陳 杰， 王燕蓉， 常 青， 于泊洋

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室， 呼和浩特 010000； 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、 寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 銀川 750004； 3. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 呼和浩特 010000)

隨著醫(yī)療水平的飛速發(fā)展，癌癥治愈率大大提高，患者長(zhǎng)期存活已成為現(xiàn)實(shí)，但年輕化趨勢(shì)明顯的特殊情況，使大量青年及未成年女性癌癥患者在接受放化療治療過程中遭受著損傷性腺、影響生育力的雙重風(fēng)險(xiǎn)。為此，如何在經(jīng)歷抗癌治療過程中有效保護(hù)卵巢組織，保存癌癥患者的生育力，提高生活質(zhì)量成為目前國(guó)內(nèi)外在本領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。卵巢組織凍存是抗癌治療過程中保護(hù)女性生育力的首選方法，但凍存過程中的卵泡丟失及損傷是該技術(shù)面臨的巨大挑戰(zhàn)。玻璃化凍存技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，使卵巢組織得到快速有效的冷凍，避免冰晶形成對(duì)卵泡的損傷，無(wú)疑是卵巢組織凍存的有效途徑。FSH是卵泡存活因子，與卵泡生長(zhǎng)發(fā)育以及人類生殖有著密切聯(lián)系[1]，而卵泡又是卵巢的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，結(jié)合本課題組前期研究，小鼠卵巢玻璃化凍存過程中添加FSH(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)，不僅可以提高卵泡存活率，還可有效縮短凍融卵巢組織再移植后血流重建時(shí)間[2]。報(bào)道稱，外源性凋亡途徑是引發(fā)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的主要原因[3]，為此，卵巢組織凍存過程中的損傷以及移植后血管的再生是觸發(fā)卵泡凋亡的關(guān)鍵步驟，而凋亡是卵泡閉鎖的重要原因，凍融卵巢再移植后丟失的卵泡高達(dá)60%[4]。active caspase-3作為凋亡執(zhí)行蛋白，可有效啟動(dòng)凋亡程序，造成卵巢卵泡大量凋亡。FSH具備通過抵抗凋亡啟動(dòng)因子caspase-3發(fā)揮其抗凋亡作用[5]，而凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3只有在被激活為active caspase-3時(shí)，才能夠啟動(dòng)凋亡程序，導(dǎo)致卵泡凋亡。因此，研究FSH對(duì)凋亡執(zhí)行蛋白active caspase-3表達(dá)的影響，將為FSH在小鼠卵巢玻璃化凍存過程中提高凍存效率提供有力的實(shí)驗(yàn)室研究證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

以4周齡清潔級(jí)C56BL/6J雌性小鼠為研究對(duì)象，購(gòu)自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室，光照周期為12 h照明/12 h黑暗，室溫保持在22～24℃，自由取食飲水。

1.2 主要試劑

促卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)：注射用重組人促卵泡刺激素(果納芬)購(gòu)自默克雪蘭諾公司，人血清白蛋白購(gòu)自Sigma公司(純度≥96%)，一抗active caspase-3為兔抗小鼠多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 液體的配置

基液：DMEM與F12等比例配置。培養(yǎng)液：含12%人血清白蛋白(HSA)，F(xiàn)SH濃度為0.3 IU/ml。預(yù)平衡液：含1.5 mol/L乙二醇。玻璃化液為我室自主研制的EG5.5-30玻璃化液。解凍液：分別為含0.5 mol/L、0.25 mol/L以及0.125 mol/L的蔗糖液。

1.4 卵巢的獲取

首先通過陰道圖片觀察小鼠動(dòng)情周期，取動(dòng)情間期小鼠，頸椎脫臼處死后于75%酒精浸泡消毒，在肋脊角處切開皮膚及肌肉，暴露卵巢，剝?nèi)ヂ殉餐饽ず笸暾谐p側(cè)卵巢，為下一步凍存前培養(yǎng)做準(zhǔn)備。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)研究目的共分為3組，每組20枚卵巢，10枚進(jìn)行HE染色后的正常卵泡百分比計(jì)數(shù)，另外10枚進(jìn)行免疫組織化學(xué)法觀察。(1)新鮮對(duì)照組(control group,CG)：提取卵巢組織后，不施加任何干預(yù)直接固定或直接提取蛋白。(2)玻璃化凍存對(duì)照組(vitrification control group,VCG)：無(wú)FSH。(3)0.3 IU/ml FSH干預(yù)玻璃化凍存組，全程添加FSH組(overall process of vitrification group-FSH，OG-FSH)。

1.6 玻璃化凍存及解凍程序

小鼠卵巢入培養(yǎng)液在37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min，接著入1.5 mol/L乙二醇中預(yù)滲透平衡8 min，再移入EG5.5-30玻璃化液滲透平衡3.5 min，之后投入-196℃的液氮罐中保存，全過程在22～24℃下進(jìn)行。凍存1 d將卵巢從液氮中取出，置于在37℃水浴內(nèi)預(yù)熱的解凍液中洗脫玻璃化液，于各濃度解凍液中滲透平衡10 min，最后入培養(yǎng)液在37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)120 min，以充分洗滌保護(hù)劑。

1.7 組織切片的制作及卵泡計(jì)數(shù)

保護(hù)劑洗脫后，將30枚卵巢以4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)方法制作石蠟切片(5 μm)，進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)觀察。

HE觀察指標(biāo)：每組任選取3張切片，在高倍鏡下每張切片任選5個(gè)視野根據(jù)卵泡形態(tài)的正常與否進(jìn)行每高倍視野(high power field,HPF)的卵泡計(jì)數(shù)。正常的卵泡為包含一個(gè)完整的卵母細(xì)胞和排列整齊的顆粒細(xì)胞層，卵母細(xì)胞或顆粒細(xì)胞未見濃縮核；相反，若卵母細(xì)胞核固縮、卵母細(xì)胞萎縮、顆粒層排列紊亂等出現(xiàn)一項(xiàng)就表明卵泡退化，視為形態(tài)結(jié)構(gòu)異常卵泡。計(jì)數(shù)正常卵泡數(shù)及卵泡總數(shù)，再通過百分比計(jì)算公式計(jì)算出正常卵泡百分比，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 active caspase-3免疫組織化學(xué)觀察

石蠟切片常規(guī)脫蠟至脫水,PBS工作液沖洗(5 min×3次)?？乖迯?fù)：將切片放入已沸騰過的枸櫞酸鹽緩沖液中微波加熱13 min后充分放涼，PBS沖洗(5 min×3次)。3% H2O2室溫孵育10 min，避光，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗(5 min×3次)。山羊血清工作液封閉25 min。滴加一抗active caspase-3，稀釋比例為1∶1 000，孵育，4℃過夜。室溫條件下孵育60 min，PBS沖洗(5 min×3次)。加入二抗，37℃孵育60 min，PBS沖洗(5 min×3次)。室溫條件下DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)速度，適時(shí)水終止反應(yīng)。復(fù)染。封片：梯度酒精上行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察切片。

陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：棕黃色即為陽(yáng)性反應(yīng)。采用DP Ctroller 3.1.1.267圖像采集系統(tǒng)明場(chǎng)拍照，將影響光強(qiáng)的因素改為手動(dòng)調(diào)節(jié)且固定，每張照片均采取白平衡措施，于低倍鏡下選擇蛋白陽(yáng)性表達(dá)的“熱區(qū)”， 然后在此區(qū)內(nèi)選取5個(gè)不同的高倍視野拍照。采用Image Pro Plus 6.0圖像全自動(dòng)分析系統(tǒng)，計(jì)算染色部位著色深淺，用累積光密度(IOD)表示，然后取其均值，可以全面反應(yīng)蛋白表達(dá)量，為下一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析做準(zhǔn)備。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 凍存全程添加FSH干預(yù)后卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果表明，凍存全程沒有添加FSH干預(yù)的玻璃化凍存對(duì)照組(VCG) ，卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，卵母細(xì)胞皺縮情況發(fā)生頻繁，各組在卵泡總數(shù)上差異不明顯(F=1.114，P=0.432)，而正常卵泡百分比各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.57，P<0.01)，表現(xiàn)為OG-FSH組最高(P< 0.05，圖1，表1)。

Fig.1Morphologic observation of vitrification ovary(HE stain)

★： Primordial follicle； ▲： Primary follicle； ●： Secondary follicle; A: Control group (CG); B: Vitrification control group(VCG); C: Vitrification group intervention by 0.3 IU/ml FSH(OG-FSH)

Tab. 1 Number of follicle after vitrification/HPF

CG: Control group; VCG: Vitrification control group; OG-FSH: Overall process of vitrification group-follicle-stimulating hormone

*P<0.05vsCG;#P<0.05vsVCG

2.2 FSH干預(yù)對(duì)玻璃化凍存卵巢組織active caspase-3蛋白表達(dá)的影響

觀察免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)果顯示，玻璃化凍存全程未添加FSH干預(yù)性保護(hù)的玻璃化凍存對(duì)照組(VCG)，凋亡執(zhí)行蛋白active caspase-3蛋白表達(dá)量最高，差異顯著(P<0.05，圖2，表2)。

3 討論

卵巢組織深低溫凍存技術(shù)已成為保護(hù)女性癌癥患者生育力的有效方法，但冷凍對(duì)卵泡的損傷需要我們探討激素的保護(hù)效率。FSH作為卵泡存活因子，不僅在卵泡的發(fā)育及成熟過程中起到關(guān)鍵作用，同時(shí)還可在幼稚卵泡周圍顆粒細(xì)胞發(fā)育過程中間接抑制凋亡執(zhí)行蛋白的激活，從而起到抵抗凋亡促進(jìn)生殖功能作用[6，7]。Active caspase-3是凋亡啟動(dòng)家族的重要成員，是caspase-3的活化形式，而每種凋亡執(zhí)行蛋白只有在轉(zhuǎn)化為活化形式后才能發(fā)揮作用，為此我們可以通過研究active caspase-3的表達(dá)情況來(lái)了解細(xì)胞凋亡。active caspase-3為構(gòu)成卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的重要凋亡標(biāo)記物[8]，直接參與凋亡的啟動(dòng)及執(zhí)行過程，與卵泡的凋亡密切相關(guān)。

Fig.2The immunohis tochemistry result of active caspase-3 in each group after intervention

*： Primordial follicle； ▲： Secondary follicle；

A: CG(Control group); B: VCG(Vitrification control group); C: OG-FSH(Overall process of vitrification group-follicle-stimulating hormone)

Group Protein expression of active caspase-3CG0.32±0.05VCG0.67±0.06?OG-FSH0.17±0.14#

*P<0.05vsCG;#P<0.05vsVCG

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察，active caspase-3蛋白的表達(dá)趨勢(shì)由高到低依次為玻璃化凍存對(duì)照組、新鮮對(duì)照組及全程添加FSH組。由此可見，在小鼠卵巢玻璃化凍存全程添加FSH的干預(yù)性保護(hù)措施有利于卵巢卵泡發(fā)育，可有效抵抗卵泡凋亡的發(fā)生。同時(shí)，凍融卵巢組織的形態(tài)學(xué)觀察表明，雖然卵泡的總體數(shù)量在各組間的比較差異不顯著，但是凍存全程添加FSH組的正常卵泡百分比于顯著高于新鮮對(duì)照組及玻璃化凍存對(duì)照組。FSH的保護(hù)作用，在卵巢組織玻璃化凍存過程中充分體現(xiàn)，對(duì)卵泡正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持具有重要作用[9]。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷，在FSH的積極保護(hù)作用下，有效促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，減少凋亡的發(fā)生[10]，保護(hù)卵泡的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少卵母細(xì)胞皺縮，顆粒細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)，同時(shí)也印證FSH在卵巢卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要性，可為健康卵泡生長(zhǎng)發(fā)育提供充足的營(yíng)養(yǎng)供給[11]。此外，關(guān)于FSH促進(jìn)血管發(fā)生的相關(guān)報(bào)道表明，在卵巢周期性變化過程中，F(xiàn)SH可有效調(diào)節(jié)卵巢周期中新生血管的形成，從而促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育[12]，從另一個(gè)角度印證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。

綜上所述，玻璃化凍存全程添加FSH的干預(yù)模式，可有效保護(hù)卵巢組織，對(duì)卵泡的發(fā)育起到積極作用，有助于卵巢卵泡的正常生長(zhǎng)，間接或直接抑制凋亡執(zhí)行蛋白的表達(dá)，起到重要的抗凋亡作用。因此，小鼠卵巢玻璃化凍存全程添加FSH干預(yù)模式可有效抵抗凋亡執(zhí)行蛋白active-caspase-3的表達(dá)，有利于卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的保護(hù)，但FSH在玻璃化凍存過程中究竟是通過怎樣的通路發(fā)揮作用的，需要我們更深入的研究。