趙 楊，戴海峰，劉莎莎，王智慧，李 嘉

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

手術(shù)治療已經(jīng)成為肩袖撕裂的首選治療方式，然而，無論選擇何種手術(shù)方案其術(shù)后肩袖再撕裂率在38%～90%之間[1]。如何提高肩袖修復(fù)術(shù)后的腱-骨界面的愈合能力是目前運動醫(yī)學(xué)研究焦點，隨著現(xiàn)代組織工程學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，新的修復(fù)技術(shù)和材料為解決這一問題提供了思路和方法[2-3]，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)，小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)，富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)等得以開發(fā)應(yīng)用以促進腱-骨愈合，但對其效果優(yōu)劣尚無統(tǒng)一定論。骨膜具有很強的成骨潛能，最新研究表明[4]，骨膜移植物可以提供未分化細胞填充腱骨界面間隙，促進腱骨愈合。因此，本研究使用自體骨膜補片加強修復(fù)兔急性肩袖撕裂，通過組織學(xué)觀察和生物力測試證實自體骨膜補片可以有效地促進肩袖腱骨愈合，提高其生物學(xué)特性。報道如下：

注：a：兔岡上肌肌腱；b：急性岡上肌撕裂模型；c：單純縫合修復(fù)岡上??；d：自體骨膜補片；e：骨膜加強修復(fù)岡上?。籪：正常兔骨肌腱連接結(jié)構(gòu)模型。圖1 兔骨肌腱連接結(jié)構(gòu)的制備Note.a: Rabbit supraspinatus tendon. b: Acute rotator cuff tear model. c: Simple suture fixation. d: Autologous periosteum patch. e: Enhanced repair of supraspinatus muscle with the periosteal patch. f: Bone-tendon junction model.Fig.1 Preparation of the rabbit bone-tendon junction

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭兔60只，4～5個月齡，體重2.5～3.0 kg，雌雄各半，由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實驗動物中心提供[SCXK(冀)2015-0100]，在承德醫(yī)學(xué)院動物實驗中心分籠飼養(yǎng)[SYXK(冀)20014-0012]，常規(guī)飲食飲水。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑和儀器

蘇木精(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號717111)；伊紅(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號717093)；Masson三色染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號616121)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus顯微鏡公司)；萬能材料試驗機(美國Instron公司)；2-0可吸收縫線(美國Depuy公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

新西蘭兔60只建立急性肩袖撕裂模型。每只新西蘭兔隨機選取一側(cè)肩關(guān)節(jié)為實驗組，使用自體骨膜補片加強修復(fù)肩袖撕裂，另一側(cè)肩關(guān)節(jié)作為對照組，單純行肩袖縫合術(shù)治療，實驗中對動物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標準。

1.3.2 手術(shù)方法

使用30 g/L的巴比妥鈉按1 mL/kg體重經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉，常規(guī)脫毛、備皮、消毒鋪單后，對照組在肩關(guān)節(jié)做長約2 cm的皮膚縱行切口，鈍性分離三角肌，顯露岡上肌腱性部分，于岡上肌止點處銳性切斷岡上肌肌腱，造成急性肩袖撕裂模型。用直徑1 mm克氏針在大結(jié)節(jié)上打2平行骨隧道備用，岡上肌止點去皮質(zhì)新鮮化處理，用2-0可吸收縫線將肩袖殘端原位縫合，尾線穿過骨道固定，縫合后逐層關(guān)閉切口；實驗組用相同方法造模后，縱行切開脛骨近端皮膚1 cm，盡量銳性剝?nèi)ス悄け砻娴睦w維組織，切取10 mm×5 mm大小的骨膜組織，置于生理鹽水中備用，切取時盡量減少對骨膜生發(fā)層的損害，于腱骨止點處骨膜生發(fā)層朝向關(guān)節(jié)側(cè)完全覆蓋肩袖斷端，用2-0可吸收縫線將骨膜補片加強修補。見圖1。術(shù)后即允許兔自由行走，術(shù)后3 d內(nèi)予肌注慶大霉素(4000 U/d)抗感染，密切觀察新西蘭兔術(shù)后活動、進食和傷口愈合情況。

注：a：術(shù)后4周實驗組間充質(zhì)細胞增生明顯，少量軟骨細胞；b：術(shù)后4周對照組腱骨間隙明顯，成纖維細胞增生；c：術(shù)后8周實驗組大量未成熟軟骨細胞，排列略規(guī)整；d：術(shù)后8周對照組膠原纖維連接，少量軟骨細胞；e：術(shù)后12周實驗組類似正常腱骨界面；f：術(shù)后12周對照組腱骨連接不緊密，軟骨細胞排列紊亂。T：肌腱；B：骨；IF：腱骨界面。圖2 兔BTJ組織HE染色(×40)Note.a: At 4 weeks, mesenchymal cells proliferate obviously in the experimental group. b: At 4 weeks, the tendon-bone gap exists and the fibroblast proliferation in the control group. c: At 8 weeks, a large number of immature chondrocytes are arranged in a regular way in the experimental group. d: At 8 weeks, collagen fiber connections are observed in the control group. e: The tendon-bone interface structure is similar to normal in the experimental group at 12 weeks after repair. f: At 12 weeks, disordered arrangement of chondrocytes in the control group. T: tendon. B: bone. IF: tendon-bone interface.Fig.2 Histological changes of the healing process of rabbit bone-tendon tear. HE staining

1.3.3 標本獲取

分別于術(shù)后4、8、12周戊巴比妥鈉麻醉后處死新西蘭兔20只，每組10個標本以岡上肌肌腱止點為中心，取肱骨近端包括腱-骨交界面的大結(jié)節(jié)組織，大小約10 mm×5 mm×5 mm，進行組織學(xué)觀察，10個標本保留肱骨和完整的岡上肌組織作為完整的骨-肌腱結(jié)合部(bone-tendon junction, BTJ)，進行生物力學(xué)實驗。

1.3.4 大體觀察

觀察實驗動物的大體情況。

1.3.5 病理學(xué)觀察

選取標本以4%甲醛溶液固定3 d，再以100 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液充分脫鈣4周，標本再依次脫水、透明、石蠟包埋，制成5 μm層厚的連續(xù)切片，分別進行HE染色、Masson染色后光鏡下觀察岡上肌止點腱-骨界面結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.6 生物力學(xué)測試

選取后的BTJ樣本，用2號Ethibond縫線編織肌腱，用義齒基托包埋肱骨遠端，標本固定后應(yīng)用萬能材試驗機進行生物力學(xué)拉伸試驗，2.5 N為初始負荷，以牽拉速度5 mm/min行拉斷實驗，記錄腱-骨界面承受的最大抗拉力值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

注：a：術(shù)后4周對照組可見疏松結(jié)締組織；b：術(shù)后4周實驗組可見大量膠原纖維排列；c：術(shù)后8周對照組膠原纖維連接，瘢痕愈合傾向；d：術(shù)后8周實驗組膠原纖維層和軟骨層交錯排列；e：術(shù)后12周對照組腱骨界面結(jié)構(gòu)紊亂；f：術(shù)后12周實驗組腱骨界面愈合良好；T：肌腱；B：骨；IF：腱骨界面。圖3 兔BTJ組織Masson染色(×200)Note.a: At 4 weeks, loose connective tissue is found in the control group. b：At 4 weeks, a large amount of collagen fibers is observed in the experimental group. c: At 8 weeks, scar healing tendency is observed in the control group. d: At 8 weeks, the collagen fiber layer and cartilage layer are arranged alternately in the experimental group. e: At 8 weeks, a disordered tendon-bone interface in the control group. f: At 8 weeks, the tendon-bone interface healed well in the experimental group. T: Tendon. B: Bone. IFI: Tendon-bone Interface.Fig.3 Histological changes of the healing process of rabbit bone-tendon tear. Masson staining

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

實驗動物于相同清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，手術(shù)后所有新西蘭兔飲食等健康狀況良好，術(shù)前、術(shù)后均可自由活動，觀察期間無發(fā)熱、切口紅腫等情況發(fā)生，術(shù)后3 d后新西蘭兔上肢活動情況恢復(fù)術(shù)前狀況，未發(fā)現(xiàn)肢體活動量減少，僵硬等現(xiàn)象。

2.2 組織學(xué)觀察

HE染色可以大體觀察到BTJ的組織結(jié)構(gòu)，初步評價愈合效果，Masson染色可以觀察組織的膠原纖維分布，有助于評估肩袖的腱-骨愈合效果。(見圖2，3)

實驗組：術(shù)后4周：腱骨間隙不明顯，間充質(zhì)細胞增生明顯，骨膜內(nèi)可見少量新生軟骨細胞和基質(zhì)；術(shù)后8周：肌腱膠原纖維束狀排列，腱骨界面可見成骨反應(yīng)，大量未成熟軟骨細胞，排列略規(guī)整，部分向肌腱內(nèi)長入。術(shù)后12周：肌腱與骨結(jié)合緊密，肌腱膠原纖維粗大規(guī)則，軟骨細胞成熟排列規(guī)整，類似正常的腱骨界面結(jié)構(gòu)。

對照組：術(shù)后4周：肌腱與骨的間隙較明顯，可見壞死組織，大量炎性細胞浸潤，其內(nèi)有新生肉芽組織，成纖維細胞增生；術(shù)后8周：腱骨間隙由纖維肉芽組織填充，通過大量成纖維細胞和膠原纖維相連，少量軟骨細胞形成，提示瘢痕愈合傾向；術(shù)后12周：腱骨間隙模糊，膠原纖維連接，軟骨細胞排列紊亂

2.3 生物力學(xué)測試

在生物力學(xué)拉伸實驗過程中，所有標本最大負荷時均在岡上肌止點縫合處斷裂；其最大負荷隨術(shù)后時間延長而增大，差異有顯著性(P< 0.05)；各時間段實驗組最大負荷強度明顯高于對照組，差異有顯著性(P< 0.05)。(見表1)

表1 實驗組、對照組不同時間段最大失效負荷對比Tab.1 Comparison of the maximum failure load in the experimental group and control group at different time points

注：與同時間段對照組相比，*P< 0.05；組內(nèi)與前一時間段相比，#P< 0.05。

Note.Compared with the control group at the same time，*P< 0.05. Compared with the previous period in the same group,#P< 0.05.

3 討論

肩袖損傷修復(fù)術(shù)后最主要的難題是肩袖止點組織結(jié)構(gòu)無法恢復(fù)到正常形態(tài)，其病理學(xué)研究表明肩袖損傷后的腱骨界面內(nèi)纖維軟骨層無法再生，僅由瘢痕組織替代，導(dǎo)致形成的間接止點機械性能遠低于正常的直接止點，容易發(fā)生再撕裂。隨著人們對肩袖損傷修復(fù)過程及腱骨愈合機制的認識不斷加深，不同的治療策略得以開發(fā)、應(yīng)用以促進肩袖損傷后修復(fù)效果[5]。最新的研究熱點是如何在肩袖損傷修復(fù)基礎(chǔ)上聯(lián)合生物增強技術(shù)或現(xiàn)代組織工程技術(shù)有效的促進肩袖損傷后腱骨愈合[6]。

目前應(yīng)用較多的促進腱-骨愈合生物工程學(xué)方法包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、小腸黏膜下層組織(small intestinal submucosa, SIS)、富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)等。然而，這些治療措施在加速腱骨愈合和降低腱骨界面纖維疤痕組織是有效的，但促進纖維軟骨的形成效果欠佳[7-8]。纖維軟骨區(qū)是腱骨連接部位特征性結(jié)構(gòu)，它能夠緩沖應(yīng)力，減少再撕裂發(fā)生，止點處軟骨再生對改善肩袖腱骨愈合質(zhì)量起重要作用。本研究選用自體骨膜作為補片來源，主要由于骨膜內(nèi)側(cè)含有大量未分化的間充質(zhì)干細胞(MSCs)，MSCs能夠在體內(nèi)、體外快速增殖，同時具有多向分化能力，可以分化成為成骨細胞和軟骨細胞[9-11]。Lim等[12]在腘肌腱上移植MSCs，發(fā)現(xiàn)2周后腱骨界面有大片軟骨細胞形成，8周后有軟骨成熟區(qū)形成。在肩袖腱骨愈合過程中，骨膜補片還可產(chǎn)生提高細胞的生長和分化的生物活性因子[13-16]，其主要包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，BMP-2等，這些生長因子有助于骨膜向軟骨生長和轉(zhuǎn)化。Chen等[17]在肩袖損傷模型中使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-骨膜前體細胞水凝膠加強修復(fù)腱骨愈合，結(jié)果觀察到腱-骨界面組織愈合改善，生物力測試最大載荷明顯提高。此外，使用自體骨膜補片作為修復(fù)肩袖撕裂的組織工程支架，具有良好的生物學(xué)潛能。張琪等[18]通過對不同方案制備兔脛骨骨膜生物支架研究表明，處理后骨膜支架有良好的生物相容性，滿足生物工程支架要求。

既往動物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，兔的岡上肌形態(tài)和功能與人類相似，兔在籠養(yǎng)時比其他實驗動物上肢單獨活動機會多，本研究采用李奉龍等[19]的兔急性肩袖損傷的造模方法對肩袖的腱骨愈合進行研究。李衛(wèi)國等[20]和陳百成等[21]研究證明骨膜成軟骨能力隨年齡增加而降低，但成年兔骨膜受刺激后再生軟骨能力可恢復(fù)，此外，脛骨近端的骨膜切取具有取材方便、并發(fā)癥少、對實驗肢體活動無影響等優(yōu)點。多篇研究[22-24]通過動物模型研究證實肩袖修復(fù)術(shù)后需要8～12周的愈合時間，而肩袖補片需要8～10周的時間吸收降解，因此，本研究采用4、8和12周三個觀察時間點能更充分的說明自體骨膜補片對肩袖腱-骨愈合的影響。結(jié)果表明使用自體骨膜補片加強修復(fù)肩袖，在組織學(xué)方面，腱骨愈合早于對照組，并且肌腱與骨結(jié)合緊密，軟骨細胞排列規(guī)整，類似正常的腱骨界面結(jié)構(gòu)，其腱骨連接緊密程度及止點軟骨細胞排列明顯優(yōu)于單純修復(fù)組；在力學(xué)方面，實驗組修補術(shù)后各時間階段岡上肌腱抗牽拉強度也明顯高于對照組，利于術(shù)后早期康復(fù)鍛煉。此外，筆者認為在臨床實踐中，使用骨膜補片加強修復(fù)肩袖適用于肩袖撕裂直徑>5 cm的巨大型撕裂，尤其對于術(shù)前病程長，MRI顯示肩袖回縮嚴重，質(zhì)地差，脂肪浸潤超過50%的老年患者，手術(shù)自體骨膜切取應(yīng)避免副損傷發(fā)生。

綜上所述，使用自體骨膜作為補片來源能有效提高肩袖腱骨愈合強度，縮短腱骨愈合時間，有良好的生物學(xué)特性，為臨床上提高肩袖損傷修復(fù)手術(shù)成功率提供了一定的實驗基礎(chǔ)，但本研究還需進一步的臨床試驗證實。

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