李 瑋，董自星，李普均，金 鵬，劉曉光，路福平，王正祥

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 天津科技大學化工與材料學院，天津 300457)

功能性低聚糖是一類由 2～10個單糖通過α–1，6糖苷鍵結(jié)合成的直鏈或支鏈的低聚合度糖類[1]，主要包括低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、異麥芽酮糖和低聚龍膽糖等[2].其中低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharides，IMO)主要存在于大米、醬油、日本清酒以及蜂蜜中[3]，它是一種良好的益生元，并可選擇性地刺激腸道益生菌的生長與繁殖，不會打破腸道菌群平衡，有利于宿主機體健康[4]．

近年來，隨著對低聚異麥芽糖研究的不斷深入，無論在科研還是食品工業(yè)與醫(yī)藥等領(lǐng)域，都需要利用其中起到主要生理活性的關(guān)鍵組分(潘糖)的標準品，才能對其進行精確分析與研究．目前，對于功能性低聚糖中的關(guān)鍵組分的制備方法有層析法、膜分離法等．盡管層析法的分離效果好，但是需要使用有機溶劑，生產(chǎn)成本高，缺乏市場競爭力[5]．而膜分離法的收率較高，但只可對底物進行逐級分離，無法對特定的單組分進行選擇性地分離，且步驟較為繁瑣[6]．

二級標準物質(zhì)為特性量值通過與一級標準物質(zhì)直接比對或用其他準確可靠的分析方法測試而獲得，準確度和均勻性能滿足一般測量的需要，穩(wěn)定性在半年以上的標準物質(zhì)[7–8]．由于潘糖的標準品在國內(nèi)市面不易購買，且從國外訂購的價格昂貴，在很大程度上限制了低聚異麥芽糖的相關(guān)研究與應(yīng)用．本實驗以低聚異麥芽糖粗糖液為研究對象，通過高效液相色譜法對功能性關(guān)鍵組分(潘糖)進行分離與純化，最終制得高品質(zhì)的潘糖標準品，為低聚異麥芽糖的相關(guān)研究與應(yīng)用提供了基礎(chǔ)材料．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

低聚異麥芽糖粗糖液由實驗室前期制備獲得，其中潘糖含量為47.6,g/L．

1.1.2 試劑與儀器

葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖標準品，北京索萊寶科技有限公司；麥芽三糖、潘糖和異麥芽三糖等標準品，美國 Supelco公司；乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純．

1260,series型蒸發(fā)光液相色譜儀、1200,series型示差液相色譜儀，美國 Agilent精密儀器有限公司；PrevailTMCaborhydrate ES 5u分析柱(250,mm×4.6,mm)，美國GRACE精密儀器有限公司．

1.2 低聚異麥芽糖組分的定性分析

1.2.1 樣品處理

稱取 25,g低聚異麥芽糖粗糖液，加水稀釋并定容至 250,mL，配制成 100,mg/mL低聚異麥芽糖溶液作為母液，稀釋50倍后得到2,mg/mL溶液，待用．

1.2.2 低聚異麥芽糖混合標準品的配制

準確稱取葡萄糖、麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖、潘糖和異麥芽三糖各 4,mg置于 4,mL梯形容量瓶中，并分別加水定容，配制成 1,mg/mL的 6種母液．再分別從每種母液中吸取 150,μL至 1.5,mL EP管中，混勻，制成總質(zhì)量濃度為1,mg/mL的低聚異麥芽糖混合標準品待用．

1.2.3 低聚異麥芽糖樣品中組分的分析

采用高效液相色譜–蒸發(fā)光散射檢測法對低聚異麥芽糖樣品中的組分進行定性分析，以確定各組分的出峰時間及出峰順序．色譜條件：流動相為體積分數(shù)70%,乙腈水溶液，流量1,mL/min，柱溫30,℃，蒸發(fā)光液相檢測器溫度 90,℃，氣體流量 2.2,L/min，使用GRACE Prevail ES 5u分析柱(250,mm×4.6,mm)進行分析，進樣量為10,μL(自動進樣)．

1.3 潘糖的分離純化

1.3.1 分離樣品濃度的確定

將 1.2.1節(jié)中的 100,mg/mL樣品溶液分別稀釋至 30、50、80,mg/mL，采用可回收廢液的高效液相色譜–示差折光檢測法對樣品中的關(guān)鍵組分潘糖進行分離純化，通過峰形判斷出達到最佳分離效果的樣品濃度．色譜條件：流動相為體積分數(shù) 70%,乙腈水溶液，流量 1,mL/min，柱溫 30,℃，檢測器溫度 35,℃，使用GRACE Prevail ES 5u分析柱(250,mm×4.6,mm)進行分析與分離，進樣量為100,μL(自動進樣)．

1.3.2 潘糖的制備

在上述研究基礎(chǔ)上，根據(jù)潘糖在高效液相色譜–示差折光檢測法中的峰形及出峰時間，在保證所得潘糖的純度最高的條件下，對潘糖進行收集，并通過高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法對所得的每個潘糖流分進行分析鑒定，按照式(1)計算潘糖流分的純度，按照式(2)和式(3)計算其平均純度以及最終得率．

式中：E為潘糖得率，%,；m為收集的所有流分凍干后的平均干質(zhì)量，mg；P為 5次實驗的潘糖平均純度，%,；ρ為IMO粗糖液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為進樣量，mL；N為進樣次數(shù)．

1.4 精密度實驗[9]

從所收集的混合潘糖流分中取 5份樣品，每份1,mL．在相同條件下，按照 1.2.3節(jié)的方法采用蒸發(fā)光散射檢測器對樣品進行檢測，并計算潘糖峰面積比的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)．

1.5 重復(fù)性實驗

從所收集的潘糖流分中取 1,mL，并制成液相樣品．采用 1.2.3節(jié)中高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法對潘糖流分連續(xù)進樣5次，并在同樣條件下進行檢測，根據(jù)峰面積的比例計算其RSD值．

1.6 回收率實驗

將潘糖流分每連續(xù)收集 50,mL 記為 1組，共收集 5組，每組各取樣 0.75,mL，然后將其分別與 5份0.25,mL、1,mg/mL的葡萄糖標準品溶液混合，使葡萄糖標準品在混合溶液中的終質(zhì)量濃度為 0.25,mg/mL.采用高效液相色譜–蒸發(fā)光散射檢測法對該樣品進行分析，并通過葡萄糖與潘糖在液相圖譜中峰面積的關(guān)系以及已知的葡萄糖濃度，計算其中潘糖含量的理論值(mg)．將其余潘糖流分中的乙腈揮干后凍干，稱取所得潘糖的干質(zhì)量(mg)，并計算回收率、平均回收率及其RSD值．

1.7 穩(wěn)定性檢驗

隨機抽取 60個樣本(每個樣本為 0.25,mg潘糖固體粉末)于 2～8,℃放置 12個月，每月抽取 5個樣品，每個樣本檢測 2次，與初始數(shù)據(jù)進行比較，評價其在冷藏(2～8,℃)保存條件下的穩(wěn)定性．對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義．

2 結(jié)果與討論

2.1 蒸發(fā)光散射檢測法定性分析樣品中的組分

采用蒸發(fā)光散射檢測法對 2,mg/mL的低聚異麥芽糖溶液中的組分進行分析，結(jié)果如圖1所示．

由于色譜柱為正相柱，低聚異麥芽糖產(chǎn)品中各組分按標準品圖譜中的出峰時間從左至右依次為麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖、潘糖和異麥芽三糖，標準品和樣品中的潘糖出峰時間分別為 15.958,min和16.092,min，這為后續(xù)通過示差折光檢測法對潘糖組分進行分離純化提供了依據(jù)．

圖1 蒸發(fā)光散射檢測法分析2,mg/mL低聚異麥芽糖產(chǎn)品組分的液相圖譜Fig. 1 The liquid chromatogram of 2,mg/mL IMO analyzed by HPLC-ELSD

2.2 關(guān)鍵組分潘糖的分離

根據(jù)高效液相色譜–蒸發(fā)光散射檢測法中潘糖的出峰順序和出峰時間，采用高效液相色譜-示差折光檢測法分別對 3種不同濃度的低聚異麥芽糖產(chǎn)品中的潘糖進行分離純化，以確定最佳分離濃度，其結(jié)果如圖2所示．

圖2 樣品濃度對低聚異麥芽糖中潘糖的分離效果的影響Fig. 2 Effects of concentration on the separation of panose from IMO samples

由潘糖與麥芽三糖、異麥芽三糖之間的分離度可 知，當樣品質(zhì)量濃度為 80,mg/mL時，潘糖與麥芽三糖和異麥芽三糖的分離效果最差．樣品質(zhì)量濃度為30,mg/mL時，潘糖的分離效果較好．而當 IMO溶液的質(zhì)量濃度為 50,mg/mL時，潘糖與麥芽三糖和異麥芽三糖的分離效果最好(圖 2(b))．此外，在該濃度下，通過示差折光檢測法對潘糖進行分離純化時，潘糖的出峰時間為14.564,min．

在保證得率最大的前提下，從潘糖出峰開始對潘糖組分進行收集直到出峰結(jié)束，通過蒸發(fā)光散射檢測法對其鑒定，結(jié)果如圖 3(a)所示．根據(jù)峰面積的比例可知，潘糖的純度為 69.36%,，得率為 34.68%,．應(yīng)繼續(xù)進行潘糖收集方法的優(yōu)化．

圖3 蒸發(fā)光散射檢測法分析純化得到的潘糖流分Fig. 3 Analysis of the purified panose using HPLC-RID

由于樣品隨流動相經(jīng)過檢測器對于流分收集會有時間上的延遲，所以按全峰所收集的流分中潘糖純度較低，增加了分離純化的難度，故將收集的時間縮短，增加收集次數(shù)(共收集 8次)．為了保證所收集的潘糖的純度最大，從峰頂收集至峰尾，并將所得潘糖流分經(jīng)過蒸發(fā)光散射檢測法進行鑒定，確定其純度，結(jié)果如圖3(b)所示．所收集的潘糖流分中，除大部分為潘糖外，還有少部分麥芽三糖雜質(zhì)．根據(jù)峰面積的比例關(guān)系可知潘糖的純度為98.43%，得率為49.22%.且潘糖的出峰時間為16.053,min，與圖1(a)中潘糖標準品的出峰時間(15.958,min)的差值的比值為0.6%,，小于 5%,，可以確定此收集方法所得的流分為潘糖．經(jīng)過多次實驗，所分離得到的潘糖純品的純度為(98.43±0.25)%,，略高于阿拉丁試劑和梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司等銷售的潘糖(CAS號：33401-87-5)的純度(98%)．

2.3 精密度實驗

為了驗證所得潘糖流分純度的穩(wěn)定性，在相同條件下，采用蒸發(fā)光散射檢測法對5份潘糖樣品進行檢測．5份樣品的峰面積及其百分比見表 1．通過計算可知，其RSD為 0.25%,，符合 2015年版中華人民共和國藥典(精密度實驗中 RSD 應(yīng)小于 3.0%,)的相關(guān)規(guī)定[10]，精密度較好．

表1 精密度實驗的結(jié)果Tab. 1 Results of precision experiment

2.4 重復(fù)性實驗

重復(fù)性實驗的結(jié)果見表 2，計算獲得 RSD為0.27%，符合 2015年版中華人民共和國藥典(HPLC系統(tǒng)適用性要求中連續(xù)進樣5次峰面積 RSD應(yīng)小于2.0%)的規(guī)定[10]，重復(fù)性較好．

表2 重復(fù)性實驗的結(jié)果Tab. 2 Results of repetitive experiment

2.5 回收率實驗

對所制備5組潘糖流分的回收率進行測定，結(jié)果見表3．最終算得潘糖的平均回收率為(96.20±0.73)%，RSD為0.73%,，符合2015年版中華人民共和國藥典中關(guān)于回收率的RSD應(yīng)小于1%,的要求[10]．

表3 回收率實驗的結(jié)果Tab. 3 Results of recovery ratio experiment

2.6 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

在2～8,℃保存12個月的不同時間點，每次抽取5個潘糖樣本，每個樣本檢測 2次，評價其穩(wěn)定性．穩(wěn)定性檢驗的結(jié)果表明，潘糖在 2～8,℃可穩(wěn)定至少12個月(圖 4，P＞0.05)．

圖4 潘糖的穩(wěn)定性檢驗Fig. 4 Evaluation of the stability of panose

隨著人們對功能性低聚糖的開發(fā)與應(yīng)用有了更深層次、更高精確度的需求，功能性低聚糖中關(guān)鍵組分的分離與純化，無疑是低聚糖檢測最關(guān)鍵的部分[11].本文通過示差折光檢測法對低聚異麥芽糖中的關(guān)鍵組分潘糖進行了分離純化，實現(xiàn)了潘糖標準品的制備．與于德水等[12]使用的結(jié)晶法相比，本方法具有周期短、簡便易行、精確性好、靈敏度高以及樣品耗費低等優(yōu)點．并且所得關(guān)鍵組分的純品亦可有針對性地運用到食品和保健品行業(yè)[13]．此外，潘糖單組分的純度與均勻性可滿足一般測量的需要，這符合我國標準物質(zhì)管理委員會關(guān)于二級標準物質(zhì)的規(guī)定[7]．

3 結(jié) 論

本文通過蒸發(fā)光散射檢測法對低聚異麥芽糖樣品中的組分進行了初步的定性分析，接著利用示差折光檢測法對潘糖進行了分離純化，實現(xiàn)了低聚異麥芽糖中潘糖組分標準品的制備．所分離得到的潘糖純品的純度為(98.43±0.25)%,；精密度實驗和重復(fù)性實驗中的 RSD 分別為 0.25%,和 0.27%,；平均回收率為(96.20±0.73)%,；并且在 2～8,℃可穩(wěn)定保存至少 12個月，符合 2015年版中華人民共和國藥典以及國家標準物質(zhì)管理委員會關(guān)于二級標準物質(zhì)的規(guī)定．因此，本研究中所制得的潘糖組分可作為二級標準品使用，也為低聚異麥芽糖的進一步開發(fā)和功能性探索奠定了基礎(chǔ)．

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