王 政，李金鵬，閆一芳，王 強(qiáng)

(1.中國科學(xué)院動物研究所，膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101； 2.河北省安國中學(xué)，河北 保定 071200)

斑馬魚胚胎原腸期是一個重要發(fā)育時期，胚胎經(jīng)歷一系列復(fù)雜的事件如細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動(遷移和重排)、胚層誘導(dǎo)、背腹分化等建立個體的雛形。在原腸期，胚胎細(xì)胞進(jìn)行包括外包，內(nèi)卷和匯聚延伸運(yùn)動在內(nèi)的大規(guī)模的、協(xié)調(diào)一致的形態(tài)發(fā)生運(yùn)動，促進(jìn)胚胎胚層的形成和空間上的分離，確立了胚胎的體軸，為胚胎進(jìn)一步發(fā)育勾勒出藍(lán)圖[1-2]。其中，獨(dú)立且同時進(jìn)行的匯聚和延伸運(yùn)動對于胚胎的形態(tài)發(fā)生起關(guān)鍵作用。匯聚運(yùn)動指的是上胚層和下胚層細(xì)胞向預(yù)定的胚胎背部區(qū)域遷移，進(jìn)而引起中軸-側(cè)軸方向變窄，而延伸運(yùn)動是指背部細(xì)胞沿著前后軸伸展變長[1-2]。隨著匯聚延伸運(yùn)動的進(jìn)行，原本位于胚胎腹部及側(cè)邊和邊緣區(qū)域的細(xì)胞向背部匯集，從而在胚胎背部形成加厚的結(jié)構(gòu)，稱為胚盾[3]。同時，軸向和軸旁的細(xì)胞也發(fā)生重排和遷移，使得背腹軸變窄，沿前后軸發(fā)生延伸[4]。隨著匯聚延伸運(yùn)動的進(jìn)行，胚胎的形狀發(fā)生改變，預(yù)定發(fā)育成脊索、體節(jié)以及神經(jīng)板的細(xì)胞也會向背部遷移[3]。自從Wilson在1991年通過爪蟾細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)觀察到匯聚和延伸運(yùn)動以來[5]，人們對匯聚延伸運(yùn)動的作用有了更加深入的了解，但其調(diào)控機(jī)制還沒有得到清晰的闡釋。

Ism蛋白是新型分泌蛋白家族的成員[6]，包含保守的血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)結(jié)構(gòu)域(thrombospondin type 1 repeats domain, TSRs domain)和AMOP(adhesion-associated domain in MUC4 and other proteins)結(jié)構(gòu)域，在人類和小鼠內(nèi)均有很強(qiáng)的保守性[7]。Ism基因首先在爪蟾中被鑒定出來，表達(dá)在胚胎腹部胚孔唇，脊索和中后腦邊界等區(qū)域[7-8]。在斑馬魚中，ism有兩個同源基因，分別是ism1和ism2。ism2特異表達(dá)在斑馬魚胚胎耳泡中，表明其沒有參與胚胎原腸作用。近些年來，研究發(fā)現(xiàn)ism1是一個Nodal信號通路調(diào)控基因，與很多Nodal信號相關(guān)基因如squint、lefty1、lefty2、mixer等共表達(dá)[8-11]，但其在胚胎發(fā)育中的功能還不清楚。近來，我們通過流式細(xì)胞分選技術(shù)在30%外包期的Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因魚胚胎中分離富集了背部GFP陽性細(xì)胞，并進(jìn)行了RNA深度測序，鑒定了一批特異在胚胎背部表達(dá)的基因，其中就包括ism1[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ism1是合子表達(dá)的基因，30% 外包時期表達(dá)于胚胎背部，原腸期表達(dá)在整個胚胎邊緣區(qū)。進(jìn)一步的研究表明，過表達(dá)或敲低ism1均抑制了胚胎的匯聚延伸運(yùn)動。因此，ism1參與了對胚胎原腸期匯聚延伸運(yùn)動的調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用到的野生型斑馬魚胚胎均為Tuebingen品系；胚胎在Holtfreter水(3.5 g/L NaCl，0.05 g/L KCl，0.25 g/L NaHCO3，0.1 g/L CaCl2，pH 7.0)中，28.5℃恒溫培養(yǎng)。

Morpholino(簡稱MO)是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則設(shè)計、嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸類似物。MO可以通過堿基互補(bǔ)配對的方式與mRNA分子結(jié)合，干擾mRNA的正常剪切(splicing MO)或者抑制其翻譯(ATG MO)，最終降低特定基因的表達(dá)[13]。本研究使用的是ism1 ATG MO，序列為5’-CTCCGCC GCCAGACGCACCATCCTC-3’，由Gene Tools 公司設(shè)計并合成。

1.2 主要試劑及儀器

DNA快速純化回收試劑盒(EP101，TIANG EN)；mMessage mMachine mRNA轉(zhuǎn)錄合成試劑盒(AM1344， Ambion)；RNA純化試劑盒(DP412，TIANGEN)；MEGAscript原位雜交探針體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(AM1330，Ambion)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 整胚原位雜交

胚胎成長至所需時期，4%多聚甲醛固定24 h后剝膜過度到無水甲醇中脫水，于-20℃保存。原位雜交開始時，所有試劑及耗材均需DEPC處理，先梯度過渡到室溫PBST中復(fù)水，每次5 min；隨后置換成100% PBST，放置5 min且重復(fù)一次。隨后在雜交液里進(jìn)行預(yù)雜交2 h以上，再加入相應(yīng)RNA探針，65℃雜交過夜。隨后，65℃雜交緩沖液洗滌胚胎，然后雜交阻斷液室溫封閉1 h。SSCT洗脫，抗地高辛抗體孵育過夜，MABT洗脫， NBT/BCIP顯色。樣品4℃保存于 90%甘油中。

1.3.2 mRNA的合成及原位雜交RNA探針的制備

限制性內(nèi)切酶Not I將質(zhì)粒DNA線性化，酶切過夜，再使用DNA快速純化回收試劑盒回收線性化的DNA模板。然后用mMessage mMachine 試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA。最后利用RNA純化試劑盒純化回收mRNA，以無核酸酶水溶解，使用分光光度計測定得到的mRNA的濃度，分裝后于-80℃保存。

使用MEGAscript試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛標(biāo)記的原位雜交RNA探針，然后通過RNA純化試劑盒純化回收，-20℃保存。

1.3.3 拍照

本研究中活體拍照均在2%甲基纖維素中固定拍照；原位雜交的胚胎用90%的甘油通透后，Leica M165C體視顯微鏡進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 ism1在斑馬魚原腸期胚胎胚盤邊緣表達(dá)

注：A：128細(xì)胞期；B：半球期；C和C’：30%外包期；D和D’：胚盾期；E：75%外包期；F：尾芽期；G和G’：24 h期；H和H’：36小時期；A～F為側(cè)面觀，動物極向上；C’和D’ 為動物極觀，背部在右；G和H為側(cè)面觀，背部向上；G’和H’為背部觀。圖1 ism1在斑馬魚胚胎的時空表達(dá)圖譜Note.A, 128-cell stage. B, Sphere stage. C and C’, 30% epiboly stage. D and D’, Shield stage. E, 75% epiboly stage. F, Bud stage. G and G’, 24 h stage. H and H’, 36 h stage. Embryos in penal A to F were shown in lateral views with the animal pole at the top, while embryos in penal C’ and D’ were shown in animal views with dorsal to the right. Embryos in penal G and H were shown in lateral views with the dorsal to the top, while embryos in penal G’ and H’ were shown in dorsal views.Fig.1 Temporal and spatial expression pattern of ism1

基因在胚胎發(fā)育中的時空表達(dá)圖譜，對于揭示其潛在的發(fā)育生物學(xué)功能具有重要的作用。因此，我們首先通過整胚原位雜交技術(shù)檢測了ism1在斑馬魚胚胎早期發(fā)育中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在30% 外包時期之前，沒有檢測到ism1的表達(dá)(圖1 A和1B)，說明ism1不是一個母源基因。在30% 外包時期，ism1開始表達(dá)于胚胎背部預(yù)定胚盾部位(圖1C和1C’)。在胚盾時期，可觀測到ism1表達(dá)在整個胚胎邊緣區(qū)，尤其在胚盾部位有較強(qiáng)表達(dá)(圖1D和1D’)。在75%外包和尾芽期，ism1主要表達(dá)在前體節(jié)中胚層(presomitic mesoderm)(圖1E和1F)，而24 h和36 h則主要表達(dá)在中后腦邊界和尾部脊索區(qū)域(圖1G～1H’)。因此，ism1是一個表達(dá)于胚胎早期發(fā)育時期的合子基因，在原腸期特異表達(dá)在胚盤邊緣。

2.2 過表達(dá)ism1引起匯聚延伸運(yùn)動缺陷

注：A～C：單細(xì)胞時期注射200 pg ism1 mRNA后，活體拍照觀察過表達(dá)ism1后胚胎的表型；A:胚盾期；B和C：24 h期；C為B的放大版圖；A為側(cè)面觀，胚盾在右側(cè)；B為背部朝上側(cè)面拍照；C是為頭部腹側(cè)觀特寫；D～F：ism1過表達(dá)后原位雜交檢測標(biāo)記基因表達(dá)水平的變化；D是papc的尾部觀，腹部向上；E是ntla的背部觀，頭部向上；F左側(cè)是myod1的尾部觀，腹部向上；F右側(cè)是myod1的背部觀，頭部向上。圖2 ism1過表達(dá)影響胚胎匯聚延伸運(yùn)動Note.A, ism1-overexpressed embryos showed CE movement defects compared with the uninjected control, after 200 pg ism1 mRNA was injected at the one-cell stage. The stages were indicated; Figure C images were presented at a higher magnification in the corresponding Figure B images. A, shield-stage embryos were shown in lateral views with the animal pole at the top. B, lateral views with the dorsal to the top; C, embryos were viewed ventrally with anterior to the left. D to F, Expression patterns of marker genes in control and ism1-overexpressed embryos at the tailbud and 10 ss stages. D, posterior views with the ventral at the top; E, dorsal view with head at the top; The left panel in Figure F, posterior views with the ventral at the top. The right panel in Figure F, dorsal view with head at the top.Fig.2 Over-expression of ism1 leads to severe defects of convergence and extension (CE) movements

原腸作用中的匯聚延伸運(yùn)動是胚胎內(nèi)多細(xì)胞協(xié)同定向遷移，處于遷移前沿，即胚盤邊緣的細(xì)胞在調(diào)控匯聚延伸運(yùn)動中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。ism1在原腸期胚盤邊緣區(qū)域的表達(dá)，提示其可能參與了胚胎的匯聚延伸運(yùn)動。因此，我們首先檢測了過表達(dá)ism1對胚胎匯聚延伸運(yùn)動的影響。我們體外合成了ism1 mRNA，并在單細(xì)胞時期顯微注射至斑馬魚胚胎中。結(jié)果表明，在胚盾期，與野生型胚胎相比，注射200 pgism1 mRNA的胚胎腹側(cè)細(xì)胞較多，而背側(cè)胚盾不能形成，說明過表達(dá)ism1抑制了腹部細(xì)胞向背部區(qū)域的遷移(圖2 A)。在受精后24 h(hours post fertilization, hpf)，過表達(dá)ism1的胚胎前后軸明顯變短(圖2B)，而且眼睛融合在一起，形成獨(dú)眼的表型(圖2C)。這些現(xiàn)象均為匯聚延伸運(yùn)動缺陷的特征[14]。另外，我們還進(jìn)一步通過原位雜交技術(shù)檢測了匯聚延伸運(yùn)動相關(guān)基因表達(dá)圖式的變化。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ism1遲滯了軸旁中胚層(papc)向體軸中線的遷移(圖2D)，并導(dǎo)致軸向中胚層(ntla)沿前后軸向變短、沿背腹軸向變寬(圖2E)。進(jìn)一步的結(jié)果揭示，過表達(dá)ism1還引起體節(jié)(myod1)生成的類似缺陷(圖2F)。因此，ism1過表達(dá)干擾了斑馬魚胚胎匯聚延伸運(yùn)動。

2.3 敲降ism1同樣導(dǎo)致胚胎匯聚延伸運(yùn)動缺陷

注：A：活體拍照觀察敲降ism1(2 ng ism1 MO)后胚胎的表型，胚胎在24 h觀察拍照，側(cè)面觀背部向上；B：原位雜交檢測敲降ism1后標(biāo)記基因的變化。MO注射引起的缺陷可以被ism1 mRNA特異性地拯救。標(biāo)記基因從左到右依次是papc、ntla和myod1。尾牙期的papc為尾部觀，腹部向上；尾牙期的ntla是背部觀，頭部向上；左側(cè)是尾牙期的myod1的尾部觀，腹部向上；右側(cè)是10體節(jié)的myod1的背部觀，頭部向上。圖3 敲降ism1引起匯聚延伸運(yùn)動缺陷Note.A: Morphological characterization of ism1 morphants, the eye spaces were narrowed in ism1 morphants, lateral view were shown, with dorsal side to the top. The numbers indicated in the lower lefthand corner of each picture are the number (left) of affected embryos with phenotype similar to what is shown in the picture and the total number (right) of observed embryos. B: The expression patterns of papc, ntla, and myod1 in ism1 morphants and control embryos at the tailbud (10 hpf) and 6 somite stages. Injection of ism1 mRNA could rescue CE defects of ism1 morphants. papc, posterior views with the ventral at the top; ntla, and dorsal view with head at the top. The left panel of myod1, posterior views with the ventral at the top. The right panel of myod1, dorsal view with head at the top.Fig.3 ism1-knockout leads to ism1-deficient embryos exhibiting severe CE defects

為了探討內(nèi)源性Ism1在胚胎匯聚延伸運(yùn)動中的功能，我們在單細(xì)胞時期，將2 ngism1 MO注射到斑馬魚胚胎中，抑制ism1的表達(dá)。在胚盾期，與過表達(dá)ism1的胚胎不同，注射ism1 MO的胚胎背側(cè)胚盾沒有明顯缺陷，可能是由于內(nèi)源性Ism1表達(dá)較晚，不參與胚盾的形成。在受精后24 h，與野生型胚胎相比，注射ism1 MO的胚胎前后軸變短，體節(jié)由正常的“V”字形變?yōu)椤癠”字形(圖3 A)，類似于以前報導(dǎo)的匯聚延伸運(yùn)動缺陷[15]。為了進(jìn)一步證明ism1的功能，我們檢測了匯聚延伸運(yùn)動相關(guān)的基因表達(dá)。在注射ism1 MO的胚胎中，與過表達(dá)ism1類似，軸旁中胚層(papc)、軸向中胚層(ntla)和體節(jié)(myod1)同樣呈現(xiàn)了前后軸向變短、背腹軸向變寬的特征(圖3B)。為了排除注射ism1 MO可能引起的對其他基因的非特異性抑制，我們將ism1 mRNA與ism1-MO共同注射，來檢測ism1 mRNA對匯聚延伸運(yùn)動缺陷的拯救作用。如圖3B所示，通過檢測papc,ntal和myod1的表達(dá)，表明注射200 pgism1 mRNA可以較好的拯救ism1功能缺失引起的匯聚延伸運(yùn)動缺陷。以上結(jié)果充分表明，ism1對斑馬魚胚胎的匯聚延伸運(yùn)動是必需的。

3 討論

本研究以斑馬魚為模式動物，發(fā)現(xiàn)ism1是一個合子表達(dá)基因，在原腸期及其之前就開始表達(dá)，是維持斑馬魚的匯聚延伸運(yùn)動所必需的。近年來的研究表明，Ism是一種分泌型蛋白，通過和血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的αvβ5整合素蛋白結(jié)合，穩(wěn)定細(xì)胞間的連接，干擾VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖并觸發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制血管新生，從而起到抗腫瘤作用[9,16]。另外，Ism高表達(dá)于小鼠肺部血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)合另一種膜表面受體GRP78，從而增強(qiáng)GRP78對胞內(nèi)Src的招募并激活其激酶活性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，誘發(fā)肺部血管血液滲漏[17]。在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中，ism1與squint,lefty1,lefty2,mixer等具有類似的表達(dá)圖式，且其表達(dá)受到Nodal信號調(diào)控[4, 9]。我們以前的研究結(jié)果揭示，Nodal信號通過其下游的mir-206調(diào)控胚胎的匯聚延伸運(yùn)動[1-2]。Ism1是否可以通過結(jié)合Nodal受體蛋白調(diào)控Nodal信號活性，在胚胎匯聚延伸運(yùn)動中發(fā)揮作用，還有待于進(jìn)一步的研究。

多個研究表明，胚胎的匯聚延伸運(yùn)動必需受到嚴(yán)密的調(diào)控，相關(guān)信號通路的過度激活或抑制，以及相關(guān)基因的過表達(dá)或失活，均致使胚胎發(fā)生匯聚延伸運(yùn)動缺陷[1, 2, 15]。我們的研究結(jié)果顯示，過表達(dá)或敲降ism1同樣抑制了胚胎匯聚延伸運(yùn)動。由于Ism1是一種分泌型蛋白，我們推測其對匯聚延伸運(yùn)動的影響可能是非細(xì)胞自主性的。綜上所述，我們的研究闡明了ism1在斑馬魚胚胎匯聚延伸運(yùn)動中的功能，將有助于增加我們對相關(guān)發(fā)育事件調(diào)控機(jī)制的理解。

[1] Liu X, Ning G, Meng A, et al. MicroRNA-206 regulates cell movements during zebrafish gastrulation by targeting prickle1a and regulating c-Jun N-terminal kinase 2 phosphorylation [J]. Mol Cell Biol, 2012, 32(14): 2934-2942.

[2] Liu X, Ma Y, Zhang C, et al. Nodal promotes mir206 expression to control convergence and extension movements during zebrafish gastrulation [J]. J Genet Genomics,2013, 40(10): 515-521.

[3] Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, et al. Stages of embryonic development of the zebrafish [J]. Dev Dyn,1995, 203(3): 253-310.

[4] Trinkaus JP, Trinkaus M, Fink RD. On the convergent cell movements of gastrulation in Fundulus [J]. J Exp Zool,1992, 261(1): 40-61.

[5] Wilson P, Keller R. Cell rearrangement during gastrulation of Xenopus: direct observation of cultured explants [J]. Development,1991, 112(1): 289-300.

[6] Niehrs C, Pollet N. Synexpression groups in eukaryotes [J]. Nature,1999, 402(6761): 483-487.

[7] Pera EM, Kim JI, Martinez SL, et al. Isthmin is a novel secreted protein expressed as part of the Fgf-8 synexpression group in the Xenopus midbrain-hindbrain organizer [J]. Mech Dev, 2002, 116(1-2): 169-172.

[8] Bennett JT, Joubin K, Cheng S, et al. Nodal signaling activates differentiation genes during zebrafish gastrulation [J]. Dev Bio, 2007, 304(2): 525-540.

[9] Xiang W, Ke Z, Zhang Y, et al. Isthmin is a novel secreted angiogenesis inhibitor that inhibits tumour growth in mice [J]. J Cell Mol Med, 2011, 15(2): 359-374.

[10] Araki I, Raible F, Lohrs C, et al. Isthmin1 regulates Nodal signaling in zebrafish blastula and gastrula [J]. Mech Dev, 2005, 122: S43-S43.

[11] Weidinger G, Thorpe CJ, Wuennenberg-Stapleton K, et al. The Sp1-related transcription factors sp5 and sp5-like act downstream of Wnt/beta-catenin signaling in mesoderm and neuroectoderm patterning [J]. Curr Biol, 2005, 15(6): 489-500.

[12] 萬傳璐, 閆一芳, 王強(qiáng). 斑馬魚胚胎胚盾特異表達(dá)基因的鑒定 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報, 2016, 24(5): 441-447.

[13] Summerton J, Weller D. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties [J]. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1997, 7(3): 187-195.

[14] Seo J, Asaoka Y, Nagai Y, et al. Negative regulation of wnt11 expression by Jnk signaling during zebrafish gastrulation [J]. J Cell Biochem,2010, 110(4): 1022-1037.

[15] Heisenberg CP, Tada M, Rauch GJ, et al. Silberblick/Wnt11 mediates convergent extension movements during zebrafish gastrulation [J]. Nature,2000, 405(6782): 76-81.

[16] Zhang Y, Chen M, Venugopal S, et al. Isthmin exerts pro-survival and death-promoting effect on endothelial cells through alphavbeta5 integrin depending on its physical state [J]. Cell Death Dis, 2011, 2: e153.

[17] Venugopal S, Chen M, Liao W, et al. Isthmin is a novel vascular permeability inducer that functions through cell-surface GRP78-mediated Src activation [J]. Cardiovasc Res, 2015, 107(1): 131-142.