閻彥霏，蘇秀敏，楊秋萍，陳 進(jìn)，秦明倩，施春雷，史賢明，陳 佳，楊保偉*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海 200240 3 石家莊學(xué)院化工學(xué)院 石家莊 050035）

沙門氏菌（Salmonella）是常見的腸道致病菌，其導(dǎo)致的食源性疾病爆發(fā)與食用畜禽產(chǎn)品關(guān)聯(lián)較多，引發(fā)的腸胃炎、敗血癥等疾病對人類健康和社會經(jīng)濟(jì)造成很大的影響[1-4]。沙門氏菌對人類的感染主要取決于其血清型和食用者的身體狀況。有研究表明，不同血清型沙門氏菌在我國各省份不同食品中檢出程度不同。胡豫杰等[5]對我國6 省份零售整雞中沙門菌血清型分布研究顯示，腸炎沙門氏菌、印第安納沙門氏菌和嬰兒沙門氏菌為優(yōu)勢血清型。鐘舒紅等[6]、劉雪杰等[7]對廣西省畜禽產(chǎn)品源和福建省食源性沙門氏菌的研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌和腸炎沙門氏菌亦為主要血清型。由于腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌等均可產(chǎn)生耐熱的腸毒素，不僅可導(dǎo)致宿主產(chǎn)生腹瀉等食源性疾病，而且會引發(fā)其它更為嚴(yán)重的癥狀[3，8-10]。這些沙門氏菌常在動物性食品[5，11-13]和食品環(huán)境[5，14]被檢出，對食品安全帶來極大威脅。

沙門氏菌在食品中流行狀況不同，不同血清型的沙門氏菌及菌株個體在宿主體內(nèi)代謝各異[3]，其同源關(guān)系及來源追溯可通過基因分型的方法進(jìn)行。作為沙門氏菌基因型分析的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，脈沖場凝膠電泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE）技術(shù)在國內(nèi)外被應(yīng)用于各種病原菌的分子分型[15-19]。開展雞肉源沙門氏菌的血清型和基因型，可豐富我國食源性致病菌分子流行病學(xué)特性數(shù)據(jù)庫，為預(yù)警和控制食源性疾病爆發(fā)、保障食品安全提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 沙門氏菌共399 株，分離于采集自廣東省、廣西省、福建省和上海市的576 份零售雞肉樣品，菌株的分離和鑒定參考Cui 等[20]的方法進(jìn)行。布倫登盧普沙門氏菌（Salmonella Braenderup）H9812 為中國食品藥品檢定研究院惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 Luria-Bertani（LB）營養(yǎng)瓊脂、胰酪胨大豆瓊脂（Trypticase Soy Agar；TSA）和半固體營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；PFGE 專用瓊脂糖（SeaKem Gold Agarose），美國Cambrex Bio Science 公司；十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-Hcl）、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF） 等均為分析純，Sigma 公司；硼酸和氯化鈉均為分析純，西安化學(xué)試劑廠；蛋白酶K 和限制性內(nèi)切酶XbaI，寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；Xba I 酶切緩沖液、蛋白酶K 緩沖液和牛血清蛋白（BSA）為商品酶自帶；細(xì)胞懸浮液（Cell Suspension Buffer；CSB）、細(xì)胞裂解液（Cell Lysis Buffer；CLB）、TE 緩沖液和0.5×TBE 電泳緩沖液均自行配制。

1.1.3 沙門氏菌分型用血清 抗血清為泰國S &A 公司的沙門氏菌診斷血清，包括沙門氏菌O 多價抗血清（Salmonella O Polyvalent Antisera），O群抗血清（Salmonella O Group Antisera），O 單因子抗血清（Salmonella O Factor Antisera），H 多價抗血清（Salmonella H Polyvalent Antisera），H 相抗血清（Salmonella H phase Antisera），H 單因子抗血清（Salmonella H Factor Antisera）和H 抗原誘導(dǎo)相抗血清（Salmonella H for Phase Inversion Antisera）。

1.2 血清型鑒定

鑒定按照泰國S&A 公司提供的沙門氏菌診斷血清操作步驟和說明進(jìn)行，查閱S&A 公司沙門氏菌抗血清診斷附錄和沙門氏菌檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 4789.4-2016），根據(jù)測定得到的抗原式，確定沙門氏菌的血清型。

1.3 PFGE

PFGE 分型按照美國疾病預(yù)防控制中心推薦的分型方法進(jìn)行。電泳凝膠使用溴化乙錠染色后成像，用MINITAB 16 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（P＜0.05 表示差異顯著），并用BioNumerics 軟件聚類分析，確定沙門氏菌基因型及同源關(guān)系。布倫登盧普沙門氏菌H9812 為分型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌。

2 結(jié)果和分析

2.1 零售雞肉中沙門氏菌血清型分布

399 株沙門氏菌共檢出47 種血清型（表1）。檢出率最高的為腸炎沙門氏菌（17.04%），但與鼠傷寒沙門氏菌（16.04%） 和印第安納沙門氏菌（14.04%）的檢出率間無顯著性差異。該3 種血清型沙門氏菌的檢出率顯著高于湯卜遜沙門氏菌（9.02%）和阿貢納沙門氏菌（7.52%）。腸炎沙門氏菌在福建省、上海市和廣西省的檢出率顯著高于廣東省，鼠傷寒沙門氏菌、湯卜遜沙門氏菌和阿貢納沙門氏菌的檢出率在4 省份間無顯著性差異（表1）。

表1 零售雞肉中不同血清型沙門氏菌的檢出率Table 1 Detection rate Salmonella serovars in retail chickens

（續(xù)表1）

廣東省零售雞肉源沙門氏菌中共檢出22 種血清型，主要為鼠傷寒沙門氏菌（20.00%）、阿貢納沙門氏菌（10.77%）、印第安納沙門氏菌和湯卜遜沙門氏菌（9.23%）、羅森沙門氏菌（8.46%）、腸炎沙門氏菌（6.15%）和杜塞爾多夫沙門氏菌（3.85%）等。上海市共檢出13 種血清型，以印第安納沙門氏菌（26.83%）最為常見，其次分別為腸炎沙門氏菌（20.73%）、鼠傷寒沙門氏菌（15.85%）、湯卜遜沙門氏菌（10.98%）和阿貢納沙門氏菌（3.66%）等。福建省共檢出15 種血清型，以腸炎沙門氏菌（29.27%）最為常見，其次分別為印第安納沙門氏菌（17.07%）、鼠傷寒沙門氏菌（14.63%）、阿貢納沙門氏菌（8.54%）、湯卜遜沙門氏菌（6.10%）、愛丁堡沙門氏菌和塞內(nèi)加爾沙門氏菌（3.66%，3.66%）等。廣西省共檢出20 種血清型，較常見的血清型為腸炎沙門氏菌（18.10%）、鼠傷寒沙門氏菌（12.38%）、湯卜遜沙門氏菌（9.52%）、印第安納沙門氏菌（7.62%）和阿貢納沙門氏菌（5.71%）等。

4 省市檢出的雞肉源沙門氏菌優(yōu)勢血清型各不相同，上海市為印第安納沙門氏菌，廣東省為鼠傷寒沙門氏菌，福建省和廣西省為腸炎沙門氏菌。德爾卑沙門氏菌在廣東省、福建省和廣西省都有不同程度的檢出，但卻未在上海市檢出。羅森沙門氏菌和杜塞爾多夫沙門氏菌在廣東省和廣西省均有檢出，卻未在上海市和福建省檢出。由此可見，沙門氏菌血清型分布具有明顯的地域性。

2.2 零售雞肉源沙門氏菌的基因型

399 株沙門氏菌中有32 株XbaⅠ酶切、PFGE分型不成功。367 株菌分型、聚類后，可被分為13大簇和219 個基因型（具體聚類結(jié)果未展示）。同一血清型的沙門氏菌分型后基本處于同一大簇或其相鄰簇中。部分同一血清型的菌株分型后DNA帶譜差異較大，聚類后分布于不同大簇，表明分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)或其基因型本身就存在明顯的多樣性。

一些源于不同地區(qū)、血清型不同的菌株P(guān)FGE分型后DNA 帶譜具有較高相似度，聚類后處于同一簇中，表明具有該基因型的菌株在不同地域流行比較廣泛，雖然血清型不同，但在自然界演化過程中可能有著較近的親源關(guān)系。

2.3 常見血清型沙門氏菌的基因型

2.3.1 腸炎沙門氏菌的基因型 65 株腸炎沙門氏菌經(jīng)XbaⅠ酶切、PFGE 分型、結(jié)果聚類后共呈現(xiàn)出38 種不同的基因型，所有菌株的基因同源性為96%。盡管這些腸炎沙門氏分離于不同時間、地點和零售雞肉樣品，但卻具有較高的基因同源性，表明這些來源各異的腸炎沙門氏菌在進(jìn)化上可能為某一克隆的沙門氏菌演變而來，也可能是采樣期間在這幾個省市零售雞肉中流行的腸炎沙門氏菌種類，表明腸炎沙門氏菌對食品造成的污染在時間和空間上具有立體性及普遍性特征。

2.3.2 印第安納沙門氏菌的基因型 54 株印第安納沙門氏菌使用XbaⅠ酶切、PFGE 分型并聚類分析后共呈現(xiàn)出34 種基因型（圖2）。所有菌株的同源性為97.5%。按98.2%的相似度可將其分為4個大簇，分別為IA、IB、IC、ID（圖2），IC 簇內(nèi)各菌株的同源性最高。菌株DNA 帶譜相似性與采樣地點、采樣時間、雞肉類型和貯存條件間沒有明顯的相關(guān)性，表明在這4 個不同省市零售雞肉中印第安納沙門氏菌的存在形式較為穩(wěn)定，克隆體間差異不大。

圖1 65 株零售雞肉源腸炎沙門氏菌PFGE 基因型和聚類結(jié)果Fig.1 Phylogeny of PFGE patterns of 65 Salmonella serovar Enteritidis isolates from chicken

圖2 54 株零售雞肉源印第安納沙門氏菌PFGE 基因型和聚類結(jié)果Fig.2 Phylogeny of PFGE patterns of 54 Salmonella serovar Indiana isolates from chicken

2.3.3 鼠傷寒沙門氏菌的基因型 58 株鼠傷寒沙門氏菌使用XbaⅠ酶切、PFGE 分型后共呈現(xiàn)出40 種不同的基因型（圖3）。所有菌株的同源性為97%。按98%的相似度可將菌株分為3 大簇，分別為TA、TB 和TC。第3 簇TC 中的菌株在4 省均有檢出，表明該基因型的菌株在零售雞肉中流行狀況較為穩(wěn)定，其克隆體間差異不大。

圖3 58 株零售雞肉源鼠傷寒沙門氏菌PFGE 基因型和聚類結(jié)果Fig.3 Phylogeny of PFGE patterns of 58 Salmonella serovar Typhimurium isolates from chicken

2.2.4 湯卜遜沙門氏菌的基因型 20 株湯卜遜沙門氏菌經(jīng)過XbaⅠ酶切、PFGE 分型后共呈現(xiàn)出18 種不同的基因型（圖4）。所有菌株的同源性為97%。按99%的相似度可將其分為5 大簇，分別為ThA、ThB、ThC、ThD 和ThE。

圖4 20 株零售雞肉源湯卜遜沙門氏菌PFGE 基因型和聚類結(jié)果Fig.4 Phylogeny of PFGE patterns of 20 Salmonella serovar Thompson isolates from chicken

2.2.5 阿貢納沙門氏菌的基因型 27 株阿貢納沙門氏菌經(jīng)過XbaⅠ酶切、PFGE 分型后共呈現(xiàn)出23 種基因型（圖5）。按98%的相似度可將其分為4 大簇，分別為AA、AB、AC 和AD。

圖5 27 株零售雞肉源阿貢納沙門氏菌PFGE 基因型和聚類結(jié)果Fig.5 Phylogeny of PFGE patterns of 27 Salmonella serovar Agona isolates from chicken

3 討論

沙門氏菌在自然界分布廣泛、血清型眾多。在美國、歐洲和中國流行的主要是腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌[21-25]。王茂起[26]2001年在我國不同省市設(shè)點采樣4 034 份，與劉雯靜[27]2011年對我國6 個地區(qū)分離到的191 株沙門氏菌及李薇薇等[28]2018年研究我國4 省份肉雞生產(chǎn)中沙門氏菌污染研究結(jié)果相同，優(yōu)勢血清型均為腸炎沙門氏菌[29-31]。本研究結(jié)果表明雞肉源沙門氏菌最常見血清型同為腸炎沙門氏菌，符合我國近年來沙門氏菌在零售雞肉中的流行規(guī)律。

各地區(qū)流行的沙門氏菌血清型和優(yōu)勢血清型不完全相同[13]。Qi 等[16]、高付敏等[32]和張慶賀[31]分別對上海市導(dǎo)致腸炎感染的主要沙門氏菌血清型、安徽省零售雞肉中沙門氏菌污染情況及其血清型研究結(jié)果均顯示腸炎沙門氏菌為主要流行血清型，表明腸炎沙門氏菌在我國零售食品中廣泛存在，且容易導(dǎo)致消費者患病。與這些研究不同的是，謝愛蓉等[33]發(fā)現(xiàn)溫州市生禽肉和生畜肉中的優(yōu)勢血清型為鼠傷寒沙門氏菌，而朱海華等[34]研究顯示河南省零售雞肉中主要為印第安納沙門氏菌。這些不同的研究也顯示出沙門氏菌在不同食品和不同地域間存在血清型差異性特征。

同一地區(qū)的流行沙門氏菌的優(yōu)勢血清型可能會隨年份發(fā)生變化，但主要流行血清型種類卻不會發(fā)生太多變化。Qi 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，上海市1998-2006年從腸胃炎患者分離的565 株沙門氏菌主要為鼠傷寒沙門氏菌（21.59%） 和腸炎沙門氏菌（16.82%），胡海贇等[35]發(fā)現(xiàn)上海市2015-2017年腹瀉病患兒中分離得到的196 株沙門氏菌仍以鼠傷寒沙門氏菌（40.3%） 為主，腸炎沙門氏菌（28.1%）次之。這與本研究從上海市零售食品中分離的沙門氏菌的主要血清型為腸炎沙門氏菌（20.73%）和鼠傷寒沙門氏菌（15.85%）結(jié)果比較吻合。

劉雪杰等[36]研究了2015-2018年福建省食源性疾病沙門氏菌感染情況，發(fā)現(xiàn)主要為鼠傷寒沙門氏菌（57.85%）和腸炎沙門氏菌（15.42%），而本研究從福建省的零售雞肉中檢出的優(yōu)勢血清型為腸炎沙門氏菌（29.27%） 和鼠傷寒沙門氏菌（14.63%）。雖然我們檢測到的零售雞肉中優(yōu)勢沙門氏菌血清型和導(dǎo)致感染的沙門氏菌血清型不完全一致，但流行型幾乎相同。孟昭赫等[21]研究發(fā)現(xiàn)廣東等4 省市零售雞肉中比較常見的血清型為腸炎沙門氏菌（20.2%）、傷寒沙門氏菌（17.3%）、印第安納沙門氏菌（15.6%）、湯卜遜沙門氏菌（10.8%）、阿貢納沙門氏菌（8.4%）和羅森沙門氏菌（3.8%），與本研究檢出的血清型結(jié)果比較一致。

雖然部分研究中采集的樣品和本研究不同，但仍在相應(yīng)的省市檢出相同或相似的沙門氏菌血清型。諸葛石養(yǎng)等[37]在廣西省農(nóng)貿(mào)市場生雞肉中檢出的沙門氏菌以德爾卑血清型為主，肉雞肛試沙門氏菌以腸炎血清型為主。鐘舒紅等[38]在廣西省零售生鮮畜禽肉中檢出的沙門氏菌主要為德爾卑（35.23%）和鼠傷寒沙門氏菌（11.93%），這些研究結(jié)果和本研究在相應(yīng)的省市采集的零售雞肉中沙門氏菌主要的血清型流行結(jié)果基本一致。

PFGE 分型過程不受菌株表型干擾，結(jié)果具有重復(fù)性好、分辨力強、易標(biāo)準(zhǔn)化、高準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，對追溯傳染源、確認(rèn)傳播鏈和發(fā)現(xiàn)新的流行菌株等方面具有重要作用[40-41]。本研究采用美國Pulse-Net 使用的PFGE 方法將399 株沙門氏菌分型后，同一血清型的菌株P(guān)FGE 分型后基本處于同一大簇，或其相鄰簇中，且各省市均未顯示出優(yōu)勢基因型的菌株。這與周正等[42]對我國食源性鼠傷寒沙門氏菌耐藥譜及PFGE 分型研究的結(jié)果，與王曉泉等[43]對分離自我國江蘇、上海、山東、陜西、河南和新疆等地的雞白痢沙門氏菌，分離自新鮮雞肉、豬肉和牛肉中的沙門氏菌及從事飲食行業(yè)人員腸道排泄物的沙門氏菌進(jìn)行FFGE 分型后所得結(jié)論均比較一致，即沙門氏菌的PFGE 基因型既表現(xiàn)出地域間的多樣性，也同時表現(xiàn)出地域內(nèi)的高度同源性。

沙門氏菌是最常見的食源性致病菌之一，每年由沙門氏菌引發(fā)病例及致死病例數(shù)呈上升趨勢[44]，開展沙門氏菌的分型研究對沙門氏菌的防控和風(fēng)險評估，保障食品安全具有重要意義[45]。