王 璇，袁 園，張志成，劉城秀，宋慶凱，孫曉梅

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，云南省眼科疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118)

沙門(mén)氏菌(Salmonella)屬于γ-變形菌綱、腸桿菌科、沙門(mén)氏菌屬，為革蘭氏陰性菌。是重要的人獸共患病病原菌之一，引起人獸感染后可能表現(xiàn)為無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，也會(huì)出現(xiàn)有癥狀的致死疾病，能加重病態(tài)或死亡率, 或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力[1]，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響較嚴(yán)重；是所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制中必須排除的病原菌。腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis)和傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium) 是全世界流行的主要沙門(mén)氏菌[2]，感染后通常引起嘔吐、腹瀉、腸炎等癥狀。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由Notomi等[3]在2000年最早發(fā)明的一種新型的核酸擴(kuò)增方法。其原理是針對(duì)靶基因保守序列的6～8區(qū)域設(shè)計(jì)4～6條引物，包括外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物各一對(duì)，其中內(nèi)引物和外引物是反應(yīng)必需的，加入環(huán)引物可通過(guò)與莖環(huán)DNA雜交，并促進(jìn)鏈置換和擴(kuò)增[4-5]，以加速LAMP反應(yīng)，在具鏈置換活性的DNA 聚合酶(如Bst)作用下，即可在60℃～66℃的恒溫條件下短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果可通過(guò)直接觀(guān)察是否產(chǎn)生焦磷酸鎂白色沉淀來(lái)判斷[6-7]，也可在反應(yīng)前后加入顯色劑(如鈣黃綠素，SYBR Green I等)根據(jù)顏色變化來(lái)判斷，還可在紫外光下通過(guò)觀(guān)察熒光情況判斷[8-9]；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳為梯狀條帶。LAMP法檢測(cè)具有特異、靈敏、快速、便攜等特點(diǎn)，在恒溫條件下40 min內(nèi)即可完成高效擴(kuò)增反應(yīng)，可肉眼觀(guān)察反應(yīng)結(jié)果，被廣泛應(yīng)用病原菌和寄生蟲(chóng)的檢測(cè)中[10]。

樹(shù)鼩作為一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其在進(jìn)化上接近于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，在生理、生化及解剖學(xué)等生物學(xué)特性方面與人類(lèi)有著相似之處，被廣泛引用于人類(lèi)病毒性疾病[11]、眼科疾病[12]、生殖生物學(xué)及免疫學(xué)[13]等疾病研究中。利用樹(shù)鼩進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前需要檢測(cè)沙門(mén)氏菌以排除其對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，因此，建立快速、簡(jiǎn)便、特異的方法對(duì)于樹(shù)鼩沙門(mén)氏菌檢測(cè)具有重要意義。本研究旨在建立一種具有上述特點(diǎn)的可大規(guī)模檢測(cè)樹(shù)鼩糞便沙門(mén)氏菌的LAMP方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本研究使用的兩個(gè)陽(yáng)性菌株即腸炎沙門(mén)氏菌(CMCC50041株，凍干粉)和乙型副傷寒沙門(mén)氏菌(CMCC50094株，凍干粉)來(lái)自于中國(guó)食品藥品鑒定研究院；其它菌株即普通變形桿菌、糞腸球菌等8株均為前期從野生來(lái)源樹(shù)鼩腸道中分離、鑒定、保存的菌株[14]，見(jiàn)表1中3～10號(hào)樣品，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所的李建芳老師惠贈(zèng)。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株及來(lái)源

1.2 樹(shù)鼩糞便樣本

利用肛拭子采集野生來(lái)源、腹瀉樹(shù)鼩的稀便，于1.5 mL離心管中，4℃保存。

1.3 主要儀器與試劑

高速離心機(jī)(HIMAC)；nanophotometer N50超微量分光光度儀(Implen); PCR 擴(kuò)增儀(Bio-Rad)；凝膠成像儀(Bio-Rad)；電泳儀和電泳槽(Bio-Rad)；細(xì)菌全基因組提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)；金牌Mix(擎科生物)；WarmStart?LAMP 試劑盒(New England Biolabs Inc)；GelRed凝膠核酸染料(Biotium)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)

首先將試驗(yàn)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫振蕩器內(nèi)37℃ 250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，以活化和增殖細(xì)菌。然后將腸炎沙門(mén)氏菌和乙型副傷寒沙門(mén)氏菌分別接種于SS培養(yǎng)基上，其余菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。

1.4.2 菌液濃度測(cè)定

將純培養(yǎng)的腸炎沙門(mén)氏菌用無(wú)菌水10倍梯度稀釋后接種，按平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.4.3 細(xì)菌DNA提取

純培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株參照細(xì)菌全基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA；糞便樣品中細(xì)菌DNA提取參考LaMontagne[15]、騫宇[16]的細(xì)菌基因組提取方法并略微改變。

1.4.4 引物設(shè)計(jì)

利用沙門(mén)氏菌的invA基因，參考Rahn等[17]的文獻(xiàn)合成普通PCR引物(invA-F、invA-R)；參考Yang等[18]的研究合成LAMP引物(F3、B3、FIP、BIP、Loop-F、Loop-B)，引物由擎科生物合成，引物序列見(jiàn)表2。

1.4.5 LAMP檢測(cè)方法建立和條件優(yōu)化

利用經(jīng)普通PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的上述樣本進(jìn)行LAMP方法建立及優(yōu)化。按照WarmStart? LAMP 試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用25 μL的反應(yīng)體系，包括WarmStart LAMP 2X Master Mix 12.5 μL，40 pmol FIP/BIP各1 μL，10 pmol F3/B3各1 μL, 20 pmol LB/LF 各1 μL，LAMP Fluorescent Dye (50X) 0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足25 L。對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，其中設(shè)置溫度梯度57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃；設(shè)置時(shí)間梯度24、26、28、30、32、34、36、38、40、42 min，以篩選最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。

1.4.6 LAMP產(chǎn)物檢測(cè)

直接肉眼觀(guān)察判斷，管中出現(xiàn)白色渾濁為陽(yáng)性,無(wú)明顯渾濁為陰性。另外，反應(yīng)前在體系中加入鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)束后陽(yáng)性為綠色，陰性為橙色，紫外光照射下陽(yáng)性發(fā)出綠色熒光，陰性不發(fā)熒光。取LAMP產(chǎn)物3 μL用2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中成像, 陽(yáng)性為梯狀條帶；陰性無(wú)明顯條帶。

1.4.7 靈敏度測(cè)試

用上述建立的LAMP方法對(duì)2株沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和8株非沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增(其中PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；保存于4℃)。取擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL于2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。

表2 引物序列

1.4.8 靈敏度測(cè)試

用無(wú)菌水10倍梯度稀釋純培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌，每個(gè)稀釋梯度取5 mL菌液提取DNA。分別進(jìn)行PCR和LAMP法擴(kuò)增、電泳，比較兩種方法的靈敏度。

1.4.9 LAMP法在快速檢測(cè)樹(shù)鼩糞便中沙門(mén)氏菌的應(yīng)用

對(duì)91份野生樹(shù)鼩新鮮稀便提取的DNA樣品用建立的LAMP法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用普通PCR法進(jìn)行對(duì)比，比較兩種方法的檢出率。

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)

純培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌初始濃度為3.36×108CFU/mL。PCR擴(kuò)增后凝膠電泳結(jié)果顯示在284 bp處有目的條帶(見(jiàn)圖 1)，表明為沙門(mén)氏菌陽(yáng)性。LAMP試驗(yàn)結(jié)束后反應(yīng)管內(nèi)液體為綠色，無(wú)模板對(duì)照為橙色，凝膠電泳結(jié)果顯示為梯狀條帶，是LAMP擴(kuò)增的典型特征(見(jiàn)圖2)。

注：(A) 凝膠電泳(陽(yáng)性為梯狀條帶)；(B) 凝膠成像系統(tǒng)拍照;(C) 肉眼觀(guān)察(陽(yáng)性為綠色)；(M) DL1000 DNA marker；(1) 腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株；(2) 乙型副傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株；(3) 無(wú)模板對(duì)照。圖2 沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株LAMP檢測(cè)結(jié)果Note.(A) Gel electrophoresis (Positive samples show ladder strips). (B) Pictures taken by the gel imaging system. (C) Visual observation (positive samples are green). (M) DL1000 DNA marker；(1) Salmonella enteritidis standard strain. (2) Salmonella paratyphi B standard strain；(3) No template control.Fig.2 The results of Salmonella standard strain LAMP test

2.2 LAMP 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

條件優(yōu)化結(jié)果顯示在所有溫度梯度下均出現(xiàn)條帶，且條帶亮度差異較小，選取62℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溫度；反應(yīng)時(shí)間在34 min以前條帶亮度逐漸增強(qiáng)，34 min以后條帶無(wú)明顯差異，因此確定最佳反應(yīng)時(shí)間34 min。

2.3 LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用優(yōu)化好的LAMP法檢測(cè)特異性，結(jié)果顯示只在兩個(gè)沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株中出現(xiàn)了綠色，且在紫外光下有綠色熒光，凝膠電泳結(jié)果呈梯狀擴(kuò)增條帶，

注：(M) DL500 DNA marker；(1)腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株；(2)乙型副傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株；(3)無(wú)模板對(duì)照。圖1 沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果電泳圖Note：(M) DL500 DNA marker.(1) Salmonella enteritidis standard strain.(2) Salmonella paratyphi B standard strain.(3) No template control.Fig.1 The electrophoresis chart of Salmonella standard strain PCR test

而在其他8株非沙門(mén)氏菌內(nèi)無(wú)明顯條帶。與PCR結(jié)果一致，說(shuō)明建立的LAMP法對(duì)沙門(mén)氏菌具有特異性。(見(jiàn)圖 3)

注：(A) 肉眼觀(guān)察；(B) 凝膠成像系統(tǒng)拍照；(C) LAMP檢測(cè)特異性；(D) PCR檢測(cè)特異性；(M) DL1000 DNA marker；(1) 腸炎沙門(mén)氏菌；(2) 乙型副傷寒沙門(mén)氏菌；(3) 普通變形桿菌；(4) 糞腸球菌；(5) 屎腸球菌；(6) 費(fèi)格森埃希菌；(7) 弗氏志賀菌；(8) 索氏志賀氏菌；(9) 大腸埃希菌；(10) 金黃色葡萄球菌；(11) 無(wú)模板對(duì)照。圖3 LAMP和PCR檢測(cè)特異性Note.(A) Visual observation. (B) Pictures taken by the gel imaging system. (C) The specificity test results of LAMP. (D) The specificity test results of PCR. (M) DL1000 DNA marker. (1) Salmonella enteritidis. (2) Salmonella paratyphi B. (3) Proteus vulgaris. (4) Enterococcus faecalis. (5) Enterococcus faecium. (6) Escherichia fergusonii. (7)Shigella flexneri.(8) Shigella sonnei. (9) Escherichia coli. (10) Staphylococcus aureus. (11) No template control.Fig.3 The specificity of LAMP and PCR detection

2.4 LAMP檢測(cè)沙門(mén)氏菌的靈敏度及PCR比較結(jié)果

對(duì)純培養(yǎng)的腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑵舛纫来螢椋?.36×108～3.36×100CFU/mL。然后進(jìn)行LAMP和PCR檢測(cè)，凝膠電泳結(jié)果顯示LAMP產(chǎn)物在3.36×108～3.36×101CFU/mL有明顯梯狀條帶；PCR產(chǎn)物在3.36×108～3.36×103CFU/mL有明顯條帶(見(jiàn)圖 4)。因此，LAMP法的檢測(cè)限在3.36×101～3.36×100CFU/mL之間，PCR的檢測(cè)限在1×103～3.36×102CFU/mL之間，LAMP檢測(cè)沙門(mén)氏菌的靈敏度是PCR檢測(cè)的10～100倍。

注：(A) LAMP檢測(cè)靈敏度；(B) PCR檢測(cè)靈敏度；(M) DL1000 DNA marker；(1～9號(hào)) 3.36×108～3.36×100 CFU/mL；(10) 無(wú)模板對(duì)照。圖4 LAMP和PCR檢測(cè)靈敏度Note.(A) LAMP assay. (B) PCR assay. (M) DL1000 DNA marker. (No.1-No.9) 3.36×108 to 3.36×100 CFU/mL; (10) No template control.Fig.4 Sensitivity of the LAMP and PCR assays

2.5 LAMP法在快速檢測(cè)樹(shù)鼩糞便中沙門(mén)氏菌的應(yīng)用

對(duì)采集的91份新鮮樹(shù)鼩糞便樣品提取DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行普通PCR驗(yàn)證，LAMP結(jié)果顯示陽(yáng)性樣本數(shù)為19份，陽(yáng)性檢出率為20.88%；PCR結(jié)果顯示陽(yáng)性樣本數(shù)為18份，陽(yáng)性檢出率為19.78%，且PCR和LAMP檢出的陽(yáng)性樣品完全吻合。LAMP及PCR產(chǎn)物凝膠電泳部分結(jié)果(見(jiàn)圖5)。對(duì)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣品隨機(jī)抽取三份進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的序列的吻合度均達(dá)到99%以上，因此可以確定LAMP結(jié)果的可靠性。

注：(a) PCR產(chǎn)物凝膠電泳；(b) LAMP產(chǎn)物凝膠電泳；(M) DNA marker；(M2) DL1000 DNA marker；(C1)腸炎沙門(mén)氏菌；(C2) 乙型副傷寒沙門(mén)氏菌；(21～40號(hào)) 樹(shù)鼩糞便樣品21～40號(hào)；(B) 無(wú)模板對(duì)照。圖5 樹(shù)鼩糞便樣品部分LAMP檢測(cè)結(jié)果Note.(a) The gel electrophoresis results of PCR products. (b) The gel electrophoresis results of LAMP products.(M) DL500 DNA marker. (M2) DL1000 DNA marker. (C1) Salmonella enteritidis. (C2) Salmonella paratyphi B. (No.21-40) Tree shrew fecal samples No.21-No.40. (B) No template control.Fig.5 The results of LAMP test of a part of the tree shrew stool samples

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致病菌的篩查和檢測(cè)方法通常需要具備簡(jiǎn)便、快速、特異、靈敏等特性。沙門(mén)氏菌作為一種致病性強(qiáng)、流行范圍廣的病原，目前常用的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定、免疫學(xué)(如ELISA試驗(yàn))及分子生物學(xué)(PCR，qPCR等)方法。雖然傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法仍然是沙門(mén)氏菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但通常需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間(3 d以上)，不利于快速檢測(cè)診斷[19]；免疫學(xué)方法使用方便、檢測(cè)快速，但其較低的特異性限制了應(yīng)用[20]，并且針對(duì)于樹(shù)鼩這一新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種，目前還沒(méi)有可使用的市售免疫試劑盒；基于分子生物學(xué)基礎(chǔ)的PCR和qPCR方法被廣泛用于沙門(mén)氏菌檢測(cè)，具有較高特異性和靈敏度，但是需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，且結(jié)果必須通過(guò)凝膠電泳才能觀(guān)察，耗時(shí)較長(zhǎng)，不適用于大規(guī)?？焖贆z測(cè)。LAMP方法針對(duì)目的基因的6～8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4～6條引物，只有同時(shí)存在所有引物才能啟動(dòng)擴(kuò)增，這保證了LAMP法的特異性；LAMP法對(duì)儀器要求較低，不需要昂貴的PCR儀，在恒溫水浴鍋中就可以完成全部反應(yīng)，避免了升降溫循環(huán)的時(shí)間消耗，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接肉眼可視。因此，相比于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、免疫學(xué)方法、PCR方法，LAMP法具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、不需要特殊設(shè)備、結(jié)果可視等優(yōu)點(diǎn)，更適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層樣品初篩[21-22]。

沙門(mén)氏菌invA基因編碼侵襲蛋白A，與細(xì)菌吸附侵入有關(guān)[23]，侵襲蛋白決定沙門(mén)氏菌對(duì)腸黏膜細(xì)胞的侵襲力，與其致病性密切相關(guān)[24]，invA基因高度保守且具有種屬特異性，常被用作沙門(mén)氏菌檢測(cè)的靶基因。另外，雖然FimY，bcfD[25]等基因也常被用于沙門(mén)氏菌檢測(cè)的靶基因，但是FimY基因作為L(zhǎng)AMP法的靶基因時(shí)不能檢測(cè)邦戈沙門(mén)菌(Salmonellabongori)，所以FimY基因不適用于沙門(mén)氏菌屬的所有種的檢測(cè)[26]。本方法選取了invA基因作為L(zhǎng)AMP法檢測(cè)的目的基因，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，結(jié)果顯示在2株沙門(mén)氏菌菌株表現(xiàn)出陽(yáng)性，非沙門(mén)氏菌的8種細(xì)菌檢測(cè)為陰性，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，與預(yù)期一致，說(shuō)明具有較好的特異性。

在本研究中建立的沙門(mén)氏菌LAMP法的檢測(cè)限為3.36×101CFU/mL，是普通PCR法的10～100倍，反應(yīng)時(shí)間為34 min。吳家林等[27]利用invA基因建立的沙門(mén)氏菌LAMP法檢測(cè)限為4.8×101CFU/mL，反應(yīng)時(shí)間60 min；邱索平等[28]利用FimY基因建立的實(shí)驗(yàn)猴沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法的檢測(cè)限1.35×101CFU/mL，反應(yīng)時(shí)間60 min；Zhuang等[25]利用bcfD基因建立的LAMP的檢測(cè)限5×100，反應(yīng)時(shí)間25 min；馬晨等[29]比較了傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定方法，其檢測(cè)限是0.5×105CFU/mL，低于這一劑量的樣品都將無(wú)法被檢測(cè)，并且檢出時(shí)間需要1 d以上，抗雜菌干擾能力較分子生物學(xué)方法低，樣品中微生物污染背景較高且沙門(mén)氏菌劑量較低時(shí)，檢測(cè)結(jié)果易被干擾。本研究建立的樹(shù)鼩糞便中沙門(mén)氏菌的LAMP檢測(cè)方法的靈敏度與其他的研究報(bào)道的LAMP方法相近，而高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法；反應(yīng)時(shí)間明顯低于傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法和不含LF/LB引物的LAMP方法，說(shuō)明加入LF/LB引物能通過(guò)促進(jìn)鏈置換和擴(kuò)增從而大大加速LAMP反應(yīng)[4-5]。

由于LAMP法較高的靈敏度和擴(kuò)增效率，極易因污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性[26]，因此在加樣過(guò)程中應(yīng)該盡量避免交叉污染和產(chǎn)生氣溶膠污染，陽(yáng)性模板和其他樣品模板加樣區(qū)域應(yīng)分離。在本試驗(yàn)中使用的顯色劑是鈣黃綠素，在反應(yīng)前加入到反應(yīng)體系，反應(yīng)過(guò)程中不需開(kāi)蓋，避免了反應(yīng)后開(kāi)蓋加入顯色劑時(shí)引起的氣溶膠污染，保證了實(shí)驗(yàn)的特異性。

利用建立的LAMP法對(duì)91份野生來(lái)源樹(shù)鼩新鮮稀便樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示LAMP法檢測(cè)的陽(yáng)性率為20.88%，PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為19.78%，陽(yáng)性樣品完全一致，表明所建立LAMP方法可用于樹(shù)鼩糞便樣品的檢測(cè)。邢進(jìn)等[30]曾對(duì)樹(shù)鼩腸道內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，并進(jìn)行生化、藥敏和16SrRNA 測(cè)序鑒定，最終得出樹(shù)鼩沙門(mén)氏菌攜帶率為3.3%；高家紅等[31]的樹(shù)鼩正常腸道細(xì)菌的培養(yǎng)分離鑒定及其藥敏試驗(yàn)研究結(jié)果顯示沙門(mén)氏菌攜帶率8.41%。本研究的沙門(mén)氏菌陽(yáng)性檢出率高于上述研究結(jié)果，原因之一是樣品來(lái)源不同，本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的糞便樣品均來(lái)自于野生、待檢疫的腹瀉樹(shù)鼩，并且采樣時(shí)間為夏季，濕熱的環(huán)境易于沙門(mén)氏菌滋生。原因之二是分子生物學(xué)檢測(cè)方法的靈敏性。本實(shí)驗(yàn)研究為實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩沙門(mén)氏菌病原的檢測(cè)提供了又一種簡(jiǎn)單、快捷、有效的方法。

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