李程程，管博文，蘇 路，黨 女，王玉全，孟愛民*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

骨髓抑制是腫瘤化療導(dǎo)致的劑量限制性毒副作用，表現(xiàn)為造血障礙，其中以白細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞減少最常見，其次是血小板減少。嚴(yán)重骨髓抑制時(shí)可合并感染、出血，危及生命安全[1]。骨髓抑制分為急性骨髓抑制和長期骨髓抑制，急性骨髓抑制主要是電離輻射或化療藥物引起的造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)和少量的造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)凋亡，以及誘導(dǎo)HPCs增殖障礙。臨床上，可以給予造血細(xì)胞因子緩解癥狀[2]。長期骨髓抑制主要是HSC的損傷，長期骨髓抑制具有遲發(fā)性、隱匿性，在臨床上容易被忽視，目前尚無有效治療手段[3]。前期的研究表明，電離輻射可以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)長期骨髓抑制，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激增加，提高磷酸化p38 MAKP表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)造血干細(xì)胞衰老[4]。電離輻射誘導(dǎo)的急性和長期造血系統(tǒng)損傷模型廣泛應(yīng)用與造血輻射損傷機(jī)制的研究中。白消安目前臨床上被用作慢性粒細(xì)胞白血病的緩解性治療，或聯(lián)合其他藥物作為慢性髓性白血病同種異體的造血祖細(xì)胞移植前的預(yù)處理方案，清除受體體內(nèi)的造血干細(xì)胞。其主要的副作用即為骨髓抑制[5]。相較于電離輻射誘導(dǎo)損傷模型需要特定的設(shè)備和專業(yè)人員操作，利用化療藥物白消安誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷模型，操作簡便，小鼠耐受性好[6]，本實(shí)驗(yàn)利用流式技術(shù)測定骨髓造血干細(xì)胞，造血祖細(xì)胞和長其造血干細(xì)胞的比例；體外單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)評價(jià)造血干細(xì)胞功能。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性C57小鼠35只，體重18～20 g，6～8周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK(京)2014-0004]。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2015-0035]，實(shí)驗(yàn)方案通過醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會(IACUC)審批，IACUC號為：MAM16003。

1.2 主要試劑及儀器

白消安(busulfan)購自于Sigma公司；流式所需CD4、CD8、 B220、Ter119、Gr1、CD11b、Streptavidin、scal-1、ckit、CD34抗體均購自BD Bioscience公司；甲基纖維素培養(yǎng)基(MAM HS001)購自Gibco公司；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基MethoCult GF (M3534)購自Stem Cell公司。

BD流式細(xì)胞儀(BD FACSAria TMII)；全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(ABX Pentra DX 120，法國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組及給藥

觀察不同給藥劑量對小鼠造血系統(tǒng)影響，分為對照組，低劑量給藥組(20 mg/kg)和高劑量給藥組(40 mg/kg)，每組5只。觀察不同給藥時(shí)間對小鼠造血系統(tǒng)影響，分為對照組，高劑量給藥組(40 mg/kg)，每組10只。白消安粉末由DMSO配置為80 mg/mL作為母液貯存，使用時(shí)用PBS稀釋為所需濃度。腹腔注射，高劑量給藥組分兩天給藥，每天給予20 mg/kg。對照組小鼠給予等體積含5% DMSO的PBS作為對照。

1.3.2 造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞比例測定

分離的骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×107/mL，每只小鼠取100 μL細(xì)胞用于后續(xù)染色。按體積比1∶50加入biotin標(biāo)記的混合一抗抗體CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、CD11b， 4℃條件下孵育30 min，PBS洗滌一次，離心條件為1400 r/min 5 min。離心后棄去上清，保持100 μL體積，加入混合抗體streptavidin(percp標(biāo)記)，scal-1(PE標(biāo)記)，ckit(APC標(biāo)記)，CD34(FITC標(biāo)記)。4℃條件下孵育1 h。之后PBS洗滌兩次，離心條件如上。BD流式細(xì)胞儀檢測造血祖細(xì)胞(Lin-c-kit+Sca1-or LKS- cells)，造血干細(xì)胞(Lin-c-kit+Sca1+or LKS+cells)，長期造血干細(xì)胞(CD34-Lin-c-kit+Sca1+)在骨髓中所占的比例。

1.3.3 骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)

小鼠分組和給藥方式如上述，白消安給藥后15 d小鼠二氧化碳安樂死，75%酒精浸泡消毒，之后在無菌的條件下取小鼠單側(cè)股骨，用含2% FBS的PBS緩沖液沖洗骨髓，將單側(cè)股骨沖洗至2 mL EP管中，保持體積為1 mL，每只小鼠取10 μL用于骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.4 粒細(xì)胞集落形成能力測定(colony forming unit-granulocyte and macrorophage，CFU-GM)

CFU-GM實(shí)驗(yàn)參考前期發(fā)表文獻(xiàn)[7]，CFU-GM實(shí)驗(yàn)通過檢測粒細(xì)胞巨噬系細(xì)胞的集落形成能力，用來檢測造血祖細(xì)胞分化為粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞的能力。無菌取小鼠骨髓細(xì)胞，用PBS將小鼠骨髓濃度調(diào)整至4×105/mL，每個樣加0.2 mL細(xì)胞至事先分裝好的2 mL M3534培養(yǎng)基中，振蕩器充分混勻，靜置2～5 min，待氣泡消失。加入24孔板，每孔0.5 mL。輕搖培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基均勻分布。將培養(yǎng)板放入濕盒，置入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第7天在倒置顯微鏡下觀察。低倍觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)≥50 為陽性集落。

1.3.5 外周血計(jì)數(shù)

小鼠的分組和給藥方式如上，給藥15 d后小鼠二氧化碳安樂死，摘眼球取血，用抗凝管收集外周血。自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定外周血中白細(xì)胞數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)和血小板(PLT)等指標(biāo)。

1.3.6 單細(xì)胞集落能力檢測

注：與對照組相比，*P< 0.05。圖1 白消安對C57小鼠外周血計(jì)數(shù)的影響Note.Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.1 Busulfan decreased the number of peripheral blood

本方法依據(jù)前期發(fā)表文章[8-9]，分離的骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×107/mL，每只小鼠取100 μL細(xì)胞用于后續(xù)染色。按體積比1:50加入biotin標(biāo)記的混合一抗抗體CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、cd11b，4℃條件下孵育30 min，PBS洗滌一次，離心條件為1400 r/min，4℃，5 min。離心后棄去上清，保持100 μL體積，加入混合抗體Streptavidin(percp標(biāo)記)，scal-1(PE標(biāo)記)，ckit(APC標(biāo)記)，CD34(FITC標(biāo)記)。4℃條件下孵育1 h。之后PBS洗滌兩次，離心條件如上。流式細(xì)胞儀分選長期造血干細(xì)胞(CD34-Lin-c-kit+Sca1+)到提前加了100 μL甲基纖維素培養(yǎng)基的96孔板中。每個孔兩個細(xì)胞，待接種分選造血干細(xì)胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，低倍觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)≥50 為陽性集落，結(jié)果計(jì)算每組陽性孔比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 白消安降低小鼠外周血計(jì)數(shù)

給藥后15 d，檢測小鼠的外周血計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，給予白消安的小鼠外周血中WBC，PLT的數(shù)目與對照組小鼠相比顯著降低(P< 0.05)，40 mg/kg白消安給藥組比20 mg/kg白消安給藥組小鼠WBC和PLT數(shù)目降低更多。外周血中的紅細(xì)胞和血紅蛋白數(shù)目各組間差異無顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量白消安和低劑量白消安均引起C57小鼠外周血中白細(xì)胞和血小板數(shù)目降低，損傷造血系統(tǒng)功能。高劑量組損傷程度更嚴(yán)重。

2.2 白消安對小鼠骨髓計(jì)數(shù)和體重的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，白消安給藥組小鼠的體重差異無顯著性。小鼠體態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)弓背和萎靡的癥狀。小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，給藥后15 d，給藥組小鼠的骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)與對照組相比，未見明顯變化(P> 0.05)。結(jié)果表明白消安對骨髓有核細(xì)胞數(shù)目無明顯影響。(見圖2)

2.3 白消安降低C57小鼠造血干細(xì)胞比例

為探究白消安對C57小鼠造血系統(tǒng)損傷作用，小鼠給藥后15 d，用流式細(xì)胞儀檢測小鼠的骨髓細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析時(shí)門的設(shè)置如圖3所示。我們檢測了造血祖細(xì)胞(lineage-scal-1-ckit+，HPC)，造血干細(xì)胞細(xì)胞(lineage-scal-1+ckit+，HSC)，長期造血干細(xì)胞(lineage-scal-1+ckit+CD34+，LT-HSC)的比例和數(shù)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，給予低劑量白消安小鼠HPC，HSC，LT-HSC的比例與對照組小鼠相比分別下降20.84%(1.084±0.182 vs 0.858±0.122)，47.05%(0.340±0.054% vs 0.180%±0.044%)和49.80%(0.038±0.009 vs 0.019±0.008)；給予高劑量白消安小鼠HPC、LSK、HSC的數(shù)目與對照小鼠相比分別下降51.84%(1.084±0.181 vs 0.522±0.132)，70.59%(0.340±0.054 vs 0.100±0.001)和69.38%(0.038±0.009 vs 0.011±0.002)(P< 0.05)；以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白消安降低造血干細(xì)胞，造血祖細(xì)胞比例和數(shù)目，高劑量組與低劑量組相比損傷程度更加明顯。

圖2 白消安對C57小鼠外周血和骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Fig.2 Effect of busulfan on the mouse body weight and bone marrow nucleated cells

注：(A)流式細(xì)胞儀分析時(shí)門的設(shè)置；與對照組相比，*P< 0.05。圖3 白消安對造血干細(xì)胞比例的的影響Note.(A) A representative gating strategy of HSC and LT-HSC was analyzed by flow cytometry. Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.3 Busulfan decreased the percentage of bone marrow stem cells

2.4 白消安損傷小鼠造血細(xì)胞功能

為了檢測白消安對C57小鼠造血系統(tǒng)功能的影響，分組和給藥方式如上述，白消安給藥后15 d，檢測粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成能力(CFU-GM)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠接受低劑量白消安給藥后，骨髓細(xì)胞的CFU-GM集落形成數(shù)與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(113.3±28.05 vs 142.5±18.64，P> 0.05)。而當(dāng)小鼠接受高劑量白消安給藥后，骨髓細(xì)胞的CFU-GM集落形成數(shù)較對照組下降65.42%(113.3±28.05 vs 39.17±8.89，P< 0.05)。差異均有顯著性。說明40 mg/kg白消安可以誘導(dǎo)造血祖細(xì)增殖抑制。(見圖4A)

注：與對照組相比，*P< 0.05。圖4 白消安誘導(dǎo)C57小鼠造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞增殖抑制Note.Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.4 Busulfan induced the proliferation inhibition in HPC and HSC

單細(xì)胞集落形成能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給與低劑量白消安的小鼠單細(xì)胞集落形成能力與對照組相比降低33.81%(0.62±0.13 vs 0.41±0.23，P> 0.05)；而給與高劑量組白消安的小鼠單細(xì)胞集落形成能力與對照組相比降低58.06%(0.62±0.13 vs 0.26±0.15，P< 0.05)，表明40 mg/kg白消安可以明顯降低造血干細(xì)胞功能，高劑量組與對照組相比具有顯著性差異。(見圖4B)

為了進(jìn)一步確定白消安誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷模型，我們檢測了給藥15 d和給藥30 d后造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠給予40 mg/kg白消安，30 d后外周血象和HSC和HPC的比例都有所恢復(fù)，CFU-GM的降低百分比與15 d相比有所恢復(fù)(60.71% vs 54.26%)，然而單細(xì)胞集落形成能力進(jìn)一步降低(45.16% vs 73.80%)。說明隨著時(shí)間的延長，白消安對骨髓造血干細(xì)胞的損傷進(jìn)一步加劇。(見圖5)

圖5 給藥后不同時(shí)間檢測白消安對C57小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞集落形成能力的影響Fig.5 Effect of busulfan on the proliferation ability of HPC and HSC at different time points

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，40 mg/kg白消安可以降低外周血中白細(xì)胞數(shù)目，降低造血干細(xì)胞，造血祖細(xì)胞和長期造血干細(xì)胞的比例和數(shù)目，進(jìn)一步損傷造血干、祖細(xì)胞的功能，說明白消安可以誘導(dǎo)C57小鼠造血系統(tǒng)損傷，降低造血干細(xì)胞的功能，但是小鼠體重在給藥周期內(nèi)未出現(xiàn)明顯變化，給藥后30 d小鼠均存活，表明該給藥方案可以用于誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷模型。

小鼠給予80 mg/kg白消安，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)小鼠出現(xiàn)弓背，體重減輕明顯或死亡。本實(shí)驗(yàn)中利用兩個劑量白消安給藥，高劑量組(40 mg/kg)比低劑量組(20 mg/kg)造血系統(tǒng)損傷表型更加嚴(yán)重，表現(xiàn)為外周血細(xì)胞下降更加明顯，造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞比例和數(shù)目降低，以及造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞功能的損傷加劇。低劑量組(20 mg/kg)白消安給藥后，小鼠的CFU-GM和單細(xì)胞集落形成能力與對照組相比，未見顯著性差異，因?yàn)榘紫仓饕獡p傷的是造血干細(xì)胞功能[10]，當(dāng)劑量較高時(shí)也會影響造血祖細(xì)胞功能，但是造血祖細(xì)胞恢復(fù)較快。而高劑量組(40 mg/kg)白消安可以明顯地抑制造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞增殖能力，因而40 mg/kg的給藥劑量可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。為了確定最佳檢測時(shí)間，實(shí)驗(yàn)對比了高劑量組白消安給藥15 d和30 d對小鼠造血損傷表型的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥30 d后外周血象、HSC和HPC的比例都有所恢復(fù)(結(jié)果未給出)，造血祖細(xì)胞增殖抑制有所緩解，但是造血干細(xì)胞功能進(jìn)一步損傷，說明造血干細(xì)胞損傷持續(xù)存在，應(yīng)用白消安有進(jìn)一步誘發(fā)造血干細(xì)胞耗竭的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用的給藥方案，試驗(yàn)周期內(nèi)小鼠未死亡，狀態(tài)良好，小鼠體重與對照組小鼠相比差異無顯著性，說明40 mg/kg的給藥劑量和15 d的實(shí)驗(yàn)周期可以成功誘導(dǎo)小鼠造血干細(xì)胞損傷模型的建立。

本實(shí)驗(yàn)利用單細(xì)胞集落形成能力體外檢測HSC功能，對比以往體外檢測造血干細(xì)胞功能的“鵝卵石樣集落形成細(xì)胞(cobblestone area-forming cell，CAFC)”實(shí)驗(yàn)[11]，簡便易行，時(shí)間更短。與體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)有很好的相關(guān)性，可以有效地評價(jià)造血干細(xì)胞功能[8-9]。但是造血干細(xì)胞移植仍然是評價(jià)造血干細(xì)胞功能的黃金標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)中采用體外單細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)，對評價(jià)造血干細(xì)胞功能起到很好的補(bǔ)充作用。在給藥劑量和周期內(nèi)，小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的比例明顯降低，干細(xì)胞和祖細(xì)胞的功能受到了明顯的抑制，但是對小鼠的體重和狀態(tài)沒有明顯的改變，為后期的治療干預(yù)提供便捷，可以有效地評價(jià)造血系統(tǒng)損傷，為造血干細(xì)胞損傷機(jī)制的探討和損傷防護(hù)的研究提供模型和基礎(chǔ)。

造血干細(xì)胞損傷是長期骨髓抑制的主要誘因[13]，而造血干細(xì)胞衰老是造血干細(xì)胞損傷的一個重要的機(jī)制[3, 14]，針對于造血干細(xì)胞衰老的研究也有許多突破性的進(jìn)展[15]。Wang等[16]、Xu等[17]研究顯示4 Gy或6 Gy全身照射，可以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞衰老，電離輻射可以通過激活p53-p21 (Cip1/Waf1)通路誘導(dǎo)造血干細(xì)胞衰老，除此外，電離輻射還可以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的凋亡[18]。而白消安則主要是通過誘導(dǎo)氧化自由基升高和促進(jìn)DNA損傷從而引起造血干細(xì)胞早老性改變(premature)，但是不引起p53-p21 Cip1/Waf1)通路的表達(dá)變化，并且對造血細(xì)胞的凋亡影響較小[19-20]。因而，白消安誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞損傷模型與電離輻射誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞損傷模型機(jī)制上有所差異，互為補(bǔ)充。但是本研究并沒有進(jìn)一步檢測40 mg/kg白消安給藥后15 d，造血干細(xì)胞衰老的相關(guān)指標(biāo)，主要是因?yàn)槟Ｐ徒r(shí)間為15 d，主要是通過增加細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA損傷從而誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷，所以本模型是否可以應(yīng)用與造血干細(xì)胞衰老研究有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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