劉 揚，申雁冰，王九彬，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

雄甾–4–烯–3，17–二酮(androst-4-ene-3，17-dione，AD)是合成甾體激素類藥物的關鍵中間體，它的 9α羥基化產物9α–羥基雄甾–4–烯–3，17–二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3，17-dione，9α-OH-AD)是生產9α位上有鹵素的多種皮質激素的重要前體[1]. 能夠進行 9α–羥化的微生物有很多，目前應用較多的菌種是紅球菌(Rhodococcus sp.)和分枝桿菌(Mycobacterium sp.)．3–甾 酮 –9α–羥 化 酶 (3-ketosteroid-9α-hydroxylase，KSHAB)負責將 AD 轉化生成 9α-OHAD，由末端加氧酶(KSHA)與鐵硫還原酶(KSHB)雙組分構成．

羥化酶的加氧酶組分 KSHA在底物進出酶活性中心出口處，存在一個 loop，像一個“開關”，將底物阻擋在活性中心通道外[2]．在本課題組前期對分枝桿菌轉化植物甾醇生成AD的研究中發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum)TCCC11028的 3–甾酮–Δ1–脫氫酶靠近底物活性中心處的 loop上的 Ser138突變成性質不同的氨基酸 Leu138后，顯著影響了該酶對 AD的活性[3]．已有文獻證明柔性 loop的開關運動是調控酶催化作用的關鍵因素，比如磷酸丙糖異構酶與脂肪酶的晶體結構研究表明，柔性 loop 作為“開關”調節(jié)底物進入活性位點，進而影響酶對底物的活性[4–6]．

盡管目前有2個KSHA的蛋白晶體結構得到解析，但是KSHA的loop與酶活性之間的關系尚不清楚.本研究以已知晶體結構的紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)DSM43269的 KSHA5 loop為研究對象，應用定點突變技術探究loop對酶活性的影響，解析各氨基酸對 loop開關運動、調節(jié)底物通道的重要性，研究成果加深對 9α–羥化酶的認識有著重要意義，同時也為進一步研究其催化機理、改造酶蛋白活性提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與培養(yǎng)基

2.3.3 5-HT 3RA的應用情況 本研究中患者應用的 5-HT3RA 包括 Tro、Pal和 Ond。“指南”推薦 Tro 只在第1天靜脈應用或口服5mg。有59例（53.15%）連續(xù)多日應用Tro，療程過長。應用Pal存在的主要問題與Tro一致，有11例（9.91%）應用Pal療程過長。有4例將Pal與Tro重復應用，因藥物與受體的結合存在飽和現(xiàn)象，重復用藥并不能增強療效，反而會增大不良反應的發(fā)生率，兩藥重復應用為不合理用藥。Ond應用主要存在超致吐級別應用、給藥劑量偏小和療程不合理。Ond為短效的5-HT3RA，應用Ond的例數較Pal和Tro少。見表6。

用限制性內切酶 NcoⅠ和 HindⅢ酶切質粒，鑒定重組質粒的正確性，如圖2所示．

質粒 pGEM-T Easy購自 Promega公司，質粒pET-28a(＋)由本實驗室保存．

LB 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH 7.5．固體培養(yǎng)基在此基礎上添加2%,的瓊脂粉．

1.1.2 試劑

黑龍江省龍江電器集團有限公司成立于1996年，為中小型企業(yè)，現(xiàn)有職工370人。龍江電器集團有限公司自2002年起開始推行企務公開工作。近年來，該公司以落實“三個代表”重要思想，貫徹黨的依靠方針為指導，著力在規(guī)范、鞏固、深化、創(chuàng)新、實效上下功夫。隨著企務公開的不斷開展，企業(yè)民主管理渠道不斷拓寬，廣大職工建功立業(yè)、奉獻企業(yè)的熱情不斷高漲，該公司保持長周期安全穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展。該公司先后榮獲國家“五一勞動獎章”、省“廠務公開民主管理先進單位”、省、市“文明單位”等多項榮譽。

限制性內切酶(NcoⅠ、HindⅢ和 DpnⅠ)，NEB公司；蛋白質 Marker，北京全式金公司；TaKaRa LA TaqTMwith GC Buffer、DNA Marker，Takara 公司；KOD Plus，Toyobo公司；T4連接酶，Promega公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、基因組提取試劑盒，Omega公司；其他藥品和試劑均為分析純．

1.2 KSHA氨基酸比對與蛋白結構

KSHAB以NADH為輔酶，將來自NADH的電子最終傳遞到 O2，使底物被羥化．可以通過檢測340,nm下 NADH被氧化時吸光度的變化表征KSHA5及其各突變體的活性，摩爾吸光系數 ε采用6.22,mmol/(L·cm)．酶活力單位定義為 1,min氧化1,nmol NADH所需要的酶量．KSH測定體系為含終濃度為 105,μmol/L的 NADH 和 250,μmol/L的底物AD(溶于 100%,異丙醇)的 200,μL 酶液．測定時，先向酶標板中加入198,μL蛋白酶液(質量濃度為 60,μg/mL)和 1,μL NADH 溶液(母液濃度為 21,mmol/L)，最后加入 1,μL 的底物(母液濃度為 50,mmol/L)，啟動反應，在酶標儀上(33,℃)實時監(jiān)測反應．

KSHA5無底物的3D結構(4QDF)與有底物AD的 3D結構(4QDC)從 Protein Data Bank數據庫下載，用Discovery Studio 2.5軟件分析有無底物存在時KSHA5的結構．

1.3 表達載體的構建

根據 KSHAB的末端加氧酶 kshA5與鐵硫還原酶 kshB基因設計特異性引物，引入 NcoⅠ和 HindⅢ兩個酶切位點，kshA5的上、下游引物分別為kshA5-TF1：5′-CCATGGTGTCCATCGACACCGCACGG-3′，kshA5-T-R1：5′-AAGCTT GGGGGTCGCGGTGGAGC C-3′；kshB 的上、下游引物分別為 kshB-T-F1：5′-CCATGGTGACAGCCGTCCAGGCACC-3′，kshB-TR1：5′-AAGCTT GAACTCGATGCGCACGTGGT-3′(其中標注下劃線的堿基為添加的酶切位點)．

另外，通過不同類型的KSHA的比對，還發(fā)現(xiàn)在loop上存在兩個非常保守的氨基酸，R217與 D219，用軟件Discovery Studio 2.5分析了兩者的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們之間存在著鹽橋相互作用，這可能起到固定loop位置的作用，使loop能更貼合到底物入口處．因此，將兩者之一進行突變，把 R217變成 A217，使鹽橋作用喪失，讓loop比較松弛地靠近入口，使入口變大，考察其對活性的影響．

在4個組別溫度升高的第1天、第3天和第10天，每個組別的每個重復中隨機選擇1只雞，選擇使用數字體溫計測量肉雞直腸溫度。同時，在同一時間內，采集該重復的另1只雞迅速使其安樂死，在3 min內取出下丘腦組織放入速凍管中-80 ℃保存，20 d內測定下丘腦中熱休克蛋白70的濃度[2]。

1.4 loop上氨基酸的定點突變

以重組表達載體pET28-kshA5為模板，采用全質粒 PCR的方法進行突變子的構建，R217的上、下游突變引物分別為 TBR217A-F：5′-ACCGGTGCGGAGG ACGTCATCTCCG-3′，TBR217A-R：5′-GTCCTCCGCA CCGGTCGAGTGCAT-3′；T224的上、下游突變引物分別為 TBT224V-F：5′-TCCGGCGTGAACTACGACG ACCCCAAC-3′，TBT224V-R：5′-GTAGTTCACGCCGG AGATGACGTCC-3′；N225的上、下游突變引物分別為 TBN225L-F：5′-GGCACCCTGTACGACGACCCCA ACG-3′，TBN225L-R：5′-GTCGTACAGGGTGCCGGA GATGACG-3′；Y226的上、下游突變引物分別為TBY226F-F：5′-ACCAACTTTGACGACCCCAACGCC G-3′，TBY226F-R：5′-GTCGTCAAAGTTGGTGCCGGA GATGACG-3′；D227的上、下游突變引物分別為TBD227S-F：5′-AACTACAGCGACCCCAACGCCGAA C-3′，TBD227S-R：5′-GGGGTCGCTGTAGTTGGTGCC GGAGATG-3′；D228的上、下游突變引物分別為TBD228S-F：5′-TACGACAGCCCCAACGCCGAACTG C-3′，TBD228S-R：5′-GTTGGGGCTGTCGTAGTTGGT GCCGGAG-3′(其中斜體部分的堿基為突變位點)．PCR 反應體系(50,μL)：pET28-KSHA5 模板 1,μL，10×buffer for KOD plus 5,μL，dNTP mixture 6,μL，KOD plus 1,μL，25,mmol/L MgSO43,μL，10,μmol/L上、下游特異性引物各 2,μL，ddH2O 補齊至50,μL．反應條件：94,℃ 5,min；94,℃ 30,s，58,℃45,s，68,℃ 7,min，25 個循環(huán)；68,℃ 10,min．反應完畢后，直接向 PCR的反應體系中添加限制性內切酶DpnⅠ及其 buffer，37,℃消化模板 2,h，取 10,μL 消化液轉化到 E．coli DH5α 感受態(tài)細胞中．挑取陽性克隆，測序正確后，轉化E．coli BL21感受態(tài)細胞，得到各突變體的工程菌．

1.5 蛋白的誘導表達與純化

挑取陽性克隆單菌落接種于 5,mL含 50,μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37,℃、200,r/min過夜培養(yǎng)．取培養(yǎng)液按體積比 1∶50轉接于 50,mL含50,μg/mL 卡納霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37,℃、200,r/min培養(yǎng)，表達 KSHA5(或其突變體)蛋白的菌液培養(yǎng)至 A600＝0.4～0.6，表達 KSHB蛋白的菌液長至 A600＝0.2，加入 IPTG 至終濃度 0.5,mmol/L，30,℃、200,r/min 繼續(xù)培養(yǎng) 24,h．

分別收集含KSHA5(或其突變體蛋白)與 KSHB的重組大腸桿菌菌體，加入破碎緩沖液(50,mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，500,mmol/L NaCl，20,mmol/L 咪唑，0.1,mmol/L EDTA)徹底洗去培養(yǎng)基，再用破碎緩沖液重浮菌體，使各突變體細胞濃度保持一致．按體積比 1∶2取 KSHA5(或突變體)細胞懸浮液與KSHB細胞懸浮液，充分混勻，超聲破碎細胞17,min(功率 32%,，工作 5,s，間隔 5,s)．蛋白純化的過程參見文獻[7]．純化出的蛋白不需要透析(因為透析也會使蛋白的活性受到損失)，用 Bradford法定量總蛋白，并用軟件 Quantity One分析確定 KSHA與KSHB含量的比值，通過添加純 KSHB蛋白調整各突變蛋白與KSHB的含量比為4∶1．

1.6 蛋白活性測定

不同類型的KSHA蛋白的氨基酸序列用Clustal X比對．

2 結果與分析

2.1 蛋白分析與突變位點的選擇

首先對 R．rhodochrous DSM43269的 5個不同類型KSHA的氨基酸進行了比對，結果如圖1所示．

圖1 KSHA5的氨基酸比對及結構Fig. 1 Alignment of amino acid of KSHA5 and its structure

從圖 1(a)上可以看到，這 5種KSHA呈現(xiàn)高度相似，但loop區(qū)的氨基酸差別很大，α5螺旋、部分β折疊，以及二者之間的部分氨基酸也呈現(xiàn)很大差別，對照圖1(b)和1(c)可以看到，α5螺旋和這部分β折疊的位置與 loop距離較近，這些位置的氨基酸都位于底物進出活性中心的通道處．每種 KSHA的 loop的氨基酸不同，對應的α5螺旋和這部分 β折疊的氨基酸就不同，推測它們之間可能存在協(xié)同變化的關系；而且，loop靠近底物入口處的氨基酸 T224–D228(圖1(b)和1(c)中被橢圓形標中的loop區(qū)域)，在有無底物AD時變動非常明顯，那么它可能參與到底物的運送過程進而調控酶活，因此，本研究將對loop的這部分區(qū)域進行定點突變，分別突變成性質不同的氨基酸 T224V、N225L、Y226F、D227S與D228S，探究這些氨基酸的作用．

2.2 穿刺結果 所有病例中，28例經穿刺活檢病理結合特殊染色直接確診（見圖2），但其中2例僅提示真菌感染，未明確特異病原體，其余26例明確了感染病原體，診斷敏感度、特異度分別為：93.3%、86.7%，診斷時限為送檢后1h至1周。確診的肺真菌病分別為：肺隱球菌病19例，肺曲霉菌病4例，肺接合菌?。▋A向毛霉菌?。?例，肺馬爾尼菲藍狀菌病1例。2例未確診，1例提示肉芽腫性炎，經氟康唑治療有效，臨床診斷肺隱球菌病，另1例外科術后病理證實肺毛霉菌。

提取 R．rhodochrous DSM43269基因組作為擴增模板，擴增羥化酶 kshAB基因序列．PCR 反應體系(50,μL)：基因組模板 1,μL，2×GC BufferⅠ25,μL，2.5,mmol/L dNTPs 8,μL，LA Taq DNA 聚合酶0.5,μL，10,μmol/L 上、下游特異性引物各 2,μL，ddH2O 補齊至 50,μL．反應條件：94,℃ 5,min；94,℃30,s，60,℃ 45,s，72,℃ 2,min，30 個循環(huán)；72,℃10,min．將PCR產物進行回收純化，與pGEM-T Easy載體連接并送金唯智公司測序，測序正確后，經酶切、連接獲得表達載體 pET28-kshA5與 pET28-kshB．膠回收純化、酶切與連接等參照試劑說明書．

2.2 定點突變結果

紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)DSM43269購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)均由本實驗室保存．

圖2 重組質粒pET28-kshA5與pET28-kshB酶切電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of pET28-kshA5 and pET28-kshB treated with restriction endonuclease

突變位點和突變策略確定后，選用全質粒 PCR的方法進行基因突變，均擴增出大約7,000,bp的條帶(圖3)．經測序證明都突變成了相應的目的堿基．

兩個泳道在1,000,bp以上位置出現(xiàn)的條帶，分別與 kshA5和 kshB基因片段大小一致，證明重組質粒pET28-kshA5與pET28-kshB構建成功．

由于軌縫錯臺值主要通過第一個測點(間隙信號4)與其他3個測點比較計算得到，因此在懸浮架采集的4路間隙信號中取兩端的間隙信號4進行分析。由圖6的軌縫錯臺變化仿真圖可知，間隙信號4基本反映了軌道錯臺情況，通過錯臺值能夠準確表示高低突變。由于監(jiān)測探頭3、4之間有一定距離，因此錯臺值出現(xiàn)一段平臺。

蚌埠市農田水利建設成效明顯，為保障農業(yè)和農村經濟發(fā)展發(fā)揮了重要基礎作用。但農田水利建設基礎仍然薄弱，建設滯后、標準偏低、管理粗放的問題不同程度存在，相對滯后的農田水利設施總體上依然是農村經濟發(fā)展的制約因素，影響農業(yè)生產、農民切身利益、水資源節(jié)約和國家糧食安全。

圖3 loop的定點突變Fig. 3 Site-directed mutagenesis of the loop

2.3 酶活分析

由于KSHAB酶是由加氧酶成分KSHA與還原酶成分KSHB同時存在才能發(fā)揮羥化酶KSHAB的活性，而且已有報道證明加氧酶組分KSHA以O2為最終電子受體，在空氣中純化 KSHA組分，會使KSHA組分失去活性，還原酶組分 KSHB，除了作為KSHAB酶催化體系的關鍵組分，同時還可以為KSHA的純化提供還原性的環(huán)境，避免在有氧情況下KSHA 酶活性的丟失[7–8]．因此，本實驗采用 A 組分與 B組分共純化的方式進行蛋白純化，蛋白純化的結果如圖4所示．

圖4 蛋白純化后的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig. 4 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the purified proteins

由圖 4可知，所有蛋白均在相對分子質量 4×104以上位置處顯示兩條帶，其大小與 KSHA、KSHB組分的大小一致，證明所有蛋白均純化成功．用軟件Quantity One分析所得各純化蛋白的A組分與B組分含量的比例，使用Trace Tracking方法以及高斯建模模擬各條帶的灰度值來確定A組分與B組分含量的比例．通過添加純KSHB蛋白，使各純化蛋白的A組分與 B組分含量的比例一致，測定酶活力的結果見表1．

表1 突變體的活性分析Tab. 1 Assessment of the activity of different mutants

loop經突變后的酶的活性較突變前的都有所降低，還有一些突變甚至給酶造成了完全失活的結果．將第217位的 R 變成 A后，活性降低為原來的35%,，堿性氨基酸變化成非極性氨基酸，喪失原來與第219位D之間的鹽橋作用，使loop更加松弛地靠在活性中心處，導致 loop上靠近底物入口處的氨基酸與α5螺旋、β折疊等附近區(qū)域的相互作用減弱，推送底物進入活性中心的能力下降，可見，KSHA蛋白中該位置上的R高度保守是非常重要的．

T224側鏈帶有一個羥基，具有形成氫鍵的能力，從圖 5(a)與 5(b)上看，在結構位置上，它更靠近α5螺旋．在底物進入活性通道時，T224有可能與α5螺旋上某個氨基酸作用，能較好地打開底物通道，順利讓底物通過，而其突變成 V后，極性發(fā)生較大改變.V是非極性氨基酸，容易埋在疏水性活性中心，不利于 loop打開通道，這可能是突變后監(jiān)測不到酶活的原因．同樣，第 225位 N變?yōu)?L后，活性也大大下降，Y226F也有明顯下降．突變前兩者的氨基酸具有形成氫鍵的能力，在蛋白質結構中是位于內外部皆可的氨基酸，而突變后的非極性氨基酸更傾向于伸入疏水性活性中心，不利于打開loop這個“蓋子”，這也是 loop區(qū)該處位置在有無底物存在時發(fā)生很大變動的原因．沒有底物時，它們可以靠近活性中心，起到保護活性中心的作用；當有底物存在時，這些氨基酸又向外運動，打開活性中心，在與周圍區(qū)域的相互作用力下，給底物營造合適的環(huán)境，推送底物進入活性中心．D227(圖5(c)與5(d))和D228從結構上看，有無底物存在時，雖然它們的位置變動較大，但它們的側鏈更多地暴露在外面．D227和 D228是酸性氨基酸，可電離產生鹽橋，與溶液中離子相互作用，可能起到支撐固定loop結構的作用，讓T224–Y226能與其周圍的氨基酸產生相互作用，調節(jié)底物通道；而突變成絲氨酸后，靈活性增強，絲氨酸可轉動到活性中心處，也可暴露在外，削弱了對loop的固定作用．

圖5 loop上靠近底物進入酶活性中心入口處的氨基酸Fig. 5 Amino acids of the loop near the entrance of the substrate entering the enzyme active center

3 討 論

本文運用定點突變技術，確定了KSHA5的loop對酶活的重要性；loop上的氨基酸對穩(wěn)定 loop運動結構和調節(jié)底物通道都有著不同的作用，尤其是靠近底物入口處的氨基酸，如 T224、N225和 Y226，它們與周圍α5螺旋和β折疊存在一定相互作用，共同調節(jié)底物通道與底物運送能力；D227和D228起到支撐固定loop結構的作用．磷酸丙糖異構酶的loop上的A176就與其附近的β折疊上的Y208能產生相互作用，調節(jié) loop的開關運動[4]．分枝桿菌(M．neoaurum)TCCC11028的3–甾酮–Δ1–脫氫酶靠近底物活性中心處的loop上的Ser138能形成氫鍵，在底物AD進入活性中心后，能用氫鍵固定住 loop，保持活性中心的疏水性；而突變成 Leu后，氫鍵作用喪失，從而導致活性中心暴露，最終影響了酶對底物的活性[3]．

在信息時代的大環(huán)境下，仍有許多施工單位的建設項目在管理項目檔案時，采用傳統(tǒng)的管理辦法，在檔案資料的收集和整理過程中，單純依靠人工操作來進行管理，不僅加大了管理人員的工作量，工作效率也受到很大的影響。

由于近年投入不足和管理缺位，面廣量大的田間溝渠被填埋、損毀嚴重，農田灌溉“最后一公里”的問題非常突出，直接影響著河道治理工程的效益。要抓住全市10個縣（市、區(qū)）列入中央財政小農水重點縣的機遇，以縣為單位，以耕地灌區(qū)化為目標，將所有耕地以灌區(qū)為單元進行規(guī)劃設計、投資建設、運行管理，使之形成由可靠水源和引、輸、配水渠道及相應排水溝道組成的灌溉系統(tǒng)，形成田成方、林成網、渠相通、路相連、旱能澆、澇能排的高標準農田建設格局。

loop在蛋白質結構中的運動較為靈活，底物進出活性中心時 loop旋轉擺動的動態(tài)過程，以及在這個運動過程中 loop上各氨基酸對底物的某種相互作用，還有底物進入活性中心過程中l(wèi)oop與α5螺旋和部分β折疊的相互作用，在目前的晶體結構信息中是無法獲知的，僅用無底物或者底物在活性中心時這兩個時刻解析的晶體結構，不能準確判斷氨基酸的具體作用．而本研究運用定點突變技術揭示了 loop上氨基酸的具體作用，這將使后面的研究工作更加具有針對性．那么，在下一步工作中，我們會把工作重點放到loop的T224、N225和Y226這3個氨基酸上，并結合其附近的α5螺旋與β折疊，進行組合突變，研究三者對底物通道的調控，進而能提高酶的羥化活性．本研究成果有助于理解 9α–羥化酶及其催化機理，也為采用蛋白質工程改造 9α–羥化酶活性提供理論依據．

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