit, HCT)的量下降為評判依據(jù)。

1.6 分組、給藥及樣品取材

將70只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對照組、紅芪組、黃芪組、紅芪-當(dāng)歸(5∶1)組和黃芪-當(dāng)歸(5∶1)組。實(shí)驗(yàn)開始每天給予空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，陽性對照組灌胃驢膠補(bǔ)血顆粒藥液5.2 mg·kg-1，紅芪及黃芪水煎液組灌胃3.9 g·kg-1，紅芪-當(dāng)歸組(5∶1)和黃芪-當(dāng)歸組(5∶1)灌胃4.68 g·kg-1，每天1次，連續(xù)7 d，給藥期間，記錄小鼠體重及體征變化。

末次給藥24 h后眼眶取血加入已添加EDTA的采血管內(nèi)，全血采用全自動血細(xì)胞分析儀檢測外周血象中紅細(xì)胞(RBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)等。眼眶取血用于網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，并觀察紅細(xì)胞的形態(tài)，取脾臟、胸腺，分別稱重計(jì)算脾臟指數(shù)(spleen index, SI)，胸腺指數(shù)(thymus index, TI)；收集股骨，用于骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將股骨浸泡至4%的甲醛中。

1.7 證候?qū)W觀察

實(shí)驗(yàn)開始后，每天稱量小鼠體重，并以小鼠耳緣、鼻唇顏色，皮毛狀態(tài)，以及飲食，運(yùn)動情況等作為證候?qū)W觀察指標(biāo)。

1.8 外周血象指標(biāo)及網(wǎng)織紅細(xì)胞的檢測[7-8]

取全血采用全自動血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)和血小板(platelet, PLT)數(shù)量的變化。

小鼠眼眶采血20 μl于已添加等量煌焦油藍(lán)染液的離心管內(nèi)，充分混勻，靜置15 min，取一滴推抹4 cm長薄血膜片，待自然干燥后，用油鏡觀察血片中央?yún)^(qū)計(jì)數(shù)1000個紅細(xì)胞中的網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte, RC)數(shù)值，以百分?jǐn)?shù)表示，并觀察其形態(tài)。

1.9 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)[9]

末次給藥24 h后，眼眶內(nèi)眥靜脈采集血液，隨后各組小鼠脫頸椎處死，分離出兩側(cè)股骨。取右側(cè)股骨，擦拭干凈，用2 ml生理鹽水沖出骨髓細(xì)胞，過濾制成單個骨髓細(xì)胞懸液。1 500 r/min離心5 min后，棄去上清液，再用3 ml生理鹽水稀釋，混勻。然后通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)(marrow karyocyte, MK)。

1.10 骨髓切片制備與處理

將左側(cè)股骨浸入4%中性甲醛內(nèi)固定2 h，再用2%的硝酸脫鈣2 h，水洗2次，室溫下乙醇梯度脫水各2次，然后用甲液、乙液順序浸透各12 h，用包埋液封閉，放入-20℃冰箱內(nèi)過夜，第2日進(jìn)行切片，蘇木素-姬姆薩-伊紅染色，最后置于光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓增生程度及造血細(xì)胞變化。

1.11 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)

小鼠取血后處死，取胸腺、脾臟稱重，以 mg/g單位計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)(SI)=脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)；胸腺指數(shù)(TI)=胸腺質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血象指標(biāo)的變化

與空白組比較，模型組中WBC、LYM、PLT、HCT、RBC的含量都顯著降低(P<0.01)，表明血虛模型復(fù)制成功；與模型組比較，陽性對照組、紅芪-當(dāng)歸組、黃芪-當(dāng)歸組中WBC、LYM、PLT、HCT、RBC含量顯著升高(P<0.01，P<0.05)，紅芪與黃芪組中WBC、LYM的含量升高(P<0.05)，結(jié)果表明陽性對照組、紅芪-當(dāng)歸組、黃芪-當(dāng)歸組對血虛小鼠外周血象的改善作用優(yōu)于紅芪、黃芪單味藥組，陽性對照組與黃芪-當(dāng)歸組效果更佳(表1)。

Tab. 1 Effects of drugs on peripheral hemogram in mice n=10)

WBC： White blood cell; LYM： Lymphocyte; PLT： Platelet; HCT： Hematocrit; RBC： Red blood cell

**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsHedysari group;●P<0.05,●●P< 0.01vsAstragalus group;○P<0.05,○○P<0.01vsHedysari-Angelica group

2.2 對小鼠骨髓有核細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞的影響

與空白組比較，模型組小鼠中RC、MK均顯著降低(P<0.01)，結(jié)果表明模型復(fù)制成功。與模型組比較，陽性對照組、紅芪-當(dāng)歸組、黃芪-當(dāng)歸組可顯著升高RC、MK的含量(P<0.01)，紅芪組可升高網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽性對照組改善骨髓的造血功能較優(yōu)、較強(qiáng)，給藥組中紅芪-當(dāng)歸組、黃芪-當(dāng)歸組改善骨髓的造血功能較優(yōu)(表2)。

GroupRC (individual/L)MK (cells/106)Blank control2.95±0.75307.10±34.17Model1.84±0.31??215.70±33.70??Positive control2.36±0.37##282.50±55.16##Hedysari 2.19±0.32#241.20±34.00Astragalus2.05±0.51238.10±40.74Hedysari-Angelica2.52±0.21##△●260.50±25.96##Astragalus-Angelica2.21±0.28#○248.40±31.38#

**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsHedysari group;●P<0.05vsAstragalus group;○P<0.05vsHedysari-Angelica group

2.3 骨股病理切片觀察

與空白組比較，模型組股骨中造血細(xì)胞疏松，紅細(xì)胞、巨細(xì)胞減少，說明模型復(fù)制成功。與模型組比較，紅芪、紅芪-當(dāng)歸(5∶1)、黃芪-當(dāng)歸(5∶1)中紅細(xì)胞、巨細(xì)胞數(shù)目增多，造血細(xì)胞排列緊密。紅芪、紅芪-當(dāng)歸(5∶1)、黃芪-當(dāng)歸(5∶1)可改善骨股的病理狀態(tài)(圖1)。

Fig.1Marrow cell of thighbone in rats observed under the microscopic(HE ×40)

A： Blank group; B： Model group; C： Hedysari group; D： Astragalus group; E： Hedysari-Angelica group; F： Astragalus-Angelica group

2.4 對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組脾臟、胸腺明顯萎縮，脾臟及胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，陽性對照組、給藥組紅芪、黃芪、紅芪-當(dāng)歸、黃芪-當(dāng)歸組可顯著升高脾臟及胸腺指數(shù)(P<0.01，表3)。

GroupSITIBlank control6.76±0.583.62±0.43Model5.00±0.81??2.95±0.52??Positive control7.92±1.55##3.51±0.46#Hedysari 7.40±0.65##3.41±0.41#Astragalus7.29±0.51##3.42±0.41#Hedysari-Angelica7.87±0.40##△3.48±0.27#Astragalus-Angelica8.92±1.32##△△●●○3.53±0.30#

SI： Spleen Index; TI： Thymus index

**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsHedysari group;●●P<0.01vsAstragalus group;○P<0.05vsHedysari-Angelica group

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為：引發(fā)血虛證病因多為失血過多，或脾胃虛弱，血液生化乏源，或瘀血阻滯新血不生等。血虛證在臨床上表現(xiàn)為面色淡白或萎黃，唇舌爪甲色淡，頭暈眼花，心悸多夢，手足發(fā)麻等。中醫(yī)認(rèn)為，髓由先天之精所化生，由后天之精所充養(yǎng)，有養(yǎng)腦、充骨、化血之功，髓居骨中可化生血液?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗罚骸肮撬鑸?jiān)固，氣血皆從” 。因此從骨髓造血方面出發(fā)可研究血虛證的本質(zhì)[10]。

CTX是對抗惡性腫瘤重要的化療藥物，但在應(yīng)用過程中可造成骨髓抑制，血細(xì)胞減少等貧血不良反應(yīng)[11-12]。貧血為中醫(yī)血虛范疇，中醫(yī)認(rèn)為扶正固本，補(bǔ)氣養(yǎng)血是其根本。黃芪與當(dāng)歸以5∶1相配的當(dāng)歸補(bǔ)血湯有很好的補(bǔ)血作用，當(dāng)歸為傳統(tǒng)的補(bǔ)血養(yǎng)血之品，配以黃芪補(bǔ)氣固本，以無形之氣化生有形之血。紅芪為甘肅的道地藥材，有學(xué)者采用超濾與醇沉對黃芪與紅芪抗腦缺血的影響及紅芪多糖對大鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響進(jìn)行研究[13-14]。由于紅芪與黃芪功效相似，均可補(bǔ)氣養(yǎng)血，治療血虛證。本課題旨在研究紅芪、黃芪、紅芪-當(dāng)歸(5∶1)、黃芪-當(dāng)歸(5∶1)兩種單味藥物及兩種配伍藥對應(yīng)用于血虛證模型后，比較其拮抗骨髓抑制及補(bǔ)血作用的差異。

本課題采用阿膠補(bǔ)血顆粒作為陽性對照組，研究結(jié)果表明陽性對照組在改善外周血象及骨髓的造血功能方面均有較好的作用，陽性對照組與給藥組比較效果較優(yōu)，選用驢膠補(bǔ)血顆粒作為陽性對照品合理，準(zhǔn)確。給藥組中紅芪-當(dāng)歸(5∶1)與黃芪-當(dāng)歸(5∶1)相配可拮抗骨髓抑制，增加骨髓有核細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目，并可升高外周血象中白細(xì)胞、紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的數(shù)量，各組對環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制小鼠的血液生理指標(biāo)均有不同程度的改善作用，補(bǔ)血作用優(yōu)于紅芪、黃芪單味藥組，黃芪-當(dāng)歸(5∶1)在外周血象改善方面較優(yōu)于紅芪-當(dāng)歸(5∶1)。中醫(yī)理論認(rèn)為：氣為血之帥，血為氣之母。補(bǔ)血藥中需配補(bǔ)氣藥同用，黃芪與紅芪均可補(bǔ)益脾氣，脾為氣血生化之源，與當(dāng)歸配伍，可增強(qiáng)當(dāng)歸的補(bǔ)血養(yǎng)血作用。本研究從藥理學(xué)角度探討紅芪、黃芪單味藥及與當(dāng)歸配伍藥對的補(bǔ)血作用差異，為紅芪、黃芪、當(dāng)歸的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。