杜 靜，宮凱凱，楊麗娟，陳微微，羅麗卿

(1.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，腫瘤研究中心，山東 濱州 256600； 2.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，血液科，山東 濱州 256600)

經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin Lymphoma, cHL)以無痛性、進行性淋巴結腫大為主要臨床表現(xiàn)，病理診斷可見特征性的HRS(Hodgkin’s and Reed-Sternberg cells)瘤細胞[1]。盡管目前約85%的病人預后較好，仍有部分病人因原發(fā)或繼發(fā)耐藥死亡[2]。雖然cHL細胞具有B細胞特征性的免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)基因重排且起源于B細胞，卻缺失了B細胞特異性標記物如CD19，CD20等基因的轉錄和表達[3-4]，同時細胞表面異常高表達B細胞非特異性抗原如CD30[5]。B細胞表型的缺失是造成霍奇金淋巴瘤細胞逃避免疫監(jiān)視和惡性轉化的關鍵因素[6-7]，因此誘導霍奇金淋巴瘤B細胞表型轉化將有助于臨床治療。

全反式維甲酸(all trans-retinoic acid，ATRA)是維生素A的代謝產(chǎn)物，具有誘導細胞分化的作用，臨床上用于急性早幼粒白血病的治療。有研究證明，ATRA能夠在體內(nèi)外誘導淋巴母細胞向B細胞分化[8]。本研究構建熒光素酶標記的B細胞特異性啟動子cHL報告細胞，檢測ATRA對B細胞外源啟動子活性及相關基因表達的誘導作用，通過與去甲基化藥物5-Aza聯(lián)合用藥，進一步探討ATRA重新激活cHL細胞B細胞表型的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 細胞及主要試劑

霍奇金淋巴瘤細胞系(KMH2、L1236和L428)為本實驗室凍存。攜帶CD19啟動子載體由由Kupperschmitt教授惠贈，攜帶CD79a(mb1)、CD79b(B29)和ICSBP的質粒由Sigvardsson教授惠贈[9-11]。

5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza)、ATRA和鈣黃綠素(Calcein AM，CAM)購自Sigma 公司；Dual-Glo? Luciferase和ONE-GloTMLuciferase檢測試劑盒購自Promega；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibco 公司;質粒構建所需內(nèi)切酶和連接酶購自NEB公司；RNA提取及逆轉錄試劑購于Invitrogen；長片段基因擴增所用Dream Taq Green酶購自Fermentas；質粒提取試劑盒購自德國Qiagen 公司; 蛋白免疫印跡所用抗體購自Acris Antibodies；流式細胞染色所需CD30抗體購自BD生物有限公司。流式細胞儀購自BD 生物有限公司；電轉儀及相關緩沖試劑購自Lonza。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及用藥

人的cHL細胞系懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640 培養(yǎng)基，在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)細胞狀態(tài)每2～3 d傳代。以DMSO處理樣本為陰性對照，常規(guī)ATRA和5-Aza用藥濃度為10 μmol/L(除非特殊標注)。

1.2.2 質粒構建

通過XhoI/SalⅠ雙酶切PL452質粒并電泳膠回收得到2038 bp PGK-NEO片段，將插入片段與Sal I單酶切的B細胞啟動子pGL3熒光素酶報告載體連接，DH5α轉化后挑單克隆并小提，通過Sal I/Bgl II雙酶切鑒定陽性克隆。

1.2.3 細胞轉染及穩(wěn)定克隆篩選

提取質粒并去除內(nèi)毒素，收集細胞，根據(jù)Nucleofector電轉儀說明選擇相應的緩沖液和轉染程序進行細胞轉染。KMH2和L1236細胞采用T緩沖液和T-001程序轉染， L428細胞采用L緩沖液和X-001程序進行轉染。

1.2.4 穩(wěn)定轉染細胞篩選

瞬時轉染48 h后離心換液，以轉染eGFP的相應細胞為平行對照進行G418篩選，藥物濃度在KMH2、L1236和L428細胞分別為200、400和400 μg/mL，篩選2周后對照細胞全部死亡，改為G418半量維持培養(yǎng)。

1.2.5 穩(wěn)定轉染細胞的目的片段整合鑒定

提取篩選后cHL細胞基因組并進行PCR，所用引物序列如下：pGL3 For：5’-GGAAGACGCCAAAA ACATAAAG-3’，pGL3 Rev：5’-CATCGGTCGACGGA TCCTTATC-3’

1.2.6 shRNA干擾實驗

采用pSUPER-puro 系統(tǒng)(Invitrogen)進行ABF1瞬時和穩(wěn)定敲除，所需引物如下：ABF1 301 For：5’-GATCCCCGCCGCAGAGTGCAAGCAGTTTCAAGAGA ACTGCTTGCACTCTGCGGCTTTTTGGAAA，ABF1 301 Rev：3’-GGGCGGCGTCTCACGTTCGTCAAAGTTCTC TTGACGAACGTGAGACGCCGAAAAACCTTTTCGA；所用對照無義序列如下：Scramble For: 5’-GATCCCCCGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGA TCGAAGTATTCCGCGTACGTTTTTGGAAA，Scramble Rev: 3’-GGGGCATGCGCCTTATGAA GCTAAGTTCT

CTAGCTTCATAAGGCGCATGCAAAAACCTTTTCGA

1.2.7 熒光素酶活性檢測

在96孔板每孔加入100 μL細胞懸液和10 μmol/L鈣黃綠素CAM, 室溫避光孵育10 min后檢測熒光強度。同時，另取100 μL細胞懸液加入100 μL One-Glo reagent, 室溫避光孵育15 min，細胞充分裂解后于560 nm檢測化學發(fā)光信號強度。

1.2.8 免疫印跡

提取細胞總蛋白并通過Bradford法測量濃度，加入上樣緩沖液后于95℃孵育5 min。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白并轉到0.22 μm孔徑的PVDF膜上，一抗4℃過夜孵育，辣根過氧化物酶HRP標記的二抗室溫孵育1 h后通過ECL法顯色。

1.2.9 實時熒光定量PCR

使用TRIzol試劑提取細胞總RNA并通過Superscript II Reverse逆轉錄酶合成互補cDNA。以琥珀酸脫氫酶復合物亞單位A(SDHA)做內(nèi)參，使用TaqMan進行實時熒光定量PCR檢測目的基因表達水平。所有反應均設三個復孔，基因的相對表達量比較采用ΔΔCt法。

1.2.10 流式細胞技術

取5×105細胞于1200 r/min離心5 min，用預冷的PBS洗滌2次，抗體1∶2稀釋后避光孵育30 min, PBS洗滌后用含有1% FBS的PBS懸浮細胞，采用FL-1通道上機檢測FITC標記的抗體，以同型IgG抗體做陰性對照。采用Flowjo軟件分析結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 攜帶G418抗性的B細胞特異性啟動子報告載體的構建

對PL452質粒進行XhoI/SalⅠ雙酶切得到將PGK-NEO片段，插入由Sal I單酶切線性化的 B細胞啟動子pGL3載體內(nèi)，構建可用于G418穩(wěn)定篩選的CD19/CD79a/CD79b/ICSBP -pGL3-PGK-NEO質粒(見圖1 A)。通過Sal I/Bgl II雙酶切鑒定陽性克隆，CD19-pGL3-PGK-NEO正確克隆瓊脂糖電泳應顯示2 kb和7 kb片段，CD79a/CD79b/ICSBP-pGL3-PGK-NEO質粒正確克隆顯示2 kb和5 kb片段，Afe I單酶切后分別產(chǎn)生9 kb和7 kb片段。

2.2 穩(wěn)定轉染克隆的篩選及其B細胞特異性啟動子的基因擴增和功能鑒定

采用Lonza核電轉染系統(tǒng)，以eGFP為陽性對照摸索出針對不同細胞系的最佳轉染條件(程序和緩沖液等詳見方法部分)。經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉染細胞后提取基因組，擴增外源啟動子和熒光素酶片段以鑒定其整合，CD79a/CD79b/ICSBP-Luc序列擴增后應為2.2 kb, CD19-Luc序列擴增后應為4 kb，以104倍稀釋后的CD79a-pGL3質粒和pGL3空載體為陽性對照，以未轉染細胞基因組為陰性對照可見，CD79a/CD79b/CD19-Luc序列穩(wěn)定整合到KMH2，L1236和L428細胞中(見圖1A)。據(jù)報道，活化的B細胞因子1(Activated B-cell Factor, ABF1)在cHL細胞內(nèi)異常高表達且與早期B細胞發(fā)育分化的關鍵轉錄因子E2A結合并抑制其功能[12]。為進一步檢驗整合后的啟動子是否具有功能，我們通過RNA干擾技術敲除ABF1表達，并在瞬時和穩(wěn)定敲除ABF1的L428熒光素酶報道細胞中檢測其對B細胞特異性啟動子活性的影響。結果證實，ABF1表達沉默能夠顯著增加CD19、CD79a和CD79b啟動子的轉錄活性(見圖1B-D)。

2.3 ATRA激活cHL細胞中外源B細胞特異性啟動子的轉錄活性

我們首先采用1和10 μmol/L ATRA孵育CD19-Luc整合的L428細胞后，分別在24、48 h和72 h檢測熒光素酶強度，以鈣黃綠素(calcein AM，CAM)對活細胞進行熒光標記以排除細胞死亡造成的假陰性。結果顯示，10 μM ATRA在48 h對細胞CD19啟動子具有最大誘導活性(見圖2 A)。

以往研究證實，CD19和免疫球蛋白重鏈基因的啟動子區(qū)域在霍奇金淋巴瘤細胞內(nèi)存在甲基化[13-14]，因此我們進一步采用5-Aza和ATRA單獨和/或聯(lián)合孵育報告細胞后進行熒光素酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)兩種藥物能夠在3種cHL細胞系中激活CD19啟動子活性，且二者聯(lián)合用藥時具有協(xié)同效應(見圖2C)。此外，在KMH2和L428細胞中ATRA能夠顯著誘導CD79a和CD79b啟動子活性，盡管5-Aza單獨作用時對CD79a無顯著作用且對CD79b作用輕微，但是能夠增加ATRA對兩個B細胞基因的誘導作用(見圖2D和E)。

注：與空載體組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖1 穩(wěn)定轉染克隆B細胞啟動子的基因擴增和功能鑒定Note.Compared with the empty vector group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Fig.1 Amplification and functional verification of B-promoter reporters integrated into the host genome of cHL cell lines

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2 ATRA和5-Aza單獨和聯(lián)合用藥時對CD19、CD79a和CD79b外源啟動子活性的影響Note.Compared with the DMSO treated group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Fig.2 Effect of single or double treatment of ATRA and 5-Aza on the activity of B-specific promoters

由于許多化合物可與熒光素酶本身結合并影響其活性，為排除5-Aza和ATRA直接作用于熒光素酶而非B細胞啟動子，我們以SV40-pGL3-PGK-NEO穩(wěn)定轉染細胞為對照，以同樣條件加入5-Aza和/或ATRA孵育發(fā)現(xiàn)兩種藥物對SV40啟動子無作用(見圖2B)，證實5-Aza和ATRA可以特異性誘導B細胞啟動子的轉錄活性。

2.4 ATRA激活cHL細胞中內(nèi)源B細胞特異性基因轉錄和表達

注：(C)圖中圖例DMSO、AZA、ATRA和ATRA/AZA分別代表細胞進行DMSO(對照)、5-Aza、ATRA和聯(lián)合用藥。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 5-Aza和ATRA單獨和聯(lián)合用藥時對CD19、CD79a和CD79b內(nèi)源基因表達水平的影響Note.Legends in (C) represent cell treated with DMSO, 5-Aza, ATRA and combination of ATRA and 5-AZA. Compared with the DMSO treated group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Fig.3 Effect of single or double treatment of ATRA and 5-Aza on the expression of B-specific promoters

采用1和10 μmol/L ATRA孵育L428細胞，在6、24和48 h提取RNA并反轉錄，通過RQ-PCR檢測CD19和CD20基因轉錄水平的改變。如圖3 A和B所示，ATRA呈劑量和時間依賴性的誘導L428細胞內(nèi)源CD19和CD20基因轉錄。用5-Aza(圖中簡寫為AZA)和/或ATRA孵育KMH2和L428細胞48 h后，檢測內(nèi)源B細胞特異性標記物CD19、CD79a和CD79b轉錄水平發(fā)現(xiàn)，5-Aza和ATRA單獨用藥時能夠誘導內(nèi)源cHL細胞中CD19，CD79a和CD79b轉錄，且二者具有協(xié)同效應(見圖3C)。用10 μmol/L ATRA孵育KMH2和L428細胞后提取蛋白進行免疫印跡，結果顯示ATRA能夠誘導CD19、CD20和CD79b基因在KMH2和L428細胞重新表達(見圖3D)。

2.5 ATRA下調(diào)cHL細胞表面特異性CD30抗原表達水平

為揭示ATRA對cHL細胞霍奇金特異性細胞表型的影響，我們進一步檢測了ATRA處理對KMH2和L428細胞表面CD30抗原表達水平的作用。流式細胞染色顯示，與DMSO處理的對照細胞相比較，ATRA下調(diào)KMH2和L428細胞表面cHL特異性標記物CD30表達水平(見圖4)。以上結果均提示ATRA能夠誘導B細胞表型缺失的cHL細胞重新或得B細胞表型。

圖4 ATRA對cHL細胞霍奇金細胞特異性標記物CD30蛋白表達的影響Fig.4 Effect of ATRA on Hodgkin lymphoma cells regarding Hodgkin-cell specific gene CD30 expression

3 討論

cHL約占B細胞淋巴瘤發(fā)病率的10%，瘤細胞攜帶B細胞特征性的免疫球蛋白重鏈IgH基因重組，卻不具有B細胞特異性基因表達譜，包括CD19、CD20、B細胞表面受體復合物CD79a和CD79b等[15-16]，同時異常高表達B細胞非特異性基因如CD30、NOTCH1、ABF1和ID2等[12, 17-18]。瘤細胞表型的轉變對其惡性轉化及免疫逃逸有重要作用，因此尋找霍奇金淋巴瘤B細胞表型的誘導劑具有潛在的臨床治療價值。

表觀遺傳修飾如啟動子甲基化是腫瘤發(fā)生和表型轉變的重要因素[14, 19-20]。以往研究發(fā)現(xiàn)，cHL原代HRS細胞和商品化的細胞系中CD19和CD79b基因啟動子區(qū)域及組蛋白H3存在甲基化[13-14]，提示B細胞表型缺失與B細胞特異性基因的異常甲基化修飾有關。然而，Hummel[21]和我們以往研究表明，去甲基化藥物5-Aza處理cHL細胞并未顯著誘導其B細胞特異性基因的表達[22]，提示尚有其它因素阻遏cHL細胞內(nèi)B細胞基因的轉錄和翻譯。

以CD19為標記，Chen等[8]發(fā)現(xiàn)ATRA能夠誘導小鼠和人的淋巴母細胞向B細胞分化。為進一步探索ATRA對B細胞表型缺失的霍奇金淋巴瘤重新向B細胞分化的誘導作用，本研究首先建立了B細胞特異性啟動子(CD19，CD79a和CD79b)驅動熒光素酶穩(wěn)定整合的cHL報告細胞系。其中CD19啟動子包含了B細胞特異性增強子Eμ、B細胞特異性轉錄因子PAX5和EBF的結合位點和甲基化修飾位點[9]，其穩(wěn)定整合能夠更好的模擬和反映內(nèi)源CD19啟動子活性狀態(tài)。同時，為驗證外源啟動子功能的完整性，我們敲除了在cHL中異常高表達的轉錄因子ABF1，發(fā)現(xiàn)ABF1沉默可以顯著提高CD19、CD79a和CD79b啟動子驅動的熒光素酶活性，證明外源啟動子能夠忠實的反應相應內(nèi)源基因啟動子的轉錄活性。

以B細胞啟動子報告細胞和親本cHL細胞為模型，我們發(fā)現(xiàn)ATRA能夠誘導CD19、CD20、CD79a和CD79b的轉錄與表達，同時降低細胞表面霍奇金細胞特異性CD30抗原表達水平，提示ATRA能夠激活cHL內(nèi)B細胞特異性轉錄程序并誘導其重新向B細胞轉化。去甲基化藥物5-Aza聯(lián)合應用能夠進一步提高B細胞特異性基因的表達水平。臨床上，抗CD20的單克隆抗體治療在具有B細胞表型的非霍奇金淋巴瘤病人上取得了顯著療效，此外有大量靶向CD19的抗體在淋巴瘤治療的相關研究[23-25]。由于表型缺失，CD20單抗在cHL病人治療中的療效受到了限制，ATRA對cHL細胞中CD19和CD20表達的誘導或可促進單克隆抗體對復發(fā)或耐藥cHL病例中的應用。

綜上所述，我們建立了穩(wěn)定整合B細胞特異性啟動子驅動熒光素酶的cHL細胞系，該報告細胞可用于后續(xù)B細胞表型誘導藥物的篩選。本研究發(fā)現(xiàn)ATRA能有誘導去分化的cHL細胞重獲B細胞表型，具有增敏cHL對靶向B細胞表型單抗治療的潛在作用。

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