朱洪竹， 張 瑩， 朱梅菊， 伍人樂， 曾志剛

(井岡山大學(xué)體育學(xué)院， 江西 吉安 343009)

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是在腦內(nèi)合成分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)(主要表達(dá)于海馬組織)的一種蛋白質(zhì)[1]，除對神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用外，還能促進(jìn)受損神經(jīng)元修復(fù)和再生，對缺血性腦損傷具有較強保護(hù)作用[1-3]。酪氨酸激酶B(tyrosine kinase receptor B, TrkB)是BDNF的功能性受體, BDNF發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用依賴其受體TrkB的激活, BDNF/TrkB在各種腦損傷時神經(jīng)元修復(fù)和挽救退行性病變神經(jīng)元死亡有重要作用。而大強度的超負(fù)荷訓(xùn)練會引起運動員疲勞，也常常會導(dǎo)致腦組織損傷[4], 影響運動員成績和身心健康。最近研究顯示, BDNF在抵抗大強度運動性海馬神經(jīng)元損傷中有重要作用[4]。螺旋藻是一種生活在熱帶海洋中的藻類植物，其有效成分是螺旋藻多糖，具有多種生物學(xué)功能，它可以中和運動后過多的乳酸，提高機體組織抗氧化能力，有利于身體疲勞的恢復(fù)等?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)螺旋藻有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。但有關(guān)螺旋藻對大強度運動所致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用研究較少。而目前尚未闡明螺旋藻能否通過其對BDNF/TrkB神經(jīng)營養(yǎng)信號的調(diào)節(jié)表現(xiàn)出抗運動疲勞大鼠海馬神經(jīng)元損傷。本研究采用遞增大強度跑臺運動疲勞模型[6-7]，觀察BDNF/TrkB神經(jīng)營養(yǎng)信號在運動疲勞大鼠海馬神經(jīng)元損傷中的作用及螺旋藻改善運動致腦海馬損傷的可能作用機制，為螺旋藻在體育運動實踐中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

60只雄性清潔級SD大鼠，4周齡，體質(zhì)量(140±20)g，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心湖南斯萊克景達(dá)實驗動物公司提供(SCXK(湘)2011-0003)。清潔級環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機將大鼠分為正常對照組(NC組)、正常+螺旋藻灌胃組(NS組)、運動模型組(EM組)、運動+螺旋藻灌胃組(ES組)、陽性對照組(運動+人參提取物，PC組)，共5組，每組12只。分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水, 室溫(22± 0.5)℃，濕度40%～60%。

1.2 人參提取物制備

因人參是公認(rèn)的抗疲勞的中藥[8]，故選為陽性對照藥。將云南產(chǎn)人參40 g，用蒸餾水浸泡30 min，按文獻(xiàn)[9]方法制備人參提取物4 g。提取物中每mg相當(dāng)于0.01 g生藥。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥物灌胃處理

NS組和ES組按每天300 mg/kg體重灌胃螺旋藻，臨用前螺旋藻用生理鹽水稀釋。灌胃體積2 ml/只，每周7 d，1次/天，連續(xù)3周。NC組和EM組以同等體積生理鹽水灌胃。PC組以同等體積的人參提取物(1.92 g/kg)灌胃[9]。以上灌胃均在運動前2 h內(nèi)進(jìn)行。

1.4 運動方案

除NC組和NS組外，其余組大鼠采用跑臺運動方式，對大鼠進(jìn)行遞增大強度跑臺運動訓(xùn)練，主要實驗儀器為ZH-PT動物實驗跑臺(安徽淮北正華)。坡度為零，訓(xùn)練時間3周，7天/周，每天1次，并每天觀察并記錄大鼠的一般情況。本運動方式參照汶希等[6-7]建立的大鼠跑臺運動疲勞模型，具體見表1。NC組和NS組均在同樣條件下常規(guī)喂養(yǎng)，但不進(jìn)行跑臺運動。

1.5 主要設(shè)備與試劑

PM-10AD型光學(xué)顯微鏡，OLYMPUS公司，日本；圖像分析系統(tǒng)(用日本JVC公司的3-CCD攝像頭與Image-Pro Plus圖像處理軟件)；Quantity One凝膠電泳圖像軟件分析系統(tǒng)，美國。

兔抗鼠BDNF、TrkB、p-TrkB為多克隆抗體，購于Santa Cruze有限公司。螺旋藻膠囊：深綠色粉末，由云南施普瑞生物公司提供，國藥準(zhǔn)字：Z53020227。

1.6 實驗取材

實驗?zāi)?，分批麻?水合氯醛，10%)各組大鼠。打開胸腔，暴露心臟，剪破右心耳，左心室插管灌入冷生理鹽水和4%多聚甲醛，灌注完后斷頭，打開顱腔取出全腦，剝離海馬組織，置10%甲醛溶液中固定，待作光鏡標(biāo)本和免疫組化檢測。另取新鮮海馬組織，置液氮凍存后待作免疫印跡法(Western blot)檢測p-TrkB表達(dá)。

1.7 海馬光鏡標(biāo)本的制作與觀察

從固定液中取出海馬組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(厚度度5 μm)，進(jìn)行尼氏染色。顯微鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測BDNF、TrkB表達(dá)

常規(guī)方法制作海馬石蠟切片(厚度3 μm)，用SABC法進(jìn)行BDNF、TrkB免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按試劑盒的說明進(jìn)行規(guī)范操作(BDNF、TrkB一抗工作濃度分別為： 1∶100、1∶150)。用顯微鏡與圖像分析系統(tǒng)來檢測陽性表達(dá)。測定免疫組化陽性染色的光密度(OD)值，取平均值作為測定值，其值越大表示BDNF、TrkB陽性產(chǎn)物表達(dá)越強。

Tab.1 The training program of the rat model during the experiment(m/min× min)

1.9 Western blot檢測p-TrkB表達(dá)

用Quantity One凝膠電泳圖像軟件系統(tǒng)分析，以所拍膠片的(蛋白條帶中的灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值)的比值大小表示。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重等一般情況的變化

正常對照NC組和正常+螺旋藻灌胃NS組體重持續(xù)均衡增長，活動正常。運動模型EM組大鼠從第2周起體重增長緩慢，第3周起體重呈負(fù)增長，出現(xiàn)形體消瘦，目光呆滯，毛松，活動次數(shù)減少等疲勞癥狀。補充螺旋藻的ES組和陽性對照PC組要好于EM組，體重雖增長較慢，但未出現(xiàn)負(fù)增長，少見毛發(fā)稀少、嗜睡等現(xiàn)象(表2)。

Tab.2 Changes of body weight of rats in the groups during the experirnent(g)

NC: Normal control group; NS: Normal plus spirulina group; EM: Exercise model group; ES: Exercise plus spirulina group; PC: Positive control group(PC)

Before the experirnentn=12, the second weekend of experirnentn=11, the third weekend of experirnent,n=10

*P<0.05,**P<0.01vsthe same time of NC group;##P<0.01vsthe corresponding time point of EM group

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下NC組和NS組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，多數(shù)細(xì)胞呈圓形或橢園形，細(xì)胞尼氏小體明顯，著色清晰。EM組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)異常明顯，神經(jīng)元分布少且紊亂，細(xì)胞層次不清，胞體和胞核縮小，細(xì)胞尼氏小體消失或不見。ES組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列漸趨整齊，層次較明顯，細(xì)胞形態(tài)漸趨正常，尼氏小體增多，著色較明顯，其受損神經(jīng)元的改善效果明顯要好于EM組，與PC組漸趨接近(圖1)。

2.3 各組大鼠海馬區(qū)BDNF/TrkB免疫組化檢測結(jié)果

如圖2～圖3(箭頭所指為陽性細(xì)胞表達(dá))和圖4所示，正常對照NC和NS組海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白有基礎(chǔ)表達(dá)，陽性細(xì)胞少且染色淺。運動模型EM組大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)逐漸增加，其陽性染色平均光密度值較NC組有明顯差別(P<0.01)。螺旋藻干預(yù)的ES組海馬區(qū)BDNF、TrkB表達(dá)量明顯增多，染色加強，與EM組相比，有顯著差異(P<0.05或P<0.01)；且顯著高于NS組(P< 0.01)，與陽性對照PC組相比，已無明顯差別(P> 0.05)。

Fig.1Pathological changes of hippocampal CA1 among each group(Nissl staining ×200)

The arrows in NC group and NS group of Fig. 1 indicated that the hippocampal neuron cells were complete, and the obvious Nissl bodies were clearly colored.The arrows in EM group indicated that the cells morphology were abnormal and unclear cell layer, and some Nissl bodies disappear.The arrows in ES group indicated that the injuried neurons improved and were better than that of EM group and closer to PC group

Fig.2Changes of BDNF expression in hippocampal among each group(Immunohistochemistry slice ×400)

Fig.3Changes of TrkB expression in hippocampal among each group(Immunohistochemistry slice ×400)

The arrows in the group of Fig. 2 and Fig. 3 indicated that the granules were positive expression in hippocampal neurons

Fig.4Changes of BDNF/TrkB mean optical density in hippocampal of the groups(n=6)

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,# #P<0.01vsEM group;▲P<0.01vsES group

2.4 各組大鼠海馬組織p-TrkB Western blot檢測結(jié)果

由圖5可見，與NC組和NS組比較，其余各組大鼠海馬p-TrkB蛋白表達(dá)均明顯升高(P均< 0.01)。螺旋藻補充3周后，ES組的p-TrkB蛋白表達(dá)顯著高于EM組和NS組(P均<0.01)，其蛋白表達(dá)水平稍低于PC組(P>0.05)。

Fig.5Changes of the relative p-TrkB protein expression of the hippocampal of rats in five groups(n=3)

**P<0.01vsNC group;# #P<0.01vsEM group;▲P<0.01vsES group

3 討論

3.1 螺旋藻補充對運動大鼠體重等一般情況和海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

本實驗結(jié)果顯示，運動模型組(EM組)大鼠出現(xiàn)活動次數(shù)減少，體重下降，食欲減退，毛發(fā)欠光澤稀疏等疲勞癥狀，與前期報道相似[9]。本課題組在前期實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，與正常對照大鼠相比，運動模型EM組大鼠血清尿素氮含量顯著增加，乳酸脫氫酶活性明顯降低，而這兩指標(biāo)常被作為反映運動量和評價機體疲勞程度的敏感指標(biāo)[10]。說明大鼠對本實驗訓(xùn)練負(fù)荷不適應(yīng)，產(chǎn)生疲勞的某些特征[4]。這與黃誠胤的研究相似。其研究表明，4周遞增運動至疲勞小鼠的血清乳酸脫氫酶活性明顯降低，尿素氮含量呈增高趨勢。以上說明本實驗3周遞增大強度跑臺運動致大鼠疲勞模型制備成功。海馬是介導(dǎo)應(yīng)激的重要中樞, 而CA1區(qū)對缺血、缺氧等各種損傷性刺激敏感，是海馬的易損區(qū)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遞增大強度運動可引起海馬神經(jīng)元的形態(tài)改變。光鏡下可見到EM組CA1區(qū)神經(jīng)元明顯消失，細(xì)胞層次模糊不清，胞質(zhì)尼氏小體數(shù)量減少甚至消失不見等異?，F(xiàn)象，與前人研究相一致[4]，表明本實驗運動方式會造成海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損害，引起腦損傷。螺旋藻補充后，運動疲勞大鼠海馬CA1區(qū)病理損傷有所減輕，表現(xiàn)為細(xì)胞層次較清晰，胞核較清楚和尼氏小體數(shù)量逐漸增加等改善現(xiàn)象。結(jié)合表2的實驗數(shù)據(jù)，說明螺旋藻有改善運動所引起的體重下降、降低血尿素氮和增加乳酸脫氫酶活性等的抗疲勞效果及減少海馬CA1區(qū)病理損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

3.2 螺旋藻補充對運動大鼠海馬組織BDNF/TrkB神經(jīng)營養(yǎng)信號的影響

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是在腦內(nèi)合成主要表達(dá)于海馬神經(jīng)元內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，它不但對神經(jīng)元的發(fā)育、分化、存活、神經(jīng)元功能的維持、學(xué)習(xí)記憶等[11]有重要的調(diào)節(jié)作用，還能通過活化其特異性受體TrkB為受損神經(jīng)元提供營養(yǎng)修復(fù)和保護(hù)神經(jīng)元免受缺血性損傷[12]。BDNF與TrkB結(jié)合后，受體TrkB發(fā)生二聚體化，引起受體內(nèi)在的酪氨酸自磷酸化，從而將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，發(fā)揮多種生物學(xué)功能。已有研究證實，6周的力竭運動可引起海馬BDNF表達(dá)增加，以對抗力竭運動性腦損傷，對神經(jīng)元起保護(hù)作用[13]。本研究結(jié)果表明，運動后EM組大鼠海馬組織BDNF和TrkB的表達(dá)均出現(xiàn)明顯上調(diào)，與文獻(xiàn)報道相似[13]。本實驗中Western blot定量檢測結(jié)果也顯示，運動后EM組TrkB磷酸化蛋白(p-TrkB)表達(dá)的趨勢與BDNF、TrkB的表達(dá)趨勢相似，均明顯高于正常對照組，提示3周遞增大強度運動可上調(diào)海馬BDNF/TrkB信號通路。以往的研究已揭示出遞增大負(fù)荷運動引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)BDNF表達(dá)水平的提高可能是對運動所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用[14]。研究已知，運動應(yīng)激、缺血、缺氧、神經(jīng)損傷等多種因素均可引起B(yǎng)DNF表達(dá)增加。由此推測本實驗遞增負(fù)荷運動導(dǎo)致的腦相對缺血缺氧損傷海馬神經(jīng)元后，可能應(yīng)激性的引起內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子BDNF的表達(dá)增多，而表達(dá)增加的BDNF再進(jìn)一步通過活化其受體TrkB，激活BDNF/TrkB神經(jīng)營養(yǎng)信號，在細(xì)胞內(nèi)阻斷損傷因子的作用[15]，并參與運動致海馬神經(jīng)元損傷的修復(fù)和保護(hù)過程[14]。這可能是運動疲勞引起的海馬神經(jīng)元損傷后機體啟動的一種內(nèi)源性保護(hù)調(diào)節(jié)機制。遞增運動所致海馬損傷的同時，BDNF、TrkB、p-TrkB的表達(dá)也隨著開始大量增多，這可能是運動時海馬的相對缺血、缺氧誘導(dǎo)發(fā)生的兩個相反級聯(lián)過程，一方面可能由基因表達(dá)調(diào)控的海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生的主動性死亡過程，另一方面在受損神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)通過損傷因子誘導(dǎo)BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)增加產(chǎn)生的一種平行的主動細(xì)胞修復(fù)和保護(hù)過程，以對抗遞增負(fù)荷性海馬神經(jīng)元損傷。具體原因有待進(jìn)一步探討。至于這種應(yīng)激性表達(dá)能維持多長時間，尚有待進(jìn)一步作運動后不同時相點的研究。

作為“21世紀(jì)人類蛋白質(zhì)的來源”的螺旋藻具有抗腫瘤、防輻射、抗衰老、降糖調(diào)脂、免疫調(diào)節(jié)等功效。螺旋藻神經(jīng)保護(hù)作用研究不多。螺旋藻對運動疲勞所致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用研究甚少。螺旋藻能否通過其對BDNF/TrkB神經(jīng)營養(yǎng)信號的調(diào)節(jié)表現(xiàn)出抗運動疲勞大鼠海馬神經(jīng)元損傷？目前尚不明確。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，補充螺旋藻后，ES組大鼠海馬組織BDNF、TrkB和p-TrkB的表達(dá)比EM組均出現(xiàn)增高，且與陽性對照組比較無明顯差異，預(yù)示螺旋藻可以進(jìn)一步提高運動疲勞大鼠海馬BDNF、TrkB和p-TrkB的表達(dá)水平。目前有關(guān)BDNF/TrkB神經(jīng)營養(yǎng)信號與螺旋藻抗運動大鼠海馬神經(jīng)元損傷方面的報道很少見。此實驗結(jié)果與吳春燕等[14]報道的中藥八珍加肉桂補骨脂湯干預(yù)的運動疲勞大鼠海馬組織中BDNF、TrkB蛋白表達(dá)值的變化趨勢相似。雖然實驗對象、實驗方法、運動方式和干預(yù)手段等不同，但螺旋藻與中藥八珍加肉桂補骨脂湯均有上調(diào)運動大鼠海馬BDNF/TrkB通路蛋白表達(dá)的神經(jīng)保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，BDNF與其表面受體TrkB結(jié)合后，可以調(diào)控神經(jīng)元的發(fā)育分化、功能維持和突觸可塑性；如果再增加BDNF和TrkB的表達(dá)強度，進(jìn)而可再增加其神經(jīng)的營養(yǎng)作用。結(jié)合前面研究已顯示的螺旋藻補充后，運動大鼠的體重下降等疲勞相關(guān)癥狀和海馬CA1區(qū)病理損傷的改善現(xiàn)象，由此可說明螺旋藻對海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用可能與其上調(diào)BDNF/TrkB信號通路有關(guān)。Prakashetal[17]研究報道，BDNF信號對損傷神經(jīng)元的保護(hù)可能與其抵抗炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的損傷，調(diào)整自由基代謝，減少自由基積累，從而保護(hù)自由基攻擊的神經(jīng)元有關(guān)。也有研究表明，在損傷狀態(tài)下, BDNF通過與其受體TrkB結(jié)合, 啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑, 從而產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)分子對神經(jīng)元起保護(hù)作用[18-19]。至于BDNF/TrkB神經(jīng)營養(yǎng)信號介導(dǎo)螺旋藻抗運動性海馬神經(jīng)元損傷的具體分子機制，尚有待進(jìn)一步探討。

在本實驗結(jié)果中我們還發(fā)現(xiàn)，NS組的BDNF、TrkB和p-TrkB蛋白表達(dá)雖然稍高于正常對照NC組，但兩者不具有顯著性差異；而ES組的BDNF等蛋白表達(dá)則明顯高于NS組，兩者有明顯差別。說明單獨補充螺旋藻并不能明顯引起正常組BDNF/TrkB信號上調(diào)，而由于運動應(yīng)激的作用螺旋藻則能明顯上調(diào)該信號，說明BDNF/TrkB信號可能介導(dǎo)螺旋藻改善運動疲勞鼠海馬損傷。這也間接佐證本實驗中的BDNF這種內(nèi)源性應(yīng)激保護(hù)蛋白在海馬損傷中的保護(hù)和修復(fù)作用，同時也提示運動員在進(jìn)行遞增強度運動至中樞疲勞時膳食中可適當(dāng)補充螺旋藻。

本實驗3周的遞增負(fù)荷運動引起大鼠海馬BDNF與其受體TrkB及受體磷酸化蛋白(p-TrkB)表達(dá)上調(diào)，BDNF/TrkB信號可能參與運動疲勞引起的海馬神經(jīng)元損傷的修復(fù)過程。螺旋藻對運動所致海馬神經(jīng)元損傷有一定的保護(hù)作用，其機制可能與其提高BDNF/TrkB神經(jīng)營養(yǎng)信號通路蛋白表達(dá)水平有關(guān)。建議運動員在進(jìn)行遞增強度運動至疲勞時注意飲食中螺旋藻的補充。