吳 濤，張 倩，劉 銳，張 民

(天津科技大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，食品生物技術(shù)教育部工程研究中心，天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457)

輻射是一種嚴重危害人體健康的有害因素，機體受到大劑量輻射會使體內(nèi)新陳代謝紊亂，誘發(fā)各種病態(tài)和損傷，如神經(jīng)衰弱綜合癥、造血機能受損、抗感染能力下降、心臟損傷、加速衰老、遺傳損傷等，嚴重時還可能誘發(fā)癌變[1–2]．因此，尋求天然有效的抗輻射防護劑對人體健康有重要意義[3]．

近年來關(guān)于抗輻射防護劑的研究較多，已發(fā)現(xiàn)的天然抗輻射活性成分有多酚類[4–5]、多糖類[6–8]、黃酮類等[9–11]，這些物質(zhì)主要在抵抗射線對健康機體的損傷[12–14]、提高腫瘤細胞對輻射的敏感性[15–16]、修復受損細胞[12，17]、消除自由基等方面起作用[18]．但是各種活性物質(zhì)抗輻射作用的效果比較研究和協(xié)同效應研究還很少，有待進一步研究．兒茶素、槲皮素和原花青素隸屬于多酚類化合物，均具有與氧自由基反應的作用，能夠截斷自由基的鏈式反應，從而具有良好的捕集自由基等抗輻射功效．基于上述原因，本文通過建立體外 AHH-1淋巴細胞輻射損傷模型，探究兒茶素、槲皮素、葡萄籽原花青素之間的協(xié)同抗輻射作用，為進一步研究開發(fā)抗輻射功能食品奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

槲皮素(98%)、葡萄籽原花青素(95%)，陜西浩洋生物科技有限公司；兒茶素(80%)，江西綠康天然產(chǎn)物有限責任公司；二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學制品有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍(MTT)，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純．

紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；NIKON TS100型相差倒置光學顯微鏡，日本尼康公司；MCO-18ATC(UV)型二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋公司；高通大容量臺式離心機、全自動酶標分析儀，美國Thermo公司．

1.2 構(gòu)建AHH-1淋巴細胞輻射損傷模型

在細胞培養(yǎng)瓶中加入 AHH-1淋巴細胞，細胞培養(yǎng)液的細胞濃度為 1×105,mL-1，培養(yǎng) 2,h后，將細胞經(jīng)137Cs-γ射線一次輻射，輻射劑量分別為0、1、2、4、6、8,Gy．并設正常對照組，輻射結(jié)束后，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24,h后，加入 5,mg/mL的 MTT溶液20,μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4,h 后，1,000,r/min 離心 5,min，吸去上清液，加入 150,μL的 DMSO，振蕩溶解，待紫色顆粒完全溶解后，用酶標儀檢測 490,nm下的吸光度(A)，按照式(1)計算細胞存活率．

1.3 兒茶素、槲皮素和原花青素對 γ射線輻射的細胞存活率的影響

將正常培養(yǎng)的細胞分為 3組：正常對照組，采用含 10%,胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；輻射組，正常培養(yǎng)細胞用 γ射線輻射但不加藥物；藥物＋輻射組，在γ射線輻射前加入不同質(zhì)量濃度酚類物質(zhì)孵育 2,h.然后經(jīng)γ射線一次輻射，輻射結(jié)束后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24,h后，1,000,r/min離心 5,min，去掉加藥的培養(yǎng)液，用PBS清洗1次，加入5,mg/mL的MTT溶液 20,μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4,h后，1,000,r/min離心 5,min，吸去上清液，加入 150,μL的 DMSO，振蕩溶解，待紫色顆粒完全溶解后，用酶標儀檢測 490,nm 下吸光度，按照式(1)計算細胞存活率及存活率提高值．

1.4 兒茶素、槲皮素和原花青素之間的作用

對于兒茶素、槲皮素和原花青素，若兩種物質(zhì)聯(lián)合作用的存活率提高值大于單獨作用的相加值，則判定兩種物質(zhì)具有協(xié)同作用；若兩種物質(zhì)聯(lián)合作用的存活率提高值小于單獨作用的相加值，則判定兩種物質(zhì)具有拮抗作用；若兩種物質(zhì)聯(lián)合作用的存活率提高值等于單獨作用的相加值，則判定兩種物質(zhì)具有相加作用．

1.4.1 槲皮素與兒茶素之間的作用

槲皮素的質(zhì)量濃度分別為 5、10、15、20,μg/mL，兒茶素的質(zhì)量濃度為 10,μg/mL，進行復合，然后進行γ射線的輻射，經(jīng) MTT測定，計算存活率，研究是否有協(xié)同作用．

1.4.2 原花青素與兒茶素之間的作用

設定原花青素的質(zhì)量濃度分別為 10、15、20、25、30,μg/mL，兒茶素的質(zhì)量濃度為 10,μg/mL，進行復合，然后進行γ射線的輻射，經(jīng)MTT測定，計算存活率，研究是否有協(xié)同作用．

1.4.3 原花青素與槲皮素之間的作用

設原花青素的質(zhì)量濃度分別為 15、20、25,μg/mL，槲皮素的質(zhì)量濃度分別為 5、10、15,μg/mL，分別進行復合，然后進行 γ射線的輻射，經(jīng)MTT測定，計算存活率，研究是否有協(xié)同作用．

1.5 統(tǒng)計分析

平行實驗6次，利用SPSS,19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析．A表示與正常組比較差異顯著(P＜0.05)，a表示與正常組比較差異極顯著(P＜0.01)，b表示與輻射組比較差異極顯著(P＜0.01)．

2 結(jié)果與討論

2.1 γ射線輻射劑量的確定

不同劑量的 γ射線對細胞存活率的影響如圖 1所示．隨著 γ射線輻射劑量的增加，細胞的存活率下降，當輻射劑量為 6,Gy時，細胞的存活率降到 45%.輻射劑量為 8,Gy時，對細胞的損傷過大，因此選取6,Gy為后續(xù)實驗的輻射劑量．

圖1 不同劑量的γ射線對細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of different gamma-ray irradiation dose on cell survival rate

2.2 原花青素、槲皮素和兒茶素對 γ射線輻射的細胞存活率的影響

原花青素對γ射線輻射的細胞存活率的影響如圖2所示．與正常組比較，輻射組的細胞存活率有極顯著性差異(P＜0.01)，原花青素各個劑量組，與輻射組比較均有極顯著差異(P＜0.01)．其中，在200,μg/mL劑量時，與正常組比較，存活率無顯著性差異，說明此劑量的原花青素使細胞的存活率達到了正常水平.

圖2 原花青素對γ射線輻射的細胞存活率的影響Fig. 2 Effect of procyanidins on cell survival rate after gamma-ray irradiation

槲皮素對γ射線輻射的細胞存活率的影響如圖3所示．

圖3 槲皮素對γ射線輻射的細胞存活率的影響Fig. 3 Effect of quercetin on cell survival rate after gamma-ray irradiation

槲皮素 5、10,μg/mL劑量組與正常組比較，細胞存活率有極顯著性差異(P＜0.01)；槲皮素各個劑量組與輻射組比較，細胞存活率均有極顯著升高(P＜0.01)．

兒茶素對γ射線輻射的細胞存活率的影響如圖4所示．兒茶素各劑量組與正常組比較，細胞存活率有極顯著性差異(P＜0.01)；兒茶素各劑量組與輻射組相比，細胞存活率顯著升高(P＜0.01)．

圖4 兒茶素對γ射線輻射的細胞存活率的影響Fig. 4 Effect of catechin on cell survival rate after gamma-ray irradiation

2.3 槲皮素、兒茶素和原花青素之間的作用

2.3.1 槲皮素與兒茶素之間的作用

槲皮素與兒茶素聯(lián)合作用的結(jié)果見表 1．由表 1可知，當兒茶素質(zhì)量濃度為 10,μg/mL，槲皮素質(zhì)量濃度為5,μg/mL時，兩物質(zhì)聯(lián)合作用的存活率提高值大于兩物質(zhì)單獨作用的相加值，說明兩物質(zhì)具有協(xié)同作用．隨著槲皮素濃度的增加，兩物質(zhì)的作用類型由相加變?yōu)檗卓梗?/p>

表1 槲皮素與兒茶素聯(lián)合作用的結(jié)果Tab. 1 Joint effect of quercetin and catechin

2.3.2 原花青素與兒茶素之間的作用

原花青素與兒茶素聯(lián)合作用的結(jié)果見表 2．當兒茶素質(zhì)量濃度為 10,μg/mL時，原花青素質(zhì)量濃度為15、25、30,μg/mL 時，兩物質(zhì)聯(lián)合作用的存活率提高值大于兩單獨作用的相加值，具有協(xié)同作用；當原花青素質(zhì)量濃度為10、20,μg/mL時，兩物質(zhì)聯(lián)合作用的存活率低于兩物質(zhì)單獨作用相加值，具有拮抗作用．

表2 原花青素與兒茶素聯(lián)合作用的結(jié)果Tab. 2 Joint effect of procyanidins and catechin

2.3.3 原花青素與槲皮素之間的作用

原花青素與槲皮素聯(lián)合作用的結(jié)果見表 3．在槲皮素質(zhì)量濃度為 5,μg/mL和原花青素質(zhì)量濃度為25,μg/mL時，槲皮素質(zhì)量濃度為 10,μg/mL和原花青素質(zhì)量濃度為 20、25,μg/mL時，兩物質(zhì)聯(lián)合作用的存活率提高值皆大于兩物質(zhì)單獨作用的相加值，具有協(xié)同作用．

表3 原花青素與槲皮素聯(lián)合作用的結(jié)果Tab. 3 Joint effect of procyanidins and quercetin

2.4 討論

酚類物質(zhì)的多元酚羥基均具有與氧自由基反應的作用，截斷自由基的鏈式反應，從而具有良好的捕集自由基等抗輻射功效．孫維琦等[9]研究表明，大豆異黃酮能提高受輻射小鼠的抗氧化能力，在一定程度上減緩由輻射引起的外周血白細胞和骨髓有核細胞數(shù)的下降，減少微核的產(chǎn)生，對 γ射線損傷具有良好的防護作用．大豆異黃酮抗輻射損傷的機理主要是抗氧化作用、抑制膜的脂質(zhì)過氧化、抑制細胞凋亡的發(fā)生、調(diào)節(jié)細胞基因表達這幾個方面[19]．李德遠等[20]研究證明銀杏葉黃酮能顯著提高輻射小鼠的存活率和平均存活時間，低劑量銀杏葉黃酮具有較強的抗輻射作用，其作用機理與提高小鼠免疫力有關(guān). Benkovic等[11]研究抗輻射損傷作用時發(fā)現(xiàn)，槲皮素及蜂膠提取物對輻射小鼠白細胞具有激活效應且對其DNA的損傷具有保護作用．Srinivasan等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素對輻射所致小鼠肝細胞 DNA的損害具有防護作用．吳健全等[10]報道染料木黃酮可以延長受照射小鼠存活時間，提高 30,d活存率，升高血小板、淋巴細胞和脾結(jié)節(jié)數(shù)，降低骨髓嗜多染紅細胞微核率，對小鼠有輻射防護作用．因此兒茶素、槲皮素和原花青素可能通過提高受輻照細胞的抗氧化能力、減少DNA的損傷達到協(xié)同抗輻射作用．

3 結(jié) 語

通過建立體外 AHH-1淋巴細胞輻射損傷模型，研究兒茶素、槲皮素和原花青素之間的協(xié)同抗輻射作用．結(jié)果表明：當兒茶素質(zhì)量濃度為 10,μg/mL和槲皮素質(zhì)量濃度為 5,μg/mL時，兒茶素質(zhì)量濃度為10,μg/mL 和原花青素質(zhì)量濃度為 15、25、30,μg/mL時，槲皮素質(zhì)量濃度為5,μg/mL和原花青素質(zhì)量濃度為25,μg/mL時，槲皮素質(zhì)量濃度為10,μg/mL和原花青素質(zhì)量濃度為 20、25,μg/mL時，兩物質(zhì)間皆具有協(xié)同抗輻射作用．當兒茶素質(zhì)量濃度為 10,μg/mL時，槲皮素質(zhì)量濃度為 15、20,μg/mL以及原花青素質(zhì)量濃度為 10、20,μg/mL時，兒茶素分別與槲皮素、原花青素存在拮抗作用．當槲皮素質(zhì)量濃度為5,μg/mL 和原花青素質(zhì)量濃度為 20,μg/mL 時，當槲皮素質(zhì)量濃度為 10,μg/mL和原花青素質(zhì)量濃度為15,μg/mL時，當槲皮素質(zhì)量濃度為 15,μg/mL和原花青素質(zhì)量濃度為 15、20、25,μg/mL時，原花青素與槲皮素皆存在拮抗作用．因此，在適量濃度范圍內(nèi)兒茶素、槲皮素和原花青素之間具有協(xié)同或拮抗抗輻射作用，這一研究發(fā)現(xiàn)對開發(fā)抗輻射功能食品具有指導意義．

［1］ Simmons J H W. Radiation Damage in Graphite[M]Oxford：Pergamon Press，1965：243.

［2］ 高月，馬增春. 輻射損傷防治藥物發(fā)展歷史與展望[J].輻射防護通訊，2009，29(5)：30-35.

［3］ Wang Q，Han T，Sun L，et al. Progress on anti-radiation natural medicines[J]. Journal of Pharmaceutical Practice，2012，5：171-177.

［4］ Bao L，Zhang Z，Dai X，et al. Effects of grape seed proanthocyanidin extract on renal injury in type 2 diabetic rats[J]. Molecular Medicine Reports，2015，11(1)：645-652.

［5］ Duan Y，Chen F，Yao X，et al. Protective effect of Lycium ruthenicum Murr. against radiation injury in mice[J]. International Journal of Environmental Research &Public Health，2015，12(7)：8332-8347.

［6］ Jiang S，Shen X，Liu Y，et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721，rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice[J]. Journal of Radiation Research，2015，56(3)：515-522.

［7］ Luo Q，Li J，Cui X，et al. The effect of Lycium barbarum polysaccharides on the male rats’ reproductive system and spermatogenic cell apoptosis exposed to low-dose ionizing irradiation[J]. Journal of Ethnopharmacology，2014，154(1)：249-258.

［8］ 王楠，張民，李茜，等. 裸燕麥多糖酶解產(chǎn)物 OP-1 純化組分結(jié)構(gòu)分析[J]. 天津科技大學學報，2016，31(1)：8-12.

［9］ 孫維琦，郭英，張義全，等. 大豆異黃酮與大豆皂甙抗輻射作用的實驗研究[J]. 中國輻射衛(wèi)生，2007，16(3)：273-274.

［10］ 吳健全，金宏，許志勤，等. 染料木黃酮抗輻射作用的實驗研究[J]. 中國輻射衛(wèi)生，2004，13(3)：170-172.

［11］ Benkovic V，Knezevic A H，Dikic D，et al. Radioprotective effects of propolis and quercetin in γ-irradiated mice evaluated by the alkaline comet assay[J].Phytomedicine International Journal of Phytotherapy &Phytopharmacology，2008，15(10)：851-858.

［12］ Oyagbemi A A，Omobowale T O，Akinrinde A S，et al.Lack of reversal of oxidative damage in renal tissues of lead acetate-treated rats[J]. Environmental Toxicology，2015，30(11)：1235-1243.

［13］ Ma B，Zhu L，Zang X，et al. Coptis chinensis inflorescence and its main alkaloids protect against ultraviolet-B-induced oxidative damage[J]. Journal of Functional Foods，2013，5(4)：1665-1672.

［14］ Rodríguez-Pérez C，Quirantes-Piné R，Contreras M M，et al. Assessment of the stability of proanthocyanidins and other phenolic compounds in cranberry syrup after gamma-irradiation treatment and during storage[J]. Food Chemistry，2015，174：392-399.

［15］ Wang L，Li X，Wang Z. Whole body radioprotective effect of phenolic extracts from the fruits of Malus baccata(Linn.)Borkh[J]. Food & Function，2016，7(2)：975-981.

［16］ 張英，吳聰俊. 生物黃酮作為天然輻射防護劑的研究進展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27(3)：552-557.

［17］ 王麗，王振宇，張浩，等. 天然化合物的電離輻射防護作用研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33(16)：372-376.

［18］ Zhao L，Wang Y，Wang Y，et al. Advances in research on radioprotective effects of natural active components[J]. Pharmaceutical Care and Research，2012，12(2)：86-89.

［19］ Dixit A K，Bhatnagar D，Kumar V，et al. Antioxidant potential and radioprotective effect of soy isoflavone against gamma irradiation induced oxidative stress[J].Journal of Functional Foods，2012，4(1)：197-206.

［20］ 李德遠，周韞珍，余應利，等. 銀杏葉黃酮抗輻射效應研究[J]. 營養(yǎng)學報，2004，26(3)：220-222.

［21］ Srinivasan M，Prasad N R，Menon V P. Protective effect of curcumin on γ-radiation induced DNA damage and lipid peroxidation in cultured human lymphocytes[J].Mutation Research，2006，611(1/2)：96-103.