蔣盼若 , 柯瑞君 , 朱明了， 樓恩哲 , 謝佳庚 , 陳佳玉

(紹興文理學院醫(yī)學院， 浙江 紹興 312000)

肝癌是全球癌癥患者死亡的主要原因之一。2015年高達810 000名患者死于肝癌。全球2015年有854 000例肝癌新增病例，其發(fā)病率較1990年增加了75 %[1]。大多數(shù)肝癌患者確診時均已為癌癥的中晚期，危害性大，而目前的治療手段尚無法實現(xiàn)對其真正意義上的治療[2, 3]。因此，發(fā)現(xiàn)有效治療肝癌的藥物或療法迫在眉睫。

Smac(Second mitochondria-derived activator of caspases)是存在于線粒體中的促進細胞凋亡的重要蛋白，其低表達常常導致腫瘤等疾病的發(fā)生。Birinapant為Smac的類似物，有資料證實，該藥物具有抗慢性乙型肝炎[4]、急性髓細胞白血病、黑色素瘤、乳腺癌等的作用[5-7]。但Birinapant對肝癌的作用及相關機制尚未見報道。本研究探討B(tài)irinapant對肝癌細胞QGY-7701的作用，并分析其作用的分子機制，以期為肝癌治療新藥的發(fā)現(xiàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肝癌QGY-7701細胞株源自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，由紹興文理學院醫(yī)學院實驗室長期保存。細胞在37℃、5% CO2條件下，用含有10 % 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代。

1.2 實驗動物

BALB/C小鼠，雄性，4周齡，購于浙江省實驗動物中心。

1.3 主要試劑

Birinapant為美國Med Chem Express公司產(chǎn)品；一抗和酶標二抗購自于武漢BOSTER Biotech公司；PCR引物由上海Sangon Biotech公司合成；AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒和脫脂奶粉源自美國BD公司；JC-1由碧云天生產(chǎn)；Cell titer 96? AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay(MTS)試劑盒購自于美國Promega公司；LDH試劑盒為上海Roche Applied Science公司產(chǎn)品；RPMI-1640細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶均源于美國的Gibco公司。TRIzol、SuperScript? III First-Strand Synthesis System為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。ECL化學發(fā)光液購自美國SIGMA公司；Hoechst 33342、BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA裂解液(強)由上海Beyotime公司提供。

1.4 MTS法檢測細胞增殖活性

取處于對數(shù)生長期的QGY-7701細胞，經(jīng)胰酶消化、PH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次后，600 g離心5 min，回收細胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至5×104cells /ml，將細胞懸液接種96孔細胞培養(yǎng)板，100 μl /well，于37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。Birinapant經(jīng)DMSO溶解后，經(jīng)RPMI-1640完全培養(yǎng)液配制成含Birinapant 0、1、5、25和125 nmol/L的溶液，并補齊DMSO。待細胞貼壁后，棄上清，分別加入上述溶液。設3復孔和空白對照孔。將細胞于37℃ 5% CO2條件下分別培養(yǎng)0、24、48和72 h后，每孔加入20 μl MTS([3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt])，于37℃ 5% CO2條件下繼續(xù)孵育3 h后，利用全自動酶標儀(美國伯樂，iMark)于490 nm波長檢測吸光度(OD值)，繪制細胞的生長曲線。

1.5 流式細胞儀分析細胞凋亡水平

胰酶消化經(jīng)Birinapant(終濃度0、1、5、25、125 nmol/L)作用24 h后的QGY-7701細胞，PBS洗滌3次，于4℃、600 g條件下離心5 min，回收細胞。用冰預冷的PBS將細胞濃度調(diào)整至1×106cells/ml。取細胞懸液1 ml，600 g離心5 min后棄上清，細胞沉淀經(jīng)100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸。分別加入5 μl異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V-FITC)和5 μl的Propidium Iodide(PI)染液，充分混勻，避光、室溫孵育15 min，用流式細胞儀(BD公司，美國)檢測細胞的凋亡率。

1.6 Hoechst 染色觀察細胞核型變化

取濃度5×105cells/ml的處于對數(shù)生長期的QGY-7701細胞，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，1 ml/well，設3復孔。待細胞貼壁后，加入終濃度分別為0、25和125 nmol/L的Birinapant，37℃ 5% CO2條件下孵育24 h，用PBS洗滌細胞3次，加入10 ng /ml的hoechst 33342染色劑1 ml，37℃避光孵育15 min。PBS洗去未與細胞結(jié)合的染料，熒光倒置顯微鏡(尼康，日本)下觀察細胞的核型并拍照。

1.7 JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位

5×105cells/ml的肝癌細胞QGY-7701接種于6孔細胞培養(yǎng)板，2 ml /well，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)至細胞貼壁，于上清中加入Birinapant，使其終濃度分別為0和25 nmol/L，設3復孔，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。JC-1染色試劑用量和具體操作按照說明書進行。染色完成后，胰酶消化細胞，PBS清洗3次后，流式細胞儀(BD公司，美國)分析細胞線粒體膜電位。

1.8 Real time PCR分析基因的轉(zhuǎn)錄水平

胰酶消化處于對數(shù)生長期的QGY-7701細胞，PBS清洗3次后，調(diào)整其細胞濃度至5×105cells/ml，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，1 ml /well，設3復孔。待細胞貼壁后，加入終濃度分別為0和25 nmol/L的Birinapant，于37℃ 5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，PBS清洗3次，按照試劑說明用Trizol提取細胞中的RNA，經(jīng)Nano Drop定量后，用SuperScript? III First-Strand Synthesis System逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，試劑用量和具體操作按照說明書進行。以β-actin為內(nèi)參，Real time PCR檢測各基因 mRNA的CT值，采用2-△△CT法分析Birinapant作用后QGY-7701細胞基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.9 Western blot 檢測細胞內(nèi)蛋白表達水平的改變

將5×105cells/ml的肝癌細胞QGY-7701接種于6孔細胞板中，1 ml/well，設3復孔，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞貼壁后，將培養(yǎng)液換為含有終濃度為0、5、25和125 nmol/L Birinapant的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h(設3復孔)。棄上清，PBS清洗3次，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，回收裂解產(chǎn)物，12 000 r/min離心20 min。取上清1 μl，BCA法進行蛋白定量后，以β-actin為內(nèi)參進行蛋白電泳，上樣量30 μg /well。電泳結(jié)束后，蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)、封閉和一抗、酶標二抗孵育后，電化學發(fā)光液(ECL)進行顯色，利用Image Quant LAS 4000 mini超靈敏化學發(fā)光成像儀自動曝光成像。

1.10 抑瘤實驗

取4周齡雄性BALB/C小鼠，隨機分5組(0、1、5、25和125 μg/kg Birinapant用藥組)，每組20只，無菌條件下飼養(yǎng)一周，待其適應環(huán)境后，取對數(shù)生長期的肝癌細胞QGY-7701，胰酶消化后，600 g離心5 min，去上清，PBS清洗2次，600 g 離心5 min，完全棄上清，用注射用生理鹽水調(diào)整細胞濃度至1×107wells/ml，用生理鹽水稀釋成0.5 ml，腹股溝注射BALB/C小鼠，100 μl /只。兩天后對應的各組皮下分別注射Birinapant(0、1、5、25和125 μg/kg)，每隔一天注射一次，首次注射Birinapant的第18日，每組脫頸處死10只小鼠，取瘤組織稱重，并記錄各組剩余10只小鼠的存活期。

1.11 LDH釋放實驗檢測藥物細胞毒作用

將肝癌細胞QGY-7701接種于96孔細胞板中(細胞濃度5×104cells/ml)，100 μl /well。37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁后加入Birinapant，使藥物的終濃度分別為0、1、5、25和125 nmol/L，37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照LDH檢測試劑盒說明檢測培養(yǎng)液和細胞裂解液中的LDH，并根據(jù)公式LDH釋放率(%)=培養(yǎng)液中LDH含量 /(培養(yǎng)液中LDH含量+細胞裂解液中LDH含量)×100%計算藥物作用后細胞的LDH釋放率。

1.12 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 Birinapant對 QGY-7701細胞增殖活性的影響

結(jié)果如圖1，Birinapant對肝癌細胞QGY-7701的增殖活性有顯著抑制作用(P<0.01)，且其抑制效果與該藥的作用時間和劑量成正相關。

Fig.1The proliferation activity results of QGY-7701 cells (n=3)

2.2 Birinapant對QGY-7701細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果證實，25、125 nmol/L的Birinapant分別作用于QGY-7701細胞24 h后，早期凋亡的細胞(Q3)和晚期凋亡的細胞(Q2)比例均明顯增加，即25 nmol/L和125 nmol/L的Birinapant可顯著誘導該細胞的凋亡(P<0.01)，其作用與用藥劑量呈正相關(圖2，表1)。

Fig.2The apoptosis results detected by flow cytometry (n=3)

Tab.1The proportion of cells in various states (%,n=3)

BirinapantDead cellsLate apoptosis cellsEarly apoptosis cellsNormal cells0 nmol/L1.23±0.091.86±0.133.42±0.1193.57±0.7125 nmol/L3.08±0.165.15±0.1923.45±0.2868.25±0.44125 nmol/L3.75±0.12??23.27±0.25??61.35±1.04??11.44±0.06??

**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

2.3 Birinapant對QGY-7701細胞核型的影響

Hoechst 33342 染色結(jié)果如圖3所示，肝癌細胞QGY-7701經(jīng)25 nmol/L或125 nmol/L Birinapant作用24 h后，細胞核內(nèi)染色質(zhì)濃集，核固縮，熒光強度增強，核碎裂，有凋亡小體形成，且細胞核型的改變與藥物作用劑量相關。

Fig.3The results of hoechst 33342 staining(n=3)

2.4 Birinapant對QGY-7701細胞線粒體膜電位的影響

25 nmol/L的Birinapant對肝癌細胞QGY-7701進行處理，JC-1染色后，胰酶消化，PBS清洗3次后流式細胞儀檢測，結(jié)果如圖4和表2所示，25 nmol/L藥物作用組肝癌細胞的線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)。

Fig.4JC - 1 staining results of cell mitochondrial membrane potential(n=3)

BirinapantUndown-regulated cellsDown-regulated cells0 nmol/L99.84±0.530.01±0.0125 nmol/L50.33±0.2749.62±0.18??

**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

2.5 Birinapant對QGY-7701細胞某些基因轉(zhuǎn)錄的影響

提取經(jīng)0、25 nmol/L Birinapant作用24 h后的肝癌細胞QGY-7701的mRNA, real time PCR檢測結(jié)果顯示(表3)，Birinapant顯著抑制ras、raf、mek、erk、cIAP-1和cIAP-2基因的轉(zhuǎn)錄水平，而基因caspase-9和caspase-3的轉(zhuǎn)錄水平卻明顯上調(diào)(P<0.01)。

2.6 Birinapant對QGY-7701細胞某些蛋白表達的影響

0、5、25或125 nmol/L的Birinapant作用QGY-7701細胞 24 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示(圖5和表4)，cIAP-1、cIAP-2、Ras、p-MEK、p-Raf和p-ERK蛋白表達明顯受抑，而Caspase-3和Caspase-9的表達顯著增加。

Fig.5The western blot results of the proteins

Tab.3 The real time PCR results n=3)

cIAP-1: Cellular inhibitor of apoptosis protein 1; cIAP-2: Cellular inhibitor of apoptosis protein-2

**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

Tab.4 The integrated density of protein bands n=3)

*P<0.05，**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

2.7 Birinapant對QGY-7701細胞LDH釋放率的影響

如表5所示，Birinapantr對QGY-7701有顯著的細胞毒作用，且其作用效果和藥物作用的劑量相關，差異有顯著意義(P<0.01)。

Tab.5 The results of LDH release experiment n=3)

**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

2.8 Birinapant對荷瘤小鼠肝癌生長及生存期的影響

結(jié)果如表6，Birinapant有顯著的抑瘤作用(P<0.01)，且其作用效果與藥物作用的濃度相關。此外，結(jié)果亦證實，在1～25 μg /kg藥物作用濃度的范圍內(nèi)，荷瘤小鼠的生存期明顯延長(P<0.01)，當用藥劑量達到125 μg /kg時，小鼠生存期縮短。

Tab.6 The tumor suppression test results n=10)

**P<0.01vs0 μg/kg Birinapant treated group

3 討論

本研究顯示，Birinapant抑制肝癌細胞QGY-7701中cIAP-1和cIAP-2的表達，并激發(fā)Caspase-9 -Caspase-3級聯(lián)反應，進而有效地抑制QGY-7701細胞的增殖活性，并誘導其凋亡，從而延緩荷瘤小鼠瘤組織的生長，延長其生存期，發(fā)揮了抗肝癌的作用。

細胞凋亡為細胞的程序性死亡，它對維持機體的正常發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著至關重要的作用，當細胞凋亡水平發(fā)生變化時，腫瘤等疾病就會發(fā)生[8]。細胞凋亡受細胞內(nèi)一系列蛋白的調(diào)控，其中凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)與癌癥的發(fā)生發(fā)展關系尤為緊密，cIAP-1和cIAP-2是IAP家族主要成員，它們均可以通過抑制Caspase表達而發(fā)揮抑制凋亡的作用[9]，Caspase 家族是細胞凋亡過程中起著調(diào)節(jié)和執(zhí)行作用的重要樞紐，Caspase的異常變化提示細胞凋亡水平的改變。線粒體凋亡途徑是人體中基本的凋亡方式，Caspase家族主要也是在該途徑中發(fā)揮作用，觸發(fā)線粒體介導的內(nèi)源性凋亡途徑來誘導腫瘤細胞凋亡成為治療癌癥的潛在方法[10]。Smac是存在于線粒體中IAP的天然抑制劑，它可與IAP結(jié)合，使其發(fā)生自動泛素化，并在蛋白酶介導下降解，從而導致Caspase的失抑制，促進腫瘤細胞的凋亡[11]。Birinapant為二價的Smac類似物，有資料證實，它可上調(diào)結(jié)腸癌細胞HCT 116和乳腺癌細胞MDA-MB -231中caspase-3的表達，從而促進該腫瘤細胞的凋亡[12, 13]，而本研究也證實了此點。

此外，本研究亦顯示，Birinapant可抑制MEK/ERK信號通路主要蛋白Ras、Raf、MEK和ERK的表達。RAF/MEK/ERK 的級聯(lián)反應需要Ras GTPase 的磷酸化激活，而最終被激活的ERK能夠磷酸化或與大量(>300)胞質(zhì)和核底物相互作用，這些底物將信號傳播給負責特定啟動過程的特定目標，這在疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要意義[14, 15]。MEK/ERK信號通路參與細胞分化、凋亡、增殖、細胞周期等多方面的生物調(diào)節(jié)，資料顯示，30%的人類癌癥的發(fā)生發(fā)展與該通路的活化有關，Raf和MEK更是在多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、肝癌等腫瘤中顯著表達[16-18]，因此Birinapant對肝癌細胞QGY-7701增殖活性的抑制作用和對其凋亡的誘導作用，與其抑制Ras-Raf-MEK-ERK信號通路蛋白的表達密切相關。

綜上，Birinapant可通過下調(diào)cIAP-1、cIAP-2和Ras - Raf - MEK - ERK信號通路相關蛋白的表達，激活線粒體介導的內(nèi)源性凋亡通路，從而抑制肝癌細胞的增殖，誘導其凋亡，對肝癌有一定的抑制作用。該實驗為進一步深入研究Birinapant在肝癌治療中的臨床應用提供了依據(jù)。