張皓旻， 楊 波， 陳紅飛， 遲小華， 席義博， 陳熙勐， 郭 斌， 賀培鳳， 盧學(xué)春△

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)管理學(xué)院, 太原 030001； 2. 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院南樓血液科 國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 北京 100853； 3. 中國(guó)人民解放軍火箭軍總醫(yī)院藥劑科, 北京 100800)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)最新報(bào)道，肺癌是人類最常見的惡性腫瘤類型，其發(fā)病率(11.6%)和死亡率(18.4%)位居所有癌癥類型之首[1]。在肺癌中，非小細(xì)胞性肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)最常見，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma, LA)又是主要的病理類型，超過40%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期[2]。隨著基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，通過對(duì)肺腺癌的生物信息學(xué)分析，已有大量關(guān)于肺腺癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥及預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)記物的研究報(bào)道[?]，且開發(fā)出分子靶向藥物改變了肺腺癌的臨床治療模式，如表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKIs)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)激酶抑制劑等[3,4]。由此可見，基于組學(xué)大數(shù)據(jù)深度挖掘是尋找肺腺癌診斷、治療及預(yù)后相關(guān)靶點(diǎn)的重要手段。

目前已知，微小RNA(microRNA, miRNA)可參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，它們通過調(diào)控靶基因及其相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)揮與癌基因或抑癌基因類似的作用[5]。同時(shí)，有些由于某些基因會(huì)對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生影響，故而稱之為預(yù)后基因，在miRNA 中同樣如此。以往研究重點(diǎn)往往關(guān)注某個(gè)miRNA在肺腺癌病理機(jī)制中的作用，缺乏針對(duì)肺腺癌全miRNA組的系統(tǒng)研究[6,7]。本研究通過對(duì)癌癥基因組圖譜(The cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中567例肺腺癌miRNA組學(xué)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，探討肺腺癌預(yù)后相關(guān)miRNA組學(xué)特征及其臨床意義，以期為肺腺癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

TCGA[8]由美國(guó)國(guó)家腫瘤中心( National Cancer Institute，NCI) 和國(guó)家人類基因組研究所( National Human Genome Research Institute，NHGRI ) 共同發(fā)起，截至目前已收錄50多種腫瘤類型。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)收集并處理的公開肺腺癌miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)567例，其中正常樣本46例、肺腺癌患者樣本521例，同時(shí)下載了504例肺腺癌患者的生存數(shù)據(jù)。

1.2 肺腺癌miRNA差異分析

用R語言DEseq程序包，對(duì)46份正常組織和521份肺腺癌組織樣本進(jìn)行差異miRNA分析并繪制熱圖，使用Origin軟件繪制火山圖[9]。差異miRNA篩選閾值為FDR<0.05，/LogFC/>1。

1.3 差異miRNA的生存分析

隨后，運(yùn)用R語言對(duì)得到的差異miRNA進(jìn)行生存分析。首先，對(duì)差異miRNA進(jìn)行單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，依據(jù)假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果初步篩選對(duì)肺腺癌預(yù)后可能具有影響的miRNA；隨后，對(duì)單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析篩選出的miRNA進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，依據(jù)回歸系數(shù)(β)及風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratios，HR)來識(shí)別保護(hù)(HR<1)和危險(xiǎn)miRNA(HR>1)，同時(shí)確定肺腺癌中高風(fēng)險(xiǎn)miRNA(β>0)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)[10]。

1.4 miRNA靶基因分析

miRWalk(http：//mirwalk.uni-hd.de/)是一個(gè)用于預(yù)測(cè)miRNA靶基因的開源在線分析工具[11]。我們首先應(yīng)用miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述能夠影響肺腺癌患者生存時(shí)間的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。隨后，依據(jù)靶基因在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中的聚類結(jié)果，進(jìn)一步分析miRNA功能。最后，利用Cytoscape軟件繪制miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[12]。

2 結(jié)果

2.1 篩選肺腺癌差異miRNA

利用來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的46份正常組織和521份肺腺癌組織樣本，篩選出46個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)19個(gè)、下調(diào)27個(gè)，差異基因的層次聚類圖如圖1A所示。隨后利用Origin繪制火山圖，結(jié)果如圖1B所示。差異miRNA的層次聚類圖顯示，腫瘤和正常組織形成了明顯的類團(tuán)，各組組內(nèi)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)度強(qiáng)，可以很好地區(qū)分正常組織與癌組織這兩組樣本(圖1)。

Fig.1Volcano map and hierarchical cluster heat map of differential miRNA

A： A hierarchical clustering heat map; B： Volcano map of differential miRNA

2.2 差異miRNA生存分析

為分析差異miRNA對(duì)肺腺癌的預(yù)后影響，選取504個(gè)帶有隨訪的肺腺癌病例進(jìn)行生存分析。首先，利用單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行生存分析，初步篩選出7個(gè)可能對(duì)肺腺癌預(yù)后產(chǎn)生影響miRNA，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)及意義(P<0.05，表1)。隨后，利用多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)初步篩選出的7個(gè)miRNA進(jìn)行生存分析，進(jìn)一步確定高風(fēng)險(xiǎn)miRNA，結(jié)果顯示(表2)：hsa-mir-21、hsa-mir-378e與預(yù)后不良有關(guān)(β>0，HR>1)，且為高風(fēng)險(xiǎn)miRNA，生存曲線具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)。繪制受試者工作特征曲線，即ROC(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線，顯示AUC=0.618，結(jié)果較為準(zhǔn)確(圖2B)。hsa-mir-101、hsa-let-7c、hsa-mir-142、hsa-mir-200a為保護(hù)性miRNA(β<0，HR<1)，提示其表達(dá)與肺腺癌預(yù)后良好有關(guān)。所有預(yù)后相關(guān)miRNA熱圖見圖2C。

Tab.1Analysis of single factor Cox regression analysis for the effect of microRNA expression on survival time of patients with lung adenocarcinoma

miRNAHRZ-scorePExpressionhsa-mir-148a0.785301-3.216940.001296uphsa-mir-1010.735497-2.985850.002828downhsa-mir-378e12.15492.8405660.004503downhsa-mir-211.2800672.3078110.02101uphsa-mir-200a0.855878-2.2620.023697uphsa-mir-1420.881663-2.166020.03031uphsa-let-7c0.858666-2.096930.036down

miRNA： microRNA; HR： Hazard ratio

Tab.2Analysis of multiple Cox regression analysis for the effect of microRNA expression on survival time of patients with lung adenocarcinoma

miRNAβHRse(β)zPExpressionhsa-mir-210.17111.18660.11391.50.01331uphsa-mir-101-0.22530.79830.1182-1.910.0466downhsa-let-7c-0.12520.88230.087-1.440.01504downhsa-mir-142-0.18610.83020.0654-2.840.0044uphsa-mir-200a-0.20170.81730.0702-2.870.0041uphsa-mir-378e2.21259.1390.88722.490.0126down

miRNA： microRNA; β： Regression coefficient; HR： Hazard ratio

2.3 miRNA靶基因分析

首先，利用miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，選擇miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)包含的全部數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置各數(shù)據(jù)庫(kù)連詞符為“AND”即輸出所有數(shù)據(jù)庫(kù)共有靶基因，設(shè)置閾值P<0.01篩選靶基因，分析結(jié)果詳見表3，挑選各miRNA排名前20靶基因進(jìn)行圖形化展示，詳見圖3A。隨后，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聚類分析，從中挑選肺腺癌相關(guān)通路，分析各miRNA與肺腺癌的潛在聯(lián)系。最后，利用Cytoscape軟件繪制miRNA—基因—通路互作網(wǎng)絡(luò)，詳見圖3B。

Fig.2Survival curves, ROC curves, and prognosis related miRNA heat maps of prognostic-associated miRNAs

A： Risk survival curve; B： The ROC curve; C： The prognosis related miRNA heat map

Tab.3Target genes analysis of miRNA which affecting the survival time of lung adenocarcinoma

miRNAExpressionTarget genehsa-mir-21↑265hsa-mir-142↑368hsa-mir-200a↑317hsa-mir-101↓173hsa-let-7c↓326hsa-mir-378e↓144

Fig.3miRNA target gene analysis

A： miRNA and its top 20 target genes; B： miRNA-target gene-pathway network

3 討論

微小RNA(microRNA，miRNA)是長(zhǎng)度約為～22 nt的小的非編碼RNA。它們通過與靶mRNA的互補(bǔ)堿基配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，使mRNA降解，阻斷翻譯[13]。近年來，miRNA與肺腺癌相關(guān)性的報(bào)道日漸增多。各國(guó)研究人員為方便研究開發(fā)了大量用于預(yù)測(cè)miRNA-mRNA相互作用的工具，所有這些工具都使用不同的算法。因此，合理選擇靶基因預(yù)測(cè)工具是miRNA靶基因預(yù)測(cè)的關(guān)鍵[14]。miRWalk(http：//mirwalk.uni-hd.de/)是一個(gè)用于預(yù)測(cè)miRNA靶基因的開源在線分析工具[11]。涵蓋了人、小鼠和大鼠等物種的所有目前已知miRNA結(jié)合位點(diǎn)信息。 此外，它還整合了許多新功能。例如，同時(shí)對(duì)來自不同數(shù)據(jù)庫(kù)的miRNA靶基因信息的比較分析、miRNA及其靶基因在通路中的相互作用網(wǎng)絡(luò)、以及分析miRNA及其靶基因在疾病和遺傳中的相互作用，同時(shí)還包含實(shí)驗(yàn)信息(例如，細(xì)胞系，疾病，miRNA加工蛋白)。此類工具的出現(xiàn)為肺腺癌miRNA研究的開展提供了便利。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能通過調(diào)控上皮細(xì)胞或維持間質(zhì)細(xì)胞特征相關(guān)的靶基因以及相關(guān)信號(hào)通路來調(diào)控EMT，從而促進(jìn)肺腺癌的轉(zhuǎn)移[15]。又如，Misono等人發(fā)現(xiàn)[16]，miR-145可能與肺腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-205可能與EGFR患者的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)耐藥有關(guān)[17]。上述研究結(jié)果表明，miRNA可能參與調(diào)控肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的全過程，同時(shí)其表達(dá)紊亂還與肺腺癌轉(zhuǎn)移、耐藥、預(yù)后不良有關(guān)[18,19]。這些都提示miRNA可以成為肺腺癌早期診斷及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，針對(duì)肺腺癌的全miRNA組研究有望幫助臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌治療策略。

本研究通過對(duì)來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的567例肺腺癌患者的miRNA組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，得到46個(gè)差異miRNA。隨后，利用單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行生存分析篩選出6個(gè)與肺腺癌預(yù)后不良相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)miRNA，可作為肺腺癌預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高表達(dá)與患者生存期縮短顯著相關(guān)(P<0.05)。通過對(duì)6個(gè)風(fēng)險(xiǎn)miRNA進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，他們均與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞周期、代謝、細(xì)胞間相互作用、轉(zhuǎn)錄調(diào)控產(chǎn)生的影響。

已有大量文獻(xiàn)證實(shí)，hsa-miR-21與肺腺癌預(yù)后不良有關(guān)[20]。Kunita等人[21]利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hsa-miR-21上調(diào)可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞，從而支持肺腺癌進(jìn)展，與本研究結(jié)果一致。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-21所調(diào)控的靶基因大量的富集在免疫相關(guān)通路中，例如Toll樣受體信號(hào)通路、NF-Κb信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路以及細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用等，提示hsa-miR-21可能通過刺激腫瘤微環(huán)境中促炎因子的釋放，促進(jìn)肺腺癌的發(fā)展，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，有國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中hsa-mir-21可以通過影響DNA甲基化水平影響乳腺癌患者預(yù)后[22]。Kaduthanam等人[23]發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-142表達(dá)顯著增加肺腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，可作為肺腺癌術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的標(biāo)志物，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-142能夠影響代謝相關(guān)通路，猜測(cè)其可能與肺腺癌代謝環(huán)境改變有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)hsa-miR-142能夠通過調(diào)控KRAS基因，而KRAS基因的異常表達(dá)與KRAS驅(qū)動(dòng)肺腺癌關(guān)系密切。Lin等人[24]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-200a可能與肺腺癌預(yù)后不良有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。Yang等人[25]發(fā)現(xiàn)DNMT1/miR-200a/GOLM1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞的增殖具有調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-200a在肺腺癌樣本中表達(dá)量增加，且hsa-miR-200a調(diào)控靶基因大量富集于免疫、代謝相關(guān)通路，尤其是AMPK信號(hào)通路，這提示hsa-miR-200a對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控，不僅與其表達(dá)變化及靶基因結(jié)合有關(guān)，還與肺腺癌細(xì)胞條件有關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Li等人[26]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-101下調(diào)與肺腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-101與藥物代謝相關(guān)通路有關(guān)，推測(cè)hsa-miR-101可能在肺腺癌治療耐藥上發(fā)揮作用，具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Cui等人[27]發(fā)現(xiàn)，hsa-let-7c與肺腺癌化療耐藥有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa-let-7c可以調(diào)控ERBB2基因，而ERBB2基因是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的編碼基因，因而推測(cè)其與EGFR驅(qū)動(dòng)肺腺癌關(guān)系密切，具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。目前暫無文獻(xiàn)報(bào)道hsa-miR-378e與肺腺癌的關(guān)系。本研究中盡管在對(duì)其調(diào)控靶基因的通路富集分析中未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路，但其調(diào)控靶基因大都與肺腺癌密切相關(guān)，例如FGF12[28]、RBX1[29]、SLC2A1[30]等，因此hsa-miR-378e有望成為新的肺腺癌預(yù)后標(biāo)志物，其在肺腺癌中的具體作用有待進(jìn)一步研究。

目前已知，miRNA不僅可以通過調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)來發(fā)揮作用，還可以通過影響甲基化進(jìn)而影響基因表達(dá)。同時(shí)，也可受到其他包括lncRNA在內(nèi)的非編碼RNA調(diào)控。因此，開展肺腺癌全miRNA組學(xué)研究，有助于明晰肺腺癌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)開展肺腺癌表觀遺傳學(xué)研究提供理論依據(jù)。也可為肺腺癌早期診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)；轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥及預(yù)后不良相關(guān)的分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供方向和指導(dǎo)。最終為肺腺癌現(xiàn)有臨床方案的優(yōu)化提供理論依據(jù)，為難治肺癌患者盡早選擇有效方案提供指導(dǎo)。

綜上所述，通過應(yīng)用來自TCGA的帶有患者完整生存信息的肺腺癌miRNA組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)6種miRNA與肺腺癌預(yù)后有關(guān)，其中包括4種保護(hù)性miRNA(hsa-mir-142、hsa-mir-200a、hsa-mir-101、hsa-let-7c)，2種風(fēng)險(xiǎn)miRNA(hsa-mir-21、、hsa-mir-378e)，未來有望作為肺腺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物繼續(xù)研究。其中，hsa-mir-378e與肺腺癌預(yù)后不良的詳細(xì)研究尚未見報(bào)道，有望成為新的肺腺癌預(yù)后標(biāo)志物，本研究為臨床肺腺癌診療提供新的方向和理論依據(jù)。