汪 軍， 張美玲， 王松利， 劉 敏 ， Yannis Pitisladis

(1. 北京體育大學(xué)， 北京 100084， 2. The Brighton Centre for Regenerative Medicine (BCRM), University of Brighton, Hillbrow, Denton Road, Eastbourne BN20 7SR, UK)

常規(guī)劑量重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin, rHuEPO)注射(50 IU/kg)是體育界常用興奮劑之一，可以增加紅細(xì)胞和血紅蛋白量而增加有氧或者無氧運(yùn)動(dòng)能力, 運(yùn)動(dòng)員生物護(hù)照(athletic biological passport, ABP)是國(guó)際、國(guó)內(nèi)常用檢測(cè)手段之一[1-4]。ABP的檢測(cè)原理是利用運(yùn)動(dòng)員多次血液指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)，如血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比、OFF-score、異常血液參數(shù)值(abnormal blood profile score, ABPS)等, 通過一定的統(tǒng)計(jì)方法，考慮到運(yùn)動(dòng)員年齡、種族、訓(xùn)練周期、是否參與高原訓(xùn)練和受傷或者疾病等等，確定運(yùn)動(dòng)員這些指標(biāo)的最上限和最下限，如果在某次檢測(cè)過程中，發(fā)現(xiàn)某一或者多個(gè)指標(biāo)超出正常范圍，則高度懷疑使用血液興奮劑。最近幾年，血漿膨脹劑甘油結(jié)合EPO注射也有運(yùn)動(dòng)員開始使用，紅細(xì)胞和血紅蛋白的增加被大量增加的血漿量稀釋，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。也有測(cè)試前因?yàn)榇罅縼G失水分致血液濃縮而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。2010年，甘油作為掩蓋劑而被WADA列為禁用物質(zhì)[5]。也有運(yùn)動(dòng)員為逃避興奮劑檢測(cè)而使用微量rHuEPO注射，縮小尿液和血液EPO陽性檢出率窗口期，使血液指標(biāo)參數(shù)檢測(cè)不超過正常范圍，而運(yùn)動(dòng)能力出現(xiàn)較大提高，這些為興奮劑檢測(cè)提供了新的挑戰(zhàn)。但在實(shí)際微量EPO注射過程中，這些血液參數(shù)指標(biāo)是否出現(xiàn)陽性？以及在什么時(shí)間段會(huì)出現(xiàn)陽性？血紅蛋白總量指標(biāo)是否比血紅蛋白濃度指標(biāo)更有效？本研究擬對(duì)受試者實(shí)施微量rHuEPO注射7周后，觀察不同時(shí)間段其血紅蛋白總量(total hemoglobin, tHb)和其他血液參數(shù)，觀察這些指標(biāo)是否超過ABP所規(guī)定的正常值范圍而被診斷陽性，希望為血液興奮劑檢測(cè)運(yùn)動(dòng)員生物護(hù)照的使用提供實(shí)踐依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

14名健康青年男性(年齡30±4.6歲，體重 72.7±4.3 kg，身高(178.9±4.7)cm，每周至少3次50 min以上的規(guī)律運(yùn)動(dòng)，無吸煙飲酒等不良嗜好)，自愿參與本實(shí)驗(yàn)且在實(shí)驗(yàn)前填寫知情同意書，該實(shí)驗(yàn)方案受到學(xué)校倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

14名受試者(E)進(jìn)行微量rHuEPO(NeoRecormon, Roche, Welwyn Garden City, UK)皮下注射共7周，按照每kg體重20～40 IU進(jìn)行注射，每周2次。EPO注射期間給予每天口服鐵劑105 mg；對(duì)照組(C)(n=14)注射等量生理鹽水，每日口服安慰劑(用淀粉制作的片劑105 mg)。在注射前第7日、第一次注射后第3、10、17、24、31、38和45日、以及第7周最后一次注射后第7、14、21日分別采取靜脈血全自動(dòng)生化分析儀測(cè)試血液基礎(chǔ)參數(shù)(紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積等)，改良CO吸入法[6-8](optimised CO rebreathing method)測(cè)試tHb以及公式法計(jì)算全血、血漿以及紅細(xì)胞容積的變化情況。觀察血液總量參數(shù)和濃度參數(shù)隨注射時(shí)間的變化，探討這些指標(biāo)在ABP中的使用。

1.3 具體檢測(cè)設(shè)備和方法

血液濃度參數(shù)：全自動(dòng)血液分析儀(SYSMEX KX-21, 希深美康，日本)測(cè)試血液基礎(chǔ)參數(shù)，如紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞壓積、網(wǎng)織紅細(xì)胞等。

血液總量指標(biāo)測(cè)試：改良CO吸入法(Fluke CO-220, Radiometer ABL 725)測(cè)試血紅蛋白總量、全血量、血漿量和紅細(xì)胞量等等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有參數(shù)均通過2010Excel收集整理，篩選得出有效數(shù)據(jù)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，相關(guān)參數(shù)用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，比較注射后不同時(shí)間點(diǎn)參數(shù)變化與基礎(chǔ)值以及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)的差異性。

2 結(jié)果

2.1 rHuEPO對(duì)血紅蛋白、紅細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積和網(wǎng)織紅細(xì)胞的影響

圖1顯示實(shí)驗(yàn)組血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積在實(shí)驗(yàn)第1周開始顯著上升，第6周達(dá)到峰值，較基礎(chǔ)值分別上升9.54%和10.25%，在最后一次注射后第3周雖有下降，但仍維持較高水平，在運(yùn)動(dòng)員生物護(hù)照顯示陽性結(jié)果。而安慰劑組的血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積隨時(shí)間變化并無明顯改變，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比顯著性升高。

Fig.1Changes of HCT and [Hb] on different time points(n=14)

PRE: pre injection; DUR-3D: 3 days after the first injection; DUR1W: 1 week after the first injection; DUR2W: 2 weeks after the first injection; DUR3W: 3 weeks after the first injection; DUR4W: 4 weeks after the first injection; DUR5W: 5 weeks after the first injection; DUR6W: 6 weeks after the first injection; POST1W: 1 week after the last injection; POST2W: 2 week after the last injection; POST3W: 3 week after the last injection； [Hb]: Hemoglobin concentration; HCT: Hematocrit

*P<0.05，**P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group;#P<0.05，##P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group

從圖2可以看出實(shí)驗(yàn)組的紅細(xì)胞數(shù)在注射第1周開始顯著上升，第6周上升至峰值，上升幅度為9.94%，注射結(jié)束后第3周尚未恢復(fù)至正常值，仍維持較高水平，ABP顯示陽性。安慰劑組無明顯變化，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比具有顯著性差異；實(shí)驗(yàn)組網(wǎng)織紅細(xì)胞在注射前3周顯著上升，但從第4周開始迅速下降，ABP顯示陽性安慰劑組沒有明顯變化，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異。

Fig.2Changes of red blood cell and RET on the different time points(n=14)

RBC: Red blood cell; RET: Reticulocyte

*P<0.05，**P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group;#P<0.05，##P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group

2.2 rHuEPO對(duì)血紅蛋白總量的影響

圖3顯示實(shí)驗(yàn)組tHb絕對(duì)值、相對(duì)值均在注射第3周開始顯著上升，第5周達(dá)到峰值，分別上升10.22%、10.80%，ABP結(jié)果顯示陽性，而在注射結(jié)束后第1周即開始顯著下降恢復(fù)，第3周基本恢復(fù)到正常值，對(duì)照組變化不明顯，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，具有顯著性差異。

Fig.3The changes of tHb on different time points(n=14)

tHb: The absolute value of total hemoglobin; tHb (g/kg) : the relative value of total hemoglobin

*P<0.05，**P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group;#P<0.05，##P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group

2.3 rHuEPO對(duì)全血量、血漿量和血紅細(xì)胞量的影響

圖4顯示總血量在注射后第5周上升2.57%，上升幅度不顯著，注射結(jié)束后第3周基本恢復(fù)正常值，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，不具有顯著性差異。表示EPO注射不會(huì)顯著影響血液總量的變化，而且ABP顯示陰性結(jié)果。

Fig.4Changes of blood volume on different time points(n=14)

從圖5可以看出實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞總量在注射第3周開始顯著上升，第5周上升至峰值，幅度為 10.89%，第3周恢復(fù)至正常值，對(duì)照組無顯著性變化，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，具有顯著性差異；實(shí)驗(yàn)組血漿量隨時(shí)間變化平緩下降，注射結(jié)束后第1周下降顯著，血液出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象。而安慰劑組無明顯變化，且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在第5周和注射后第1周存在顯著性差異。

Fig.5Changes of red blood cell volume and plasma volume on different time points (n=14)

RCV: Red blood cell volume; PV: Plasma volume

*P<0.05，**P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group;#P<0.05，##P<0.01 the group of EPO injectionvscontrol group

3 討論

本研究的目的在于通過注射微量rHuEPO，觀察其對(duì)血液指標(biāo)(血液總量指標(biāo)和濃度指標(biāo))影響。探討這些血液指標(biāo)的變化是否會(huì)超過ABP所確定的正常范圍；以及總量指標(biāo)和濃度指標(biāo)相比，其在運(yùn)動(dòng)員生物護(hù)照使用中的有效性及時(shí)效性是否有區(qū)別，以便于為血液興奮劑ABP的檢測(cè)提供更加合理的參數(shù)指標(biāo)。

該研究發(fā)現(xiàn)，微量rHuEPO注射可以顯著性增加紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積等濃度參數(shù)，而且一直可以持續(xù)到注射后3周左右，這些指標(biāo)升高的幅度都有顯著性差異，在ABP結(jié)果顯示陽性，而血漿總量的下降導(dǎo)致血液濃縮，所以這些濃度指標(biāo)上升的結(jié)果也可能是血漿濃縮導(dǎo)致；而tHb等血液總量指標(biāo)在注射后3周才出現(xiàn)顯著上升，持續(xù)時(shí)間到最后一次注射后1周即開始明顯恢復(fù)到正常水平，其變化趨勢(shì)非常敏感。盡管這種微量EPO注射方式也能顯著提高最大攝氧量和有氧運(yùn)動(dòng)能力(數(shù)據(jù)未給出)；使用血液參數(shù)用于運(yùn)動(dòng)員生物護(hù)照進(jìn)行檢測(cè)仍然可以得到陽性結(jié)果，但是如果整個(gè)周期都用血液濃度參數(shù)指標(biāo)，特別是EPO注射后期，血漿量即開始出現(xiàn)顯著下降，相對(duì)濃縮的血液會(huì)影響這些濃度指標(biāo)在ABP檢測(cè)中出現(xiàn)一些錯(cuò)誤的判斷，因而血液總量指標(biāo)可能更加有效。而且血液過分濃縮也是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員在運(yùn)動(dòng)中猝死常見原因之一。

人體中的EPO是由腎皮質(zhì)腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞分泌的一種激素樣物質(zhì), 腎外組織缺氧可促進(jìn)腎臟產(chǎn)生EPO。除腎來源外，人體內(nèi)有5%～10%的EPO是由腎外組織(如肝)產(chǎn)生的。EPO作為一種糖蛋白激素，是哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的主要調(diào)控因子，其主要生理功能包括： EPO通過與受體結(jié)合刺激骨髓造血功能，增加紅細(xì)胞的數(shù)量，從而提高血液的攜氧能力，同時(shí)能夠在一定時(shí)間內(nèi)使得血紅蛋白含量提高，使紅細(xì)胞比容增加；高強(qiáng)度競(jìng)技時(shí)，EPO能夠改善缺氧狀態(tài)，促進(jìn)肌肉中氧利用，提高肌肉工作效率；穩(wěn)定紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，維持膜內(nèi)外滲透壓。

rHuEPO與人體內(nèi)生EP0在結(jié)構(gòu)和功能上非常相似，注射rHuEPO刺激骨髓造血細(xì)胞，作用于特定的受體，促進(jìn)巨幼紅細(xì)胞的成熟，加快紅細(xì)胞的生成速度，從而產(chǎn)生一系列的血液參數(shù)變化，rHuEPO的注射可以治療癌癥導(dǎo)致的貧血癥狀[9]，主要包括血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、tHb g/kg增多。血漿量下降，總血量變化不大，產(chǎn)生血液濃縮現(xiàn)象[10]。而微計(jì)量EPO注射對(duì)于嚴(yán)重貧血并沒有明顯效果，需要用大劑量注射才能有較好的療效[11]。因?yàn)镋PO具有很好的增強(qiáng)人體血液運(yùn)輸氧的能力，且可以有效的調(diào)節(jié)、平衡體內(nèi)與造血機(jī)能有關(guān)的生理活動(dòng)，常被用作體育競(jìng)技的輔助藥物，從高原訓(xùn)練到血液回輸，EPO的濫用引起體育界的廣泛關(guān)注[12]。在90年代，國(guó)際奧委會(huì)正式將EPO列為興奮劑藥物，相繼也出現(xiàn)了多種檢測(cè)EPO的方法[13]。國(guó)外學(xué)者在上世紀(jì)80年代對(duì)rHuEPO在體育競(jìng)技領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了大量研究，對(duì)于發(fā)現(xiàn)使用20 IU/kg～50 IU/kg微量注射rHuEPO能夠顯著改變紅細(xì)胞的生成速率，增加紅細(xì)胞比容，以及一系列的血液參數(shù)變化，但其生物護(hù)照檢測(cè)效果并不理想[14]。對(duì)于rHuEPO的檢測(cè)，有直接檢測(cè)法(采集運(yùn)動(dòng)員尿液，電泳檢測(cè))和間接測(cè)試法(血液參數(shù))[15-16]。直接檢測(cè)法有一定的時(shí)限性，因而存在很大弊端；間接檢測(cè)法相對(duì)來說較簡(jiǎn)單些，起初學(xué)者用血紅蛋白濃度[Hb]來檢測(cè)，但由于甘油、水以及血液膨脹劑的使用會(huì)顯著影響血紅蛋白濃度[17]，以及不同專項(xiàng)運(yùn)動(dòng)員的血液參數(shù)都存在一定差異[18]，因此血紅蛋白濃度在生物護(hù)照使用中并不能夠很好的檢測(cè)EPO，而血紅蛋白總量tHb在人體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，使用改良CO呼吸法測(cè)試血紅蛋白總量可以更精確的檢測(cè)EPO[19]。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)微量EPO注射后，血液濃度參數(shù)(除網(wǎng)織紅細(xì)胞外)和總量參數(shù)(除血漿量外)都有顯著上升，最高點(diǎn)出現(xiàn)在注射第5～6周。而濃度參數(shù)指標(biāo)如血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞壓積一直持續(xù)處于高點(diǎn)直到最后一次注射結(jié)束3周都沒有恢復(fù)到正常值；而總量參數(shù)指標(biāo)如tHb、紅細(xì)胞總數(shù)、血液總量等在注射結(jié)束后第1周就開始慢慢恢復(fù)到正常水平，持續(xù)時(shí)間較濃度參數(shù)指標(biāo)較短。網(wǎng)織紅細(xì)胞在注射前3周維持較高水平，可能是因?yàn)镋PO注射后，刺激了骨髓紅細(xì)胞的增生，大量幼紅細(xì)胞產(chǎn)生，而在注射后期以及停止注射后，幼紅細(xì)胞大量成熟為正常紅細(xì)胞，因而網(wǎng)織紅細(xì)胞開始顯著下降，而紅細(xì)胞總數(shù)出現(xiàn)顯著上升。另外，在EPO注射后，發(fā)現(xiàn)血漿量有顯著下降，尤其是在注射第5周和注射結(jié)束后第1周下降明顯，血液出現(xiàn)濃縮。雖然血液總量指標(biāo)(紅細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白總量)出現(xiàn)明顯回復(fù)到正常水平，而濃度指標(biāo)持續(xù)維持在較高位水平，應(yīng)該與血液濃縮有關(guān)。而這些往往是運(yùn)動(dòng)員在EPO注射后，血液濃縮，血液粘滯性增大，血栓形成導(dǎo)致猝死的主要因素。

綜上所述，7周微量rHuEPO注射可以顯著增加血液濃度和總量參數(shù)，而且血紅蛋白總量更加敏感，因此可以用ABP監(jiān)測(cè)微量EPO注射，但濃度參數(shù)可能會(huì)受到血漿量影響而出現(xiàn)錯(cuò)誤判斷；總量指標(biāo)在注射結(jié)束后1周左右就開始下降恢復(fù)到正常值，而濃度指標(biāo)一直持續(xù)在較高水平3周左右，與血液濃縮有關(guān)。