楊愛玲，武 汀，張?zhí)祛?，韓 冰，孫建寧，張碩峰*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.哈爾濱珍寶制藥有限公司，哈爾濱 150060)

血栓通膠囊 (xueshuantong, XST)[1]是開發(fā)的一種血栓通注射液改良口服制劑，其主要成分為三七總皂苷 (panax notoginseng saponins，PNS)，主要作用是活血祛瘀，通脈活絡(luò)。臨床上常用于中風(fēng)偏癱、胸痹心痛。此課題前期結(jié)果顯示，PNS對(duì)腦缺血再灌注模型小鼠腦微血管白蛋白滲出有抑制作用。但是，PNS對(duì)缺血致血管緊密連接損傷的保護(hù)作用及其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制未見報(bào)道，亟待深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)借助Transwell小室，構(gòu)建HUVEC細(xì)胞緊密連接模型，考察PNS對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation，OGD/R)致細(xì)胞緊密連接損傷的改善，從體外角度考察PNS對(duì)缺血致內(nèi)皮緊密連接損傷的保護(hù)作用，探討PNS有效單體成分，為PNS口服制劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

血栓通膠囊原料三七總皂苷，哈爾濱珍寶制藥有限公司提供，為類白色至淡黃色無定形粉末，味苦，微甘，批號(hào)20111201，主要單體成分為Rg1(31.1%)、Rb1(33.8%)、Rd(7%)、Re(3.9%)、R1(9.2%)，試驗(yàn)前用PBS配制。

ECM培養(yǎng)基(1001)，批號(hào)19130，Sciencell公司；無糖培養(yǎng)基，Gibco 公司；fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kD(FD70S)，批號(hào)SLBG0356 V，Sigma公司；Transwell細(xì)胞小室，BD公司；Prolong Gold antifade reagent with DAPI(P36941)，批號(hào) 1753492，Thermofisher 公司；封閉用正常羊血清ZLI-9022，批號(hào) WK153325，中杉金橋生物技術(shù)有限公司；厭氧產(chǎn)氣條，批號(hào) 1003976390，BioMerieux公司；厭氧指示條(96118)，批號(hào) 1004170150，BioMerieux公司；甲醇，批號(hào)20021022，北京化工試劑廠。

1.2 主要儀器

MERS00002電阻儀，由Millipore公司生產(chǎn)；厭氧盒，由BioMerieux公司生產(chǎn)；圓形細(xì)胞爬片(24孔)，型號(hào)WHB-24-CS，WHB 生產(chǎn)；壓力蒸汽滅菌器，超凈工作臺(tái)，由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，由黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；細(xì)胞培養(yǎng)箱，由美國(guó) Revco 公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡，由德國(guó)Leica 公司生產(chǎn)；臺(tái)式低溫離心機(jī)，由北京眾益中和生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 內(nèi)皮間緊密連接電阻

將 HUVEC細(xì)胞按照1.0×105/cm2接種于Transwell 24 孔板，上室300 μL培養(yǎng)液，下室700 μL培養(yǎng)基，采用EVOM2電阻儀檢測(cè)跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electrical resistance， TEER)值，通過減去空白對(duì)照沒有接種細(xì)胞小室膜的TEER值，得到該小孔細(xì)胞的TEER值。自TEER值即將穩(wěn)定作為起始開始記錄。

待 Transwell 中內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)4 d 達(dá)到完全融合，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成無糖培養(yǎng)基置缺氧箱中缺氧6 h后，換成正常ECM內(nèi)皮培養(yǎng)基置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中再灌注24 h，檢測(cè)TEER值。給藥組設(shè)定PNS終濃度為10、20、40 μg/mL；人參皂苷Rb1 13.52 μg/mL；人參皂苷Rg1 12.44 μg/mL。

1.3.2 內(nèi)皮細(xì)胞間滲透性

將HUVEC按照1.0×105/cm2接種于24 孔板，上室300 μL培養(yǎng)液，下室700 μL培養(yǎng)基，待 Transwell 中內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)4 d達(dá)到完全融合，開始實(shí)驗(yàn)。

在 Transwell上室中加入終濃度為1 mg/mL FITC-葡聚糖(70 kd)的無糖培養(yǎng)基200 μL，下室加入無糖培養(yǎng)基700 μL，置缺氧盒中缺氧6 h后，以正常 ECM 完全培養(yǎng)基替換無糖培養(yǎng)基，置正常培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h后，在每個(gè)下池取樣品100 μL，置于96孔板中，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm，檢測(cè)滲透到下室FITC-葡聚糖的熒光強(qiáng)度。給藥組設(shè)定PNS終濃度為10、20、40 μg/mL；人參皂苷Rb1 13.52 μg/mL；人參皂苷Rg1 12.44 μg/mL。依據(jù)FITC-葡聚糖的熒光強(qiáng)度判斷葡聚糖滲透到外池的量，從而判斷 PNS對(duì)緊密連接蛋白的調(diào)控。

1.3.3 免疫熒光

取出已固定好的內(nèi)皮細(xì)胞爬片，置常溫甲醇中，移至-40℃固定30 min，取出置室溫10 min，PBS漂洗10 min×3次；加入封閉液，37℃封閉30 min；加入兔抗大鼠ZO-1(1∶100)、claudin-5(1∶100)37℃孵育1 h，PBS漂洗10 min×3次；加入二抗FITC標(biāo)記羊抗兔以及FITC標(biāo)記羊抗小鼠，避光，37℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3 次；加入含DAPI封閉液，避光，室溫孵育5 min，PBS漂洗5 min×2次，30%甘油封片，指甲油固定，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 三七總皂苷及人參皂苷 Rb1、Rg1改善氧糖剝奪致HUVEC細(xì)胞電阻值損傷

PNS 20、40 mg/L組能夠顯著抑制模型組緊密連接電阻的降低(模型組，65±5.0 Ω；PNS 20、40 mg/L分別為 95±4.6 Ω、101±6.0 Ω；P< 0.01，P< 0.05)。人參皂苷Rb1能夠顯著升高OGD 6 h復(fù)氧24 h后內(nèi)皮緊密連接電阻(模型組，75±6.4 Ω；Rb1 13.52 mg/L 97±2.0 Ω)。人參皂苷Rg1 對(duì) HUVEC細(xì)胞緊密連接電阻值無明顯影響。(見圖1～2)

注：A:正常對(duì)照組；B:模型組；C: PNS 10 mg/mL；D: PNS 20 mg/mL；E: PNS 40 mg/mL；與模型組對(duì)比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖1 PNS對(duì)氧糖剝奪致HUVEC細(xì)胞電阻值損傷改善作用Note.A: Control group.B: Model group.C: PNS 10 mg/mL.D: PNS 20 mg/mL.E: PNS 40 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.1 Effects of PNS on the transendothelial electrical resistance of HUVEC cells after OGD 6 h/Reox 24 h

注：A:正常對(duì)照組；B:模型組；F: Rb1 13.52 mg/mL；G: Rg1 12.44 mg/mL；與模型組對(duì)比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 人參皂苷Rb1、Rg1對(duì)氧糖剝奪致HUVEC細(xì)胞電阻值損傷改善作用Note.A: Control group.B: Model group.F: Rb1 13.52 mg/mL.G: Rg1 12.44 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 Effects of Rb1 and Rg1 on the transendothelial electrical resistance (TEER) of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

2.2 三七總皂苷及人參皂苷 Rb1、Rg1改善氧糖剝奪致HUVEC細(xì)胞滲透性損傷

PNS 20、40 mg/L組能夠顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的升高(正常對(duì)照組，0.082±0.00；模型組，0.097±0.01；PNS 20、40 mg/L分別為 0.085±0.00，0.086±0.01；P< 0.01)。人參皂苷Rb1能夠顯著抑制OGD 6 h復(fù)氧24 h后內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的升高(正常對(duì)照組，0.083±0.00，模型組，0.10±0.01；Rb1 13.52 mg/L 0.087±0.00)。人參皂苷Rg1 對(duì) HUVEC細(xì)胞滲透性增加無明顯影響。(見圖3～4)

注：A:正常對(duì)照組；B:模型組；C: PNS 10 mg/mL；D: PNS 20 mg/mL；E: PNS 40 mg/mL；與模型組對(duì)比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 三七總皂苷對(duì)氧糖剝奪致內(nèi)皮細(xì)胞滲透性損傷的改善作用Note.Note.A: Control group.B: Model group.C: PNS 10 mg/mL.D: PNS 20 mg/mL.E: PNS 40 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.3 Effects of PNS on the permeability of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

注：A:正常對(duì)照組；B:模型組；F: Rb1 13.52 mg/mL；G: Rg1 12.44 mg/mL；與模型組對(duì)比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖4 人參Rb1、Rg1對(duì)氧糖剝奪致內(nèi)皮細(xì)胞滲透性損傷的改善作用Note.A: Control group.B: Model group.F: Rb1 13.52 mg/mL.G: Rg1 12.44 mg/mL. Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.4 Effects of Rb1 and Rg1 on the permeability of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

2.3 三七總皂苷及其單體對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖致 HUVEC 細(xì)胞緊密連接蛋白損傷的改善作用

正常組HUVEC 細(xì)胞的ZO-1及claudin-5蛋白主要分布于臨近細(xì)胞膜，排列連續(xù)，顯示出內(nèi)皮細(xì)胞的典型鋪路石排列。缺氧6 h復(fù)氧24 h損傷后，細(xì)胞邊緣的緊密連接蛋白顯著減少，環(huán)形結(jié)構(gòu)斷裂，甚至消失，細(xì)胞核內(nèi)緊密連接蛋白呈增加趨勢(shì)。PNS 20、40 mg/L及Rb1 13.52 mg/L組可觀察到細(xì)胞間緊密連接局部恢復(fù)。PNS 10 mg/L、Rg1 12.44 mg/L組沒有觀察到明顯變化。(見圖5～6)

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接(tight junction，TJ)是維持粘血管通透性和機(jī)械屏障的重要結(jié)構(gòu)[2-5]：緊密連接調(diào)節(jié)著離子和大分子物質(zhì)的跨細(xì)胞旁路的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，只允許離子及小分子可溶性物質(zhì)通過，而不允許毒性大分子及微生物通過。內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接一旦發(fā)生變異、減少或缺失，血管通透性就會(huì)增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素及大分子物質(zhì)就可通過緊密連接進(jìn)入體循環(huán)。因此，緊密連接在血管屏障功能中的作用至關(guān)重要，闡明其分子結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制，對(duì)認(rèn)識(shí)屏障功能及防治相關(guān)疾病的發(fā)生具有重要意義。

體外內(nèi)皮屏障功能的研究中，內(nèi)皮細(xì)胞電阻和內(nèi)皮滲透性是評(píng)價(jià)體外細(xì)胞緊密連接形成與否的黃金指標(biāo)。細(xì)胞間連接構(gòu)成了循環(huán)細(xì)胞及大分子物質(zhì)從血液到組織的重要屏障，穩(wěn)定了血管內(nèi)液體的膠體滲透壓，維持血管張力，允許血漿和循環(huán)的白細(xì)胞的選擇性通過，確保生理功能的正常，包括緊密連接、粘附連接和縫隙連接。其中，緊密連接是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間主要連接方式，構(gòu)成血管屏障的結(jié)構(gòu)功能基礎(chǔ)。Transwell，又稱為細(xì)胞小室，已廣泛用于細(xì)胞共培養(yǎng)、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移和細(xì)胞趨化方面的研究，較好地模擬了血腦屏障、腸粘膜屏障、胎盤屏障、腹透屏障及視網(wǎng)膜屏障等生物屏障。本實(shí)驗(yàn)借助Transwell小室，構(gòu)建HUVEC細(xì)胞緊密連接模型，考察了PNS對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation，OGD/Reox)致細(xì)胞緊密連接損傷的改善情況，并探討了PNS有效單體成分。

Shimotake等[6]發(fā)現(xiàn)蛋白C的活化能夠通過上調(diào)血管緊張素1及其受體Tie2的表達(dá)，抑制 HUVEC 內(nèi)皮通透性的增加，上調(diào)緊密連接 ZO-1的表達(dá)。以往研究顯示，PNS 50、100 mg/L可抑制β-淀粉樣蛋白42所致BalB/c小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力降低，上調(diào)ZO-1蛋白的表達(dá)[7]；PNS 25、50、100 mg/L能夠抑制鋁暴露24 h致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞BalB/c細(xì)胞基因及蛋白的表達(dá)的降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PNS 20、40 mg/L可以顯著抑制OGD致HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞電阻的降低，抑制OGD致HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞 FITC-葡聚糖的滲出，顯著促進(jìn)OGD損傷后緊密連接蛋白ZO-1及claudin-5的再度融合，發(fā)揮對(duì)缺氧缺糖誘導(dǎo)下內(nèi)皮屏障功能損傷的保護(hù)作用。PNS 10 mg/L對(duì)OGD 致HUVEC 緊密連接損傷沒有顯著影響。楊麗鹍等[8]、 Chen等[9]采用MCAO致腦缺血再灌注損傷模型小鼠，觀察到人參皂苷 Rb1 能夠顯著降低術(shù)后48 h腦水腫增加，降低伊文思藍(lán)的滲出，并通過降低 MMP-9以及NOX4的表達(dá)上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1、occludin 的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1能夠顯著抑制OGD致HUVEC內(nèi)皮電阻的降低，抑制OGD致HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞 FITC-葡聚糖的滲出，并能夠促進(jìn)OGD損傷后緊密連接蛋白ZO-1及claudin-5的再度融合。

注：a：正常對(duì)照組；b：模型組；c：三七總皂苷10 mg/L組；d：三七總皂苷20 mg/L；e：三七總皂苷40 mg/L；f：人參皂苷Rb1 13.52 mg/L；g：人參皂苷Rg1 12.44 mg/L。圖5 三七總皂苷及其單體成分人參皂苷Rb1、Rg1對(duì)氧糖剝奪致HUVEC 細(xì)胞的ZO-1蛋白的改善作用(免疫熒光染色，Bar=100 μm)Note.a：Control group.b：OGD 6 h/Re 24 h group.c：PNS 10 mg/L group.d：PNS 20 mg/L group.e：PNS 40 mg/L group.f：Rb1 13.52 mg/L group.g：Rg1 12.44 mg/L group.Fig.5 Effects of PNS and Rb1/Rg1 on ZO-1 in HUVEC cells after OGD 6 h/R24 h treatment. Immunofluorescence staining.

注：a：正常對(duì)照組；b：模型組；c：三七總皂苷10mg/L組；d：三七總皂苷20mg/L；e：三七總皂苷40mg/L；f：人參皂苷Rb113.52mg/L；g：人參皂苷Rg112.44mg/L。 圖6 三七總皂苷及其單體成分人參皂苷Rb1、Rg1對(duì)氧糖剝奪致HUVEC細(xì)胞的Claudin-5蛋白的改善作用(免疫熒光染色，Bar=100μm) Note.a:Controlgroup.b:OGD6h/Reox24hgroup.c:PNS10mg/Lgroup.d:PNS20mg/Lgroup.e:PNS40mg/Lgroup.f:Rb113.52mg/Lgroup.g:Rg112.44mg/Lgroup. Fig.6 EffectsofPNSandRb1/Rg1onclaudin-5intheHUVECcellsafter OGD6h/Reox24htreatment.Immunofluorescencestaining

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